豬流行性腹瀉病毒S蛋白多表位抗原免疫原性分析

李 麗,唐 奇,馬躍宇,張溪妍,費(fèi)東亮,王書全 （錦州醫(yī)科大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧 錦州 121001）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病,主要臨床特征表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉,是目前危害養(yǎng)豬業(yè)較為嚴(yán)重的腹瀉性疾病之一,10日齡以內(nèi)哺乳仔豬的病死率可高達(dá)100%。由于PEDV具有較強(qiáng)的變異性,疫苗的保護(hù)效果不佳,但目前疫苗接種仍是預(yù)防該病的主要手段[1]。

PEDV屬于冠狀病毒科、甲型冠狀病毒屬,為線性單股RNA病毒,其基因組長約28 kb,編碼復(fù)制酶（Rep）、纖突糖蛋白（S）、基質(zhì)蛋白（M）、囊膜蛋白（E）、核蛋白（N）和ORF3等6個基因。研究顯示,S蛋白含有PEDV主要的抗原中和表位,包括COE（499～638 aa）、SS2（748～755 aa）、SS6（764～771 aa）、2C10（1 368～1 374 aa）[2],其中COE是其最重要的一段核心功能區(qū)域,且具有良好免疫原性。因此,S蛋白基因用于開發(fā)PEDV亞單位疫苗展現(xiàn)了良好的前景和潛力。此外,金黃色葡萄球菌腸毒素A（staphylococcal enterotoxin,SEA）是一種具有超抗原功能的外毒素,具有主要組織相容性復(fù)合體（MHC）結(jié)合的非限制性,能夠激活刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性T細(xì)胞,調(diào)節(jié)NK細(xì)胞以及刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TFN-α和活化Thl細(xì)胞等功效,可以用作免疫輔助佐劑或調(diào)節(jié)劑[3]。通過對國內(nèi)豬流性行腹瀉病毒S蛋白氨基酸序列的多重比對結(jié)果發(fā)現(xiàn),其抗原表位2C10（1368GPRLQPY1374）在經(jīng)典CV777毒株、減毒CV777毒株及其他中國分離毒株中均保守,表位SS2（748YSNIGVCK755）在除CH/HLJHG/2011外大部分中國分離毒株中也均保守[4]。因此,本試驗(yàn)嘗試將PEDV S基因中編碼抗原表位2C10（1368GPRLQPY1374）、SS2（748YSNIGVCK755）和SS6（764SQYGQVKI771和764LQDGQVKI771）基因區(qū)段與經(jīng)典毒株S基因通過柔性連接肽（GGGGS）進(jìn)行連接,并與SEA基因串聯(lián),分別構(gòu)建p ET-28a-S、p ET-28a-S-SEA及p ET-28a-S-EP-SEA重組質(zhì)粒,通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白,研究其免疫原性,為進(jìn)一步研制多表位亞單位疫苗提供幫助。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物BALB/c小鼠,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司（SCXK（京）2016-0011）。

1.2主要試劑與儀器豬流行性腹瀉高免血清由遼寧益康生物股份有限公司舒秀偉研究員惠贈；原核表達(dá)載體p ET-28a（＋）,購于江蘇泓訊生物科技有限公司；IFN-γ、IL-2和IL-4試劑盒購于深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；豬流行性腹瀉病毒S蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒購于上海奧陸生物科技有限公司；PEDV弱毒疫苗（20190623）購于華派生物工程集團(tuán)有限公司；載體和試劑分別購自北京全式金生物技術(shù)有限公司和大連寶生物公司。高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司）；全自動凝膠成像系統(tǒng)（中國Tanon公司）；臺式低速離心機(jī)（美國Sigma公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（美國BOI-Rad公司）；PCR儀（英國HYBAID公司）；低溫連接儀（中國Tanon公司）；Eppendorf蛋白核酸分析儀（德國Eppendorf公司）。

1.3多表位基因串聯(lián)設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)報道PEDV S蛋白抗原表位（EP）:2C10（1368GPRLQPY1374）、SS2（748YSNIGVCK755）、SS6（764SQYGQVKI771及764LQDGQVKI771）,分別設(shè)計(jì)S-EP-SEA和S-SEA融合基因,并通過柔性連接肽連接金黃色葡萄球菌腸毒素A基因（SEA）并在2個串聯(lián)基因上下游分別設(shè)置NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)及Bm HⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。

1.4基因密碼子優(yōu)化、合成及重組質(zhì)粒pET-28a-SEP-SEA、p ET-28a-S-SEA的構(gòu)建通過在線密碼子優(yōu)化網(wǎng)站（http://www.jcat.de/）,根據(jù)S-EP-SEA和S-SEA基因中對大腸桿菌偏嗜性較差密碼子進(jìn)行優(yōu)化,由江蘇泓訊生物科技有限公司進(jìn)行合成,并將其克隆至原核表達(dá)載體p ET-28a（＋）中,獲得p ET-28a-S-EP-SEA和p ET-28a-S-SEA重組質(zhì)粒。

1.5重組質(zhì)粒pET-28a-S的構(gòu)建為獲得S基因,設(shè)計(jì)1對特異性引物在其上、下游引物中分別加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。以p ET-28a-S-EP-SEA重組質(zhì)粒作為PCR模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min；94℃變性45 s,57℃退火45 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán)；72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物回收后,插入至原核表達(dá)載體p ET-28a。經(jīng)酶切和測序鑒定正確后,獲得表達(dá)S蛋白的重組質(zhì)粒p ET-28a-S。

1.6重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)與條件優(yōu)化取10 m L含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基,將1 m L新鮮細(xì)菌溶液接種到該培養(yǎng)基中,在37℃振蕩器中以200 r/min振蕩,將D值調(diào)節(jié)至0.6～0.8,并添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá),繼續(xù)振蕩培養(yǎng)數(shù)小時（初步誘導(dǎo)表達(dá)條件:IPTG 0.1 mmol/L,28℃,振蕩6 h）。取出后,8 000 r/min離心3 min收集細(xì)菌,并添加300μL的PBS溶液溶解細(xì)菌。然后將細(xì)菌超聲處理,并以12 000 r/min離心5 min,分離上清與沉淀,然后進(jìn)行SDSPAGE蛋白電泳。

將目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,分別設(shè)置IPTG終濃度梯度（0.10,0.25,0.50 mmol/L）、誘導(dǎo)時間梯度（1～6 h）和誘導(dǎo)溫度梯度（25,28,32,35,37,42℃）,將梯度表達(dá)產(chǎn)物,通過SDS-PAGE分析,確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件,同時設(shè)置p ET-28a載體為陰性對照。

1.7表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western blot分析收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體,PBS洗滌3次后,冰浴條件下超聲波破碎,然后通過Ni-NTA親和層析柱純化,最終獲得可溶性的重組蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定重組蛋白濃度,蛋白于—80℃保存。將純化后的重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳后,通過半干轉(zhuǎn)印儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用2%BSA封閉4 h。然后,分別利用His標(biāo)簽單克隆抗體和PEDV陽性血清作為一抗,相應(yīng)的山羊抗小鼠IgG和兔抗豬Ig G作為二抗,分別先后與PEDF膜雜交,最后ECL顯色液顯色,觀察結(jié)果。

1.8重組蛋白免疫原性分析將25只BALB/c小鼠隨機(jī)隨機(jī)均分為5組,每組5只,分別為對照組（PBS）、S蛋白組、S-SEA蛋白組、S-EP-SEA蛋白組和PEDV弱毒疫苗組。經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射,抗原量為100μg/只,首次接種后進(jìn)行加強(qiáng)免疫,間隔14 d,加強(qiáng)免疫時各組蛋白、PBS及PEDV弱毒疫苗應(yīng)與弗氏不完全佐劑乳化,抗原量為150μg/只。一免、二免后各組小鼠尾尖采血,三免后14 d眼球采血,均分離血清于—20℃保存。利用試劑盒檢測特異性IgG抗體水平；取第3次免疫后血清,使用PBS稀釋10倍后,使用細(xì)胞因子檢測試劑盒進(jìn)行IFN-γ、IL-2及IL-4的檢測。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本試驗(yàn)中小鼠血清中特異性IgG水平及細(xì)胞因子FN-γ、IL-2及IL-4含量檢測所得數(shù)據(jù)均采用Graph Pad Prism 5.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,樣本間顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1多表位基因密碼子優(yōu)化結(jié)果利用在線密碼子優(yōu)化生物學(xué) 軟件（http://www.jcat.de/）對SSEA基因、S-EP-SEA基因的密碼子進(jìn)行在線優(yōu)化,優(yōu)化在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中具有較差偏嗜性的堿基,同時優(yōu)化A/T或G/C重復(fù)序列的堿基,密碼子相對適應(yīng)性得到顯著升高,密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）由原來的0.22增長至1.0。

2.2重組質(zhì)粒構(gòu)建與酶切結(jié)果以p ET-28a-S-EPSEA質(zhì)粒為模板,經(jīng)過PCR擴(kuò)增,得到約為420 bp的條帶,堿基大小與理論相符合（圖1A）。對3個重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切鑒定,在1 132,1 143,420 bp處有清晰條帶（圖1 B,C,D）。然后,將重組質(zhì)粒質(zhì)粒pET-28a-S送至天津金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序,與ET-28a-S-EP-SEA質(zhì)粒S區(qū)段同源性100%,結(jié)果表明重組pET-28a-S質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

2.3重組蛋白SDS-PAGE及Western blot分析結(jié)果重組質(zhì)粒p ET-28a-S、p ET-28a-S-SEA和p ET-28a-S-EP-SEA分別轉(zhuǎn)入BL21宿主菌后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,進(jìn)行含SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示,分別出現(xiàn)蛋白相對分子質(zhì)量為21,48,54 k Da的條帶,與理論大小基本相符（圖2～4）。此外,p ET-28a-SEP-SEA質(zhì)粒最佳表達(dá)條件:溫度為37℃；IPTG濃度為0.5 mmol/L；時間為6 h（圖2）；p ET-28a-SSEA和p ET-28a-S質(zhì)粒的最佳表達(dá)條件均為:溫度為28℃；IPTG濃度為0.5 mmol/L；時間為6 h（圖3,4）。然后,分別以His標(biāo)簽抗體和PEDV高免血清分別作為一抗進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果顯示3種重組蛋白在相應(yīng)位置均出現(xiàn)特異性條帶,而陰性對照組無特異性條帶出現(xiàn)（圖5）,表明3種目的蛋白均獲得表達(dá)。

圖2 p ET-28a-S-EP-SEA最佳誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果

圖5 Western blot結(jié)果

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。A.SDS-PAGE分析及IPTG濃度篩選；A1～A3.質(zhì)粒在28℃,上清誘導(dǎo)表達(dá)（0.10,0.25,0.50 mmol/L）；A4～A6:質(zhì)粒在28℃,沉淀誘導(dǎo)表達(dá)（0.10,0.25,0.50 mmol/L）；A7.陰性對照。B.表達(dá)溫度條件篩選；B1～B6.S-SEA重組蛋白（25,28,32,35,37,42℃）；B7.陰性對照。C.表達(dá)時間篩選；C1～C6.S-SEA重組蛋白（1～6 h）；7.陰性對照

圖4 p ET-28a-S最佳誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果

2.4小鼠血清IgG水平ELISA檢測結(jié)果與對照組相比,首免、二免和三免后14 d各組小鼠血清中抗體水平均不同程度提高。三免后14 d,與對照組相比,S蛋白組和S-SEA蛋白組差異顯著（P＜0.05）,S-EP-SEA蛋白組和弱毒疫苗組差異極顯著（P＜0.01）。與重組S蛋白組、S-SEA蛋白組相比,S-EP-SEA蛋白組和弱毒疫苗組差異均顯著（P＜0.05）,且S-EP-SEA蛋白與弱毒疫苗組間比較差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。

圖6 血清中特異性IgG抗體檢測結(jié)果

2.5小鼠血清IL-2、IL-4和IFN-γ水平檢測結(jié)果與對照組相比,三免之后14 d各免疫重組蛋白組小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4水平均有不同程度提高。其中,免疫S-EP-SEA蛋白組與對照組相比,小鼠血清中IL-2水平差異極顯著（P＜0.01）,PEDV弱毒疫苗組則差異顯著（P＜0.05）,與弱毒疫苗組相比,S-EP-SEA組差異亦顯著（P＜0.05）（圖7 A）。與對照組相比,免疫各組小鼠血清中IL-4水平差異均極顯著（P＜0.01）,3種重組蛋白組中S-EP-SEA組水平最高（圖7 B）。與對照組相比,各重組蛋白組和PEDV弱毒疫苗組小鼠血清中IFN-γ水平差異均極顯著（P＜0.01）,且S-EP-SEA和弱毒疫苗組間差異不顯著（P＞0.05）（圖7 C）。

圖7 細(xì)胞因子檢測結(jié)果

3 討論

據(jù)報道,病毒表面纖突蛋白S在病毒進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)和病毒種間傳播中發(fā)揮十分重要作用[5]。在PEDV侵入機(jī)體過程中,中和抗體也能夠通過與S蛋白受體結(jié)合域的靶向結(jié)合來干擾病毒感染宿主這一過程[6-8]。相關(guān)報道顯示,重組S蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更多特異性的中和抗體,引起豬的保護(hù)性免疫且與PEDV其他蛋白相比具有更高的抗原性[9]。因此,S基因不僅可以作為PEDV的診斷基因,也往往作為開發(fā)針對PED新型疫苗的候選基因[10]。SEA作為超抗原家族中對T細(xì)胞最有效的刺激劑,在極低濃度下便可激活大量淋巴細(xì)胞活化,并刺激分泌大量的細(xì)胞因子[11]。同時,SEA能夠激活淋巴細(xì)胞中的Th1細(xì)胞大量增殖,Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫,在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用[12]。本研究在對國內(nèi)流行PEDV毒株序列分析基礎(chǔ)上,選取有效且保守的線性抗原表位基因（EP）,與經(jīng)典毒株S基因和SEA基因連接,并柔性肽連接,以減少直接連接造成重組蛋白空間構(gòu)象的改變。同時,為提高重組蛋白產(chǎn)量和減低成本,采用了大腸表達(dá)系統(tǒng)作為重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)[13],并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性對基因進(jìn)行了優(yōu)化。將構(gòu)建的3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,進(jìn)行SDSPAGE電泳和Western-blot分析,結(jié)果顯示3種重組蛋白（S、S-SEA和S-EP-SEA）均獲得高效表達(dá),且能被PEDV陽性血清識別。此外,本研究中選擇的表達(dá)載體,其所攜帶的His標(biāo)簽分子質(zhì)量較小,可以獲得較多高活性的重組蛋白,有利于重組蛋白的純化及對其進(jìn)行免疫原性分析[14]。由于大腸桿菌中的重組蛋白常常表達(dá)以包涵體形式存在,因此需要將包涵體蛋白質(zhì)通過完全復(fù)性再在體外進(jìn)行重新折疊[15]。本研究使用通過Ni-NTA親和層析柱純化法將以包涵體形式存在的重組蛋白進(jìn)行純化,最終成功純化出了具有特異性條帶的可溶性蛋白,滿足了后續(xù)試驗(yàn)研究的需求。

亞單位疫苗是通過提取病原體的部分蛋白質(zhì),篩選出具有免疫原性片段,然后進(jìn)一步純化和組裝而成的疫苗[16]。亞單位疫苗不但可以誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生體液、細(xì)胞免疫應(yīng)答,且免疫時間持續(xù)較長,較傳統(tǒng)疫苗更加穩(wěn)定、安全。在本研究中,使用純化的重組蛋白S-EP-SEA蛋白,S-SEA蛋白,S蛋白,PEDV弱毒疫苗和PBS（對照組）,對6周齡的BABL/c小鼠進(jìn)行了3次免疫。在初次免疫和二次免疫后,3種重組蛋白和弱毒疫苗可以誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生的特異性IgG。第3次加強(qiáng)免疫后的血清IgG水平顯著提高,表明制備的重組蛋白均能刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生較高滴度的IgG,且S-EP-SEA組與弱毒疫苗組相比差異不顯著（P＞0.05）,而與S-EPSEA重組蛋白組與弱毒疫苗組與PBS對照組比較差異均為顯著（P＜0.05）。這一結(jié)果表明,在3種重組蛋白中,重組蛋白S-EP-SEA具有更優(yōu)異的免疫原性。

在動物機(jī)體中,IL-2、IL-4和IFN-γ作為重要的細(xì)胞因子,具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[17]。其中,IL-2和IFN-γ來源于CD4＋Th1細(xì)胞,在細(xì)胞免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用,IL-2還能夠刺激活化B淋巴細(xì)胞增殖并具有促進(jìn)免疫球蛋白分泌的功能[18-19],IL-4則在動物機(jī)體的體液免疫過程中發(fā)揮重要作用[20]。為了研究重組蛋白對免疫小鼠細(xì)胞免疫影響,對三免后小鼠的IL-2、IL-4和IFN-γ水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示3種重組蛋白可誘導(dǎo)IL-2、IL-4和IFN-γ升高,其中以S-EP-SEA蛋白效果最好,與PEDV弱毒疫苗差異不大,表明重組蛋白S-EP-SEA能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平細(xì)胞免疫。本研究初步確定了攜帶超抗原SEA多表位疫苗具有良好的免疫原性,但對中和抗體水平的影響極其保護(hù)作用將是今后進(jìn)一步研究的課題。