新型冠狀病毒核酸檢測技術(shù)研究進(jìn)展*

楊涵蕎，王少峽

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617)

2019年12月底，由新型冠狀病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的肺炎——新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)，是近百年來傳播速度最快、感染范圍最廣、防控難度最大的全球性重大突發(fā)公共衛(wèi)生事件。截止2021年5月30日，全球129個國家和地區(qū)累計確診病例1.69億，其中死亡病例大約為353萬[1]。為有效控制病毒的傳播，檢測識別和隔離感染者尤為重要。本文旨在對新型冠狀病毒的最新核酸檢測技術(shù)做一綜述，為臨床診斷提供參考。

1 SARS-CoV-2的基因組特征

通過二代測序(next-generation sequencing，NGS)對病毒的完整序列和基因組表征進(jìn)行分析，表明SARS-CoV-2是一種包膜的正向單鏈RNA(ssRNA)病毒。對該序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該序列屬于冠狀病毒屬的冠狀病毒科(Coronaviridae)[2]，與2003年發(fā)現(xiàn)的SARS病毒(SARS-CoV)具有79 %的基因組序列同一性[3]，與中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)具有50 %的基因組序列同一性[4]，且該序列與目前已知的感染人類的兩種蝙蝠衍生的SARS樣冠狀病毒株(bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21)序列的相似性高達(dá)87.5 %[2]。SARS-CoV-2的基因組序列大小約為29.8 kb，具有14個編碼27種蛋白質(zhì)的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)[5]。位于基因組5'端的Orf1ab基因和Orf1a基因分別編碼pp1ab蛋白和pp1a蛋白。它們總共包含15個非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural proteins，NSPs)，包括NSP1至NSP10和NSP12至NSP16?；蚪M的3'末端可編碼四個結(jié)構(gòu)蛋白：包膜(E)，核衣殼(N)，膜(M)和刺突(S)蛋白，以及八個輔助蛋白(3a，3b，p6、7a，7b，8b，9b和orf14)[6]。其中，N蛋白保留病毒的RNA基因組，而S、E和M蛋白共同形成病毒包膜[7]。盡管在氨基酸水平上，SARS-CoV-2與SARS-CoV非常相似，但二者依然存在著差異。例如，SARS-CoV中存在的8a蛋白，在SARS-CoV-2中并不存在;8b蛋白和3a蛋白的氨基酸個數(shù)在兩者之間存在差異等[6]。然而這些差異如何影響SARS-CoV-2的功能和發(fā)病機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcriptase-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)具有極高的靈敏度和特異性，是目前檢測SARS-CoV-2的首選方法，也是使用最廣泛的方法[8]。其基本原理是在一對引物(上游引物和下游引物)、逆轉(zhuǎn)錄酶、具有耐熱性的Taq DNA聚合酶及脫氧核苷三磷酸的作用下，通過特殊的溫度改變進(jìn)行變性、退火和延伸，將病毒RNA的基因序列特異性放大擴(kuò)增的過程。

編碼SARS-CoV-2的N、E和S蛋白的基因，以及開放閱讀框1ab(Orf1ab)和位于Orf1ab中的RNA依賴地RNA聚合酶(RdRp)基因，均可用RT-PCR進(jìn)行特異性擴(kuò)增檢測[9]。由于在所有的冠狀病毒中，E基因高度保守，N基因可能會與其他冠狀病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，RdRp基因和S基因可用于區(qū)分與SARS-CoV-2有高度同源性的病毒，因此不同靶標(biāo)的選擇可能會影響RT-PCR的特異性[10]。為避免其他地方性冠狀病毒的潛在交叉反應(yīng)以及SARS-CoV-2的潛在遺傳漂移，測定中應(yīng)至少包括兩個分子靶標(biāo)[11]。目前，不同國家和地區(qū)已將多種此類分子靶標(biāo)用于實(shí)時RT-PCR的檢測分析中。

美國疾病預(yù)防控制中心在N基因上選擇了N1、N2兩個靶標(biāo)。在常規(guī)RT-PCR時，N1、N2基因必須顯示雙陽性，否則不考慮陽性結(jié)果。只有對擴(kuò)增子進(jìn)行深度分析時，才可選用單個基因進(jìn)行陽性確認(rèn)。Charité方案使用E基因作為篩選測定，然后使用RdRp基因進(jìn)行確認(rèn)性檢測[12]。有研究表明，N基因檢測的靈敏度略低于E Sarbeco和RdRp基因。美國CDC所選用的N1和N2引物對的檢測限(LOD)為1 copies/L，而E Sarbeco和RdRp基因的LOD分別為5.2和3.8 copies/L。其主要原因是美國CDC的nCoV-N2引物組易于背景擴(kuò)增，從而削弱了在低病毒濃度下區(qū)分真陽性和陰性結(jié)果的能力[13]。巴斯德研究所的實(shí)驗(yàn)方案是使用IP2和IP4基因靶作為一線篩選工具，確認(rèn)性測試則利用E基因靶。IP2和IP4基因單獨(dú)用于檢測時，每個反應(yīng)可檢測到約100 copies/L的RNA基因組當(dāng)量，檢測概率為95 %。當(dāng)用其進(jìn)行多重測定時只能獲得較低的10 copies/L的基因組當(dāng)量[12]。香港大學(xué)一項(xiàng)研究中利用了Orf1b和N基因作為靶標(biāo)，擴(kuò)增子大小和擴(kuò)增效率分別為132 bp、99.6 %和110 bp、95.4 %,并且在對陽性臨床樣品的檢測中發(fā)現(xiàn)，使用N基因作為靶標(biāo)的靈敏度是使用Orf1b基因時的10倍左右[14]。經(jīng)比較研究表明，來自Charité方案的引物E Sarbeco和來自香港大學(xué)研究方案的Orf1b-nsp 14最為敏感，在75 %的檢測頻率下，LOD為10 copies/L[13]。目前我國國家衛(wèi)健委推薦使用SARS-CoV-2的三個特異性區(qū)域(Orf1ab基因、N基因、E基因)作為RT-PCR的擴(kuò)增靶標(biāo)。臨床上主要使用的靶標(biāo)為單靶標(biāo)(Orf1ab)、雙靶標(biāo)(Orf1ab和N，Orf1ab和E)以及三靶標(biāo)(Orf1ab，N，E)三種類型[15]。其中因具有較好的擴(kuò)增效率和特異性，以O(shè)rf1ab基因和N基因的雙基因靶標(biāo)為最常用，且須顯示雙陽性才考慮陽性結(jié)果[15-16]。雖然目前依然無跡象說明所使用的任何一個序列區(qū)在臨床診斷上具有獨(dú)特的優(yōu)勢，但由于病毒的高度變異，為了減輕病毒遺傳漂移的影響，研究人員在序列區(qū)的選擇上只能遵循“既保守又特異”的原則，根據(jù)需要選擇不同或多個基因作為靶標(biāo)進(jìn)行檢測[11]。

3 其他新型SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)

3.1環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增 環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年發(fā)明的等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)，整個過程均在恒溫下進(jìn)行，有效地規(guī)避了常規(guī)PCR對于溫度的特殊要求，因此目前正逐漸代替PCR被廣泛應(yīng)用于各種傳染病的核酸檢測，包括COVID-19[17]。此方法依靠一對內(nèi)部引物(FIP與BIP)、一對外部引物(F3與B3)、6個靶基因特定序列(F1c、F2c、F3c、B1c、B2c、B3c)和具有高鏈置換活性的DNA聚合酶進(jìn)行的在65C恒溫狀態(tài)下的自動循環(huán)鏈置換DNA合成，分為起始物合成和循環(huán)擴(kuò)增兩個階段[18]。啟動擴(kuò)增從內(nèi)部引物FIP結(jié)合靶基因F2c開始。鏈置換型DNA聚合酶將該引物延伸形成互補(bǔ)鏈。接著外部引物F3結(jié)合F3c，通過鏈置換型DNA聚合酶的作用將之前合成的DNA置換下來，并開始新的DNA延伸，與模板DNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)[17,19]。被替換下來的引物端因其有反向互補(bǔ)序列而形成自雜交的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。引物延伸和鏈置換會交替發(fā)生在靶DNA序列的兩端，因此形成短啞鈴狀的DNA擴(kuò)增[17]。新合成的DNA會形成多聯(lián)體，并和擴(kuò)增副產(chǎn)物大量重復(fù)交替產(chǎn)生，數(shù)量級可達(dá)109[18]。

目前，額外加入RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的LAMP測定試劑(Reverse Transcription LAMP，RT-LAMP)，正廣泛應(yīng)用于COVID-19的診斷中[20]。研究表明，新冠病毒RNA的各種特異性靶標(biāo)基因均可被LAMP成功檢測，在30 min之內(nèi)可獲得的LOD為500 copies/mL，靈敏度比常規(guī)PCR高約100倍[21-22]。與PCR相比，RT-LAMP僅在單個反應(yīng)管中加熱樣品和試劑即可在低配置資源下完成檢測，且檢測速度為RT-PCR的2倍左右，具有高靈敏性、高效快速、高特異性和操作便捷的特點(diǎn)[20,22]。

3.2DNA內(nèi)切酶靶向的CRISPR反式報告檢測系統(tǒng)(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR) 成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)由相同的重復(fù)DNA序列組成，由高度可變的序列隔開，與CRISPR相關(guān)蛋白(Cas蛋白)組成CRISPR-Cas系統(tǒng)，作為適應(yīng)性抗病毒免疫系統(tǒng)存在于大多數(shù)細(xì)菌與古細(xì)菌中[23]。近年來，研究人員將CRISPR-Cas系統(tǒng)的靶向切割特性運(yùn)用到了核酸檢測技術(shù)當(dāng)中。與CRISPR結(jié)合的多種Cas酶，包括Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b和Cas14，其中以CRISPR-Cas12系統(tǒng)和CRISPR-Cas13系統(tǒng)在核酸檢測領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛[24]。因其高效、精準(zhǔn)、可視化的特點(diǎn)，DETECTR、SHERLOCK等多種基于CRISPR-Cas系統(tǒng)而開發(fā)的檢測技術(shù)，均作為新型技術(shù)應(yīng)用于SARS-CoV-2的分子診斷中。

DETECTR基于CRISPR-Cas12系統(tǒng)，通過激活Cas12a酶(ssDNase)，使crRNA-Cas12a復(fù)合物與靶DNA結(jié)合并誘導(dǎo)與熒光報告分子偶聯(lián)的ssDNA的非特異性切割，從而釋放熒光信號,這種熒光信號可被做成側(cè)向流層析紙條，實(shí)現(xiàn)對病毒DNA檢測的可視化[25]。研究表明，DETECTR利用的是編碼SARS-CoV-2的N基因和E基因作為靶標(biāo)進(jìn)行檢測，并不與其他冠狀病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，檢測時間在30～40 min，LOD值為10 copies/L，當(dāng)有一個基因顯示陽性時則可推斷陽性結(jié)果。與RT-PCR相比，DETECTR對呼吸道拭子標(biāo)本中SARS-CoV-2檢測的靈敏度為90 %，特異性為100 %，且在對78例COVID-19感染者進(jìn)行的臨床測試中顯示，陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為95 %和100 %[24]。

3.3SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter) SHERLOCK也是基于CRISPR-Cas13系統(tǒng)，整合了等溫重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)或具有Cas13 a核酸酶活性的逆轉(zhuǎn)錄RPA(RT-RPA)。crRNA-Cas13 a復(fù)合物可特異性結(jié)合并切割偶聯(lián)至熒光報告基因的靶RNA以及非靶RNA，從而產(chǎn)生熒光信號[25]。該技術(shù)結(jié)合了多種Cas酶，如Cas13、Cas12a和Csm6，以便同時檢測多種核酸，達(dá)到快速簡便的效果。SHERLOCK具有高靈敏度，可區(qū)分僅有一個堿基對不同的靶標(biāo)[24-25]。

在SARS-CoV-2的檢測中，研究人員通過RPA對編碼SARS-CoV-2的Orf1ab基因和S基因進(jìn)行擴(kuò)增，能夠在10～100 copies/L的范圍內(nèi)檢測到SARS-CoV-2的存在，檢測時間大約為60 min。與RT-PCR相比，SHERLOCK的靈敏度和特異性分別為97 %、100 %[24]。與此同時，研究人員還開發(fā)了一種基于SHERLOCK的即時診斷(point-of-testing，POCT),該方法可將等溫擴(kuò)增和Cas酶檢測靶RNA的步驟合并在同一個試管中進(jìn)行，被命名為SHERLOCK test in a Pot(STOPCovid)。其靈敏度與RT-PCR相當(dāng)，每次反應(yīng)可檢測100 copies/L的病毒基因組當(dāng)量，且同樣可用側(cè)向流層析法觀察并在70 min內(nèi)得出結(jié)果。若用熒光檢測讀取信號，僅需要40 min。STOPCovid適用于1 h內(nèi)的即時診斷，極大地有利于COVID-19的追蹤隔離工作，并對資源匱乏的國家和地區(qū)的COVID-19診斷具有重大意義[26]。

3.4雙功能等離子體生物傳感器(Dual-Functional Plasmonic Photothermal Biosensors) 據(jù)新近的研究報道[27]，研究人員還開發(fā)了由等離子體光熱(plasmonic photothermal，PPT)效應(yīng)與局部表面等離子體共振(localized surface plasmon resonance，LSPR)傳感轉(zhuǎn)導(dǎo)相結(jié)合的雙功能等離子體生物傳感器，該技術(shù)是利用金納米粒子(AuNIs)產(chǎn)生局部PPT熱并轉(zhuǎn)導(dǎo)核酸雜交，結(jié)合LSPR系統(tǒng)檢測PPT熱所引起的周圍環(huán)境折射率變化，將SARS-CoV-2 RNA和固定在AuNIs上與其互補(bǔ)的DNA探針進(jìn)行核酸雜交，來對病毒RNA特定序列進(jìn)行檢測，具有高靈敏度，特異性，快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)。其選用的是SARS-CoV-2 RdRp和Orf1ab基因靶作為篩選測定，E基因靶進(jìn)行確認(rèn)性檢測，特定序列的LOD低至0.22 pM的濃度。由于AuNIs附近局部PPT加熱到一定溫度(大約41C)還能夠抑制相似但不完全匹配序列的雜散結(jié)合，因此有效避免了與高度相似的SARS-CoV RdRp序列發(fā)生交叉反應(yīng)。該技術(shù)有效增強(qiáng)了準(zhǔn)確區(qū)分相似序列的能力，改善了核酸檢測的靈敏度與特異性[27]。

4 臨床樣本類型對核酸檢測SARS-CoV-2的影響

核酸檢測技術(shù)在針對不同類型樣本檢測時，其陽性檢出率、靈敏度和特異性會有所差異。研究表明[28]，利用RT-PCR對8136份不同臨床樣本的陽性檢出率進(jìn)行對比分析，其中支氣管肺泡灌洗液陽性率最高為91.8 %，其次是直腸拭子(87.8 %)、痰液(68.1 %)、鼻咽拭子(45.5 %)、糞便(32.8 %)、口咽拭子(7.6 %)、血液(1.0 %)，尿液中陽性檢出率為0 %[29]。對于其他新型技術(shù)而言，不同樣本類型亦有影響，如在收集的223份呼吸道樣本中，LAMP檢測鼻咽拭子觀察到對SARS-CoV-2的最高靈敏度為98.96 %，痰液/深喉唾液樣本靈敏度為97.02 %，口咽拭子靈敏度為98.33 %，且對所有樣本特異性均為100.00 %[29]。

5 突變株對核酸檢測技術(shù)的影響

截止2021年5月11日，SARS-CoV-2已演變出1281種不同的亞型或分支[30]，其突變類型主要包括錯義、同義、插入、缺失、和非編碼突變，其中以錯義突變和同義突變最為常見，且這些突變主要集中在SARS-CoV-2的ORF1ab，S，N等基因[31]。世界衛(wèi)生組織(world health organization，WHO)將重要變異株劃分為“關(guān)切變異株(variant of concern，VOC)”和“關(guān)注變異株(variant of interest，VOI)”，截止2021年5月30日，WHO認(rèn)定的關(guān)切變異株有501Y.V2、B.1.1.7、P.1、B.1.617，關(guān)注變異株有CAL.20C、B.1.526、B.1.525、B.1.616、P.2、P.3[1]。有研究表明，B.1.1.7變異株含有大量突變，這些突變可能會抑制引物與S基因的結(jié)合，導(dǎo)致RT-PCR的靈敏度降低，但目前已開發(fā)了多種變體特異性引物用以檢測[32]。低頻率存在或僅涉及單個堿基突變的變體在RT-PCR檢測時易產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象，但臨床上多用雙靶標(biāo)或三靶標(biāo)進(jìn)行檢測，因而仍可靶向另一個靶標(biāo)基因檢測到病毒的存在[1]。WHO流行病學(xué)報告顯示，截止2021年5月25日，致病性較強(qiáng)、感染率較高的關(guān)切變異株對核酸檢測的影響仍有限或暫無證據(jù)表明產(chǎn)生影響[1]。

6 小結(jié)

高效快速地對病原菌的檢測是診斷感染性疾病的根本措施。目前，以檢測快速，高靈敏度，特異性強(qiáng)為特征的RT-PCR仍然被作為全球新冠肺炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。LAMP等新型技術(shù)高效快速，操作便捷，且具有較高的特異性和靈敏度，為COVID-19的早期診斷提供了更多的選擇。每一種核酸檢測技術(shù)各有其優(yōu)劣，它們相互配合，可以更精確地診斷疾病、監(jiān)測病毒變異。見表1。

表1 多種核酸檢測技術(shù)的優(yōu)劣對比