攀登科學高峰 探索生命奧秘
——人工合成牛胰島素

人工合成動機

在人體的生命活動中有 4種重要的分子: 糖類、脂類、蛋白質和核酸, 其中蛋白質有著自己獨特的結構和功能, 它是組成人體細胞和組織的重要成分。毫不夸張地說, 蛋白質是生命的物質基礎。如果能夠實現(xiàn)蛋白質的人工合成, 這將是中國科學界的一項壯舉。

合成具有生物活性蛋白質的難度在當時是顯而易見的。1958年, 人工合成的最長肽段就是促腎上腺皮質激素的一個片段。因此, 有很多國際上的學術權威認為, 人工合成胰島素在短時間內是不可能完成的事情。1955年, 當桑格第一次闡明胰島素化學結構的時候, 英國《自然》雜志甚至預言: “合成胰島素將是遙遠的事情?！?/p>

1958年8月, 中國科學院上海生物化學研究所(簡稱“生化所”)的科研人員在集體討論中提出要進行人工合成蛋白質的想法, 這一想法很快得到了當時與會者的一致贊成。當時正值新中國成立初期, 百廢待興, 科研工作者希望自己的工作能夠為祖國作出貢獻。當時生化所的科研人員在討論時提出了 3個方面的研究課題, 一是關于腫瘤研究的; 二是關于放射生物學方面的; 三是基本理論研究課題。對于第 3個方面的問題,有人主張做結構, 有人主張做蛋白質的合成, 最終蛋白質的合成這一課題得到與會人員廣泛支持, 被確定了下來。1959年, 這一項目也獲得了國家重大科學技術項目立項。

確定合成方案

在確定了研究的課題內容之后, 生化所就開始進行相關的籌備。1958年秋, 生化所召開學術會議, 當時北京大學、復旦大學、上海有機化學研究所(簡稱“有機所”)等單位的工作人員都參加了此次會議。生化所的曹天欽做了合成胰島素的選題報告。20 世紀 50年代末, 中國只有合成 8 肽的基礎, 國際上也只能合成 13 肽。而胰島素共有兩條鏈, 一條是 21 肽, 還有一條是 30 肽, 總共是 51 肽。這在當時看來, 技術難度很大。因此, 當時中國各個科研院所和大學必須通力合作才有可能實現(xiàn)這一實驗上的重大突破。

會后, 生化所便開始了人工合成胰島素的摸索與實踐。生化所由曹天欽、王芷涯、張友尚、陳常慶、杜雨蒼組成領導小組進行統(tǒng)一指揮, 兵分五路: 第一路是有機合成, 由鈕經義負責; 第二路是天然胰島素的拆合, 由鄒承魯負責; 第三路是建立肽庫和分離分析技術, 由曹天欽負責; 第四路和第五路是做酶的激活與轉肽的工作, 由沈昭文負責。按照這個思路進行前期的研究。

人工全合成結晶牛胰島素的關鍵學術問題之一, 是三對二硫鍵能否正確的連接、正確連接之后又能否形成具有活性的蛋白質構型。當時國際上天然胰島素拆合中幾乎觀察不到重組合胰島素的活性, 所以國外文獻中對二硫鍵的正確連接率很悲觀。但是當時生化所的研究人員堅信: 明知山有虎, 偏向虎山行! 在有難度的問題上啃骨頭, 做攻關, 才能體現(xiàn)出我們的科研實力, 這對于當時百廢待興的科研工作和以后的學術研究也是極大的鼓舞!

1959年, 在沈昭文的領導下, 首先完成構建氨基酸的生產工藝, 實現(xiàn)胰島素 B 鏈中的幾個小片段的人工合成。在鏈的拆分和合成研究上, 鄒承魯和杜雨蒼開始摒棄之前強氧化劑快速氧化的方法, 希望利用溫和的實驗方式來提高重組合后胰島素的活性。1959年國慶前夕, 鄒承魯等人已經找尋出一種不同于以往的新的合成方法: 在不使用氧化劑的同時, 利用強堿性水溶液在低溫下由空氣緩慢反應得到重組產物。杜雨蒼、張友尚等人又發(fā)現(xiàn)了這樣一個重要的事實, 那就是天然的胰島素 A、B 鏈經過磺酸化后, 可以分離純化得到穩(wěn)定的產物, 而且易于進行重組, 并得到 5%~10%的胰島素活性產物。由于實驗保密的需要, 這一重要的研究成果并沒有搶先公布。一年后, 兩名加拿大科學家迪克松(G.H.Dixon)和沃德洛(A.C.Wardlaw)通過實驗獲得了只有天然物 1%~2%生物活性的合成產物, 他們的實驗結果比鄒承魯等人的工作差很多, 但是卻已經搶先公布了。1960年, 在全國第一次生化學術會議上, 杜雨蒼、鄒承魯做了相關的學術報告, 并得到了國內外同行的認可, 因此這套重組方法, 又被稱之為“杜–鄒法”。

這一系列前期研究的成功給科研人員提出了明確的研究思路: 那就是先分別合成 A 鏈和 B 鏈, 然后用合成的 A 鏈或者是 B 鏈分別與天然的 B 鏈或者是 A 鏈組合形成半合成胰島素, 最后再利用合成的 A 鏈與合成的 B 鏈完成胰島素的全合成。

協(xié)作科研攻關

客觀來說, 依據我國當時的科研條件, 僅僅依靠生化所進行單打獨斗是難以順利完成任務的。從研究伊始, 我們就需要有一種團結合作的精神, 如果沒有這些單位的諸多科研工作者的合力, 是根本無法在短時間內對胰島素的結構進行全合成的。特別是在當時的環(huán)境下, 有多個領導小組的專家在各個合作單位之間進行協(xié)調, 無論是研究思路上的統(tǒng)一意見, 實驗操作上的指導, 抑或是實驗步驟的完善, 都進行了通力合作, 這也是獲得人工全合成結晶牛胰島素突破的重要基礎。

研究伊始, 生化所想到可以和北京大學合作, 讓北京大學利用自己的學科優(yōu)勢來承擔其中一部分的工作。1953年3月, 曹天欽、鈕經義、鄒承魯、魯子賢、王芷涯 5 人來到北京大學, 開始尋求與北京大學的合作。在北京大學, 生化所的專家做了有關胰島素研究的學術報告, 北京大學的研究人員給予了積極的響應,決定配合生化所共同開展研究, 承擔胰島素中 A 鏈的合成任務。

要合成胰島素, 首先必須要有充足的原料供應。1959年前后, 合成胰島素的基本原料——氨基酸大部分都是依靠進口, 面對這種情況和高需求量的氨基酸原料, 生化所抽調了陳遠聰等人創(chuàng)辦了我國第一個專門生產氨基酸的工廠——東風生化試劑廠, 解了燃眉之急。

有了充足的供應之后, 如何進行合成也是一個擺在眼前的最為棘手的問題。我們知道, 胰島素的合成是一個復雜的系統(tǒng)工程, 這是一個有 A、B 兩條鏈共 51個氨基酸, 需要經過 200 多步化學反應才能合成的,具有生物活性的蛋白質。

有了原料之后, 就開始進行肽鏈的合成連接。1960年, 北京大學、復旦大學、生化所、有機所等部門幾百人開展了轟轟烈烈的科研群眾運動, 又被稱之為大兵團作戰(zhàn)。

1960—1963年, 在已經取得的研究成果的基礎上, 雖然一直繼續(xù)前行, 但是效果不佳, 始終沒有突破性的進展。

1963年之后, 國家經濟形勢出現(xiàn)好轉。各項科研工作又逐步步入正軌, 1963年10月, 有機所所長汪猷來北京參加人大會議, 北京大學教研室主任邢其毅邀請他到學校做學術報告, 一起商討了合作的事宜, 雙方經過充分的討論決定, 由北京大學合成 A 鏈的前 9 肽, 有機所合成 A 鏈的后 12 肽。

這個時候, 出現(xiàn)了一個非?，F(xiàn)實的問題, 由于北京大學地處北京, 有機所在上海, 當時的通訊方式還不是特別的發(fā)達, 要進行聯(lián)合研究的話, 最好是在同一個城市, 這樣才能有效地進行實驗的溝通和交流。面對這樣的情況, 就必須有一方的工作人員要克服生活、家庭、工作等方面的困難, 整體轉移到另外一座城市進行研究。北京大學化學系的老師們從祖國的利益出發(fā), 決定前往上海, 與有機所的科研人員一起協(xié)同攻關。在計劃經濟時代, 物資極度匱乏, 北京大學的湯卡羅回憶說: “他們(指有機所)說, 你們沒有上海戶口,如果過來, 會既沒有肉票又沒有肥皂票, 在上海生活會有困難。但是北大表示, 這些困難我們都能克服。肉我們可以不吃, 肥皂我們可以背過去?！痹囅胍幌? 北京大學有機教研室的科研人員如果不只身南下, 本可以留在北京大學可以繼續(xù)從事研究, 建設自己的實驗室, 并且可以兼顧到當時的教學和科研任務。但是為了國家的利益和方便實驗中的隨時交流, 他們做出了巨大的犧牲。

隨后, 在國防科工委主任聶榮臻和北京市、上海市領導的支持下, 決定從北京大學抽調季愛雪、陸德培、李崇熙、施溥濤、葉蘊華等 5 名青年教師, 在有機教研室主任邢其毅教授和副主任任文重老師的帶領下來到有機所共同進行 A 鏈的合成, 后來邢其毅的研究生湯卡羅也加入了進來。而生化所就承擔了 B 鏈的合成任務, 以及 A、B 鏈的拆分和合成研究。

這樣, 兩個合成隊伍都集中到了上海, 方便進行學術上的討論和交流, 大大提高了工作效率。

1963年, 研究總算迎來了突破性的進展。由鄒承魯領導的研究小組將天然胰島素 A、B 鏈重組生成胰島素的產率從原先的不足 10%提高到 50%左右, 這對于后續(xù)的研究是一個重大的利好消息。

1964年, 鈕經義、龔岳亭領導的多肽合成組完成了人工合成 B 鏈, 并且利用人工合成的 B 鏈與天然的A 鏈進行重組獲得了成功, 這證明了人工合成的 B 鏈具有生物活性。這時候, 就是等待另外一條鏈——A鏈的人工合成完成了。A 鏈雖然比 B 鏈要短一些, 但是在合成的過程中出現(xiàn)了很多意想不到的困難, 如人工合成的 A 鏈在與天然胰島素 B 鏈組合之后, 所得到的胰島素的活力只有天然胰島素的 1%~4%, 這樣的生物活性是很難與已經人工合成的 B 鏈進行融合的。

按照之前的分工, 生化所負責 B 鏈的人工合成和 A、B 鏈的組合。但當 B 鏈的人工合成完成時, A 鏈還沒有達到預期的目標。這時候, 整個團隊協(xié)調的作用又體現(xiàn)了出來, 統(tǒng)一的協(xié)作組就安排生化所的工作人員與北京大學和有機所的 A 鏈合成團隊, 共同攻克難關。

A 鏈的合成實驗始終在緊張地進行著, 北京大學的陸德培和有機所的徐杰誠在汪猷的指導下進行實驗。玻璃滴管的頭拉得很細, 以便于精確調節(jié)溶液的 pH 值, 再根據精細 pH 試紙的顏色變化進行討論, 是否需要調節(jié)溶液的酸堿度。最終, 在汪猷和邢其毅領導下的聯(lián)合研究小組實現(xiàn)了 A 鏈的合成。

當時, 北京大學研究小組的湯卡羅在自己的回憶文章中還特地提到了這種我們視為珍寶的“團隊協(xié)作”的精神。作為北京大學研究小組負責人邢其毅教授的研究生, 她也有幸加入到當時攻關 A 鏈合成的隊伍中去。為了研究的方便, 邢其毅讓她選擇了相對獨立的課題“牛胰島素 A 鏈帶保護基的氨端九肽的合成”, 將自己合成的 A 鏈氨端前 4 肽 A1–4 和后 5 肽 A5–9, 用疊氮法縮合成 9 肽, 結果和其他同事用 DCC 法合成的 9肽性質完全一樣, 而且收率還得以提高。

后期研究沖刺階段的工作非常緊張, 在學術上也經常出現(xiàn)一些爭執(zhí), 如在合成路徑上出現(xiàn)了不同意見,雙方都覺得自己的方案更加合適, 就會堅持己見。這個時候, 有機所的黨委書記丁公量就會和生化所的書記王芷涯相互交換意見。丁公量的工作作風細致, 從思想工作入手, 深入群眾, 兼聽則明, 鼓勵大家繼續(xù)發(fā)揚這種合作的精神, 求是務實, 充分討論, 在保證積極合作的前提下選擇最優(yōu)的方案。整個協(xié)作研究的過程, 林其誰院士和李伯良研究員將其分為兩個階段: 一個是在 1960年10月生化所與有機所之間的協(xié)作組協(xié)調; 另一個是 1964年2月生化所、有機所與北京大學化學系的協(xié)作組協(xié)調。

最終, 在 30 多位實驗工作人員的辛苦工作下, A 鏈終于成功地被合成出來。在 A 鏈合成的結果拿到之后, 將進行整個全合成中最關鍵的一步: 與 B 鏈進行重組。由施溥濤代表北京大學, 張偉君代表有機所, 杜雨蒼代表生化所進行實驗, 其他科研人員就在實驗室外靜靜地等待結果。

實驗的結果是令人振奮的! 通過純化得到了和天然胰島素完全相同的比活性和抗原性的人工牛胰島素結晶。

為了實驗結果的權威性和可靠性, 全合成的實驗一共重復進行了 4 次, 以保證整個實驗結果的可重復性, 結果每一次的實驗都成功得到了與天然胰島素相同的結晶。在紙層析與紙電泳譜上與天然胰島素也處于同一個位置, 這樣就表明全合成產物與天然牛胰島素結晶是同一種物質。隨后為了證明它具有生物活性,化學工業(yè)部上海醫(yī)藥工業(yè)研究所根據實驗結果, 做了《合成胰島素驚厥法測定結果》的報告, 充分證明人工合成的胰島素與天然的牛胰島素具有同等的生物學活力, 至此說明了整個合成的過程獲得了圓滿的成功。

人工合成結晶牛胰島素的成功, 第一次證實了二硫鍵的形成具有高選擇性, 也同樣以實驗證明了蛋白質的高級結構是取決于一級結構的!

這一實驗結果的取得是令人歡欣鼓舞的。胰島素的合成是多個單位通力合作、共同努力的結果。生化所的鈕經義和龔岳亭負責胰島素 B 鏈的合成, 有機所的汪猷和北京大學邢其毅領導的小組共同負責胰島素A鏈的合成, 中國科學院生物物理所鄒承魯帶領的團隊則負責兩條肽鏈的組合。

在整個牛胰島素結晶的合成過程中, 牽涉到生化所、有機所、北京大學這 3個地處兩地的主要合作單位, 還包括 30 多人的核心攻關力量, 以及近百人的輔助研究力量。這樣一個人數眾多的研究組, 團結協(xié)作顯得尤為重要, 所以特地成立了一個專業(yè)的協(xié)作組, 由王應睞任組長, 汪猷任副組長, 對 3個單位的工作人員進行統(tǒng)籌安排和領導, 最大限度地優(yōu)化分工合作。

成果發(fā)表

1965年, 《科學通報》刊登了一篇文章, 報道了結晶牛胰島素的全合成過程。在文章的作者一欄詳細列出了當時作出貢獻的多位科研工作者, 其中有: 中國科學院生化所的龔岳亭、杜雨蒼、黃惟德、陳常慶、葛麟俊、胡世全、蔣榮慶、朱尚權、鈕經義, 中國科學院有機所的徐杰誠、張偉君、陳玲玲、李鴻緒、汪猷, 北京大學化學系的陸德培、季愛雪、李崇熙、施溥濤、葉蘊華、湯卡羅、邢其毅。

事實上, 北京大學化學系、有機所和生化所 3個單位前期投入研究的成員有上百人之多, 有很多人參與到前期胰島素 A 鏈或者 B 鏈的片段合成工作中, 在最終的文章署名中并沒有體現(xiàn), 但是這依舊不能改變他們的貢獻, 他們是一群默默付出的無名英雄。

人工合成牛胰島素的成功證明了我們的科研實力, 這也是世界上第一個人工合成的蛋白質, 是人類生命科學研究中的一大進步。面對這樣重大的研究成果, 中國科學家還是保持了嚴謹的學術態(tài)度, 沒有急著發(fā)表科研論文, 而是多次舉行了嚴格的鑒定會。杜雨蒼、鈕經義、汪猷等人進行反復合成, 并用電泳、層析、酶解圖譜和免疫性的方法, 對其物理、化學、生物性質進行了長時間的檢測, 所有的結果都表明人工合成的產物與天然產物相同。

1966年4月在波蘭華沙, 王應睞、鄒承魯、龔岳亭參加了歐洲生化學會聯(lián)合會, 在大會上宣讀了這項成果, 受到各個與會國家的祝賀, Science 雜志則評論我國胰島素的全合成是蛋白質合成領域中由量到質的轉變。

雖然這一合成工作已經過去了 50 余年, 但是這些科研機構工作者排除萬難、通力合作的精神為我們留下了一筆寶貴的精神財富, 在人才培養(yǎng)、學術交流、產品研發(fā)等方面都起到了極其重要的作用。

人工合成牛胰島素的團隊是由多個單位共同參與, 其中發(fā)揮主要作用的是生化所、有機所和北京大學3個單位。論文署名了 21 位學者, 而幕后還有很多位默默奉獻的科學家, 他們都成為我國未來生命科學發(fā)展的骨干力量。這項研究適應國家最高戰(zhàn)略目標和意識形態(tài)的需求, 在學術上標志著人類在探索生命的歷程中邁出了關鍵的一步, 客觀上證實了化學合成生物大分子的可能性, 也促進了當時生命科學, 尤其是結構生物學的研究進程。