氣相色譜法同時測定慕薩萊思中甲醇和乙醇的含量

陳勝慧子，侯曉杰，喬通通，蒲云峰，2，侯旭杰，2*

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

慕薩萊思是具有新疆民族特色的傳統(tǒng)飲品，有近千年的歷史，傳承著新疆刀郎文化的精髓與靈魂[1]。慕薩萊思釀造工藝與現(xiàn)代和傳統(tǒng)葡萄酒釀造工藝存在著很大區(qū)別，其釀造過程一般為將新鮮葡萄（常用和田紅葡萄）洗凈、榨汁、熬煮濃縮后，經(jīng)60 d左右自然發(fā)酵釀制而成[2-4]。根據(jù)個人口味及群體需求的不同，可以添加大蕓、白杏、桑椹、紅花、枸杞、鹿茸、紅棗、枸杞等中藥材[5]。慕薩萊思含有大量的醇類、糖類、有機酸、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[6-7]，還含有原花青素、黃酮、花色苷、酚類等生物活性成分[8]。

近年來，隨著人們對傳統(tǒng)民族特色食品的青睞及消費市場需求的增加，慕薩萊思受到的關(guān)注也日益提升。目前，慕薩萊思的研究集中于釀造工藝優(yōu)化[4]、菌種篩選及香氣形成機理方面的研究[3，9]，而甲醇和乙醇作為慕薩萊思中極為重要的產(chǎn)品品質(zhì)指標(biāo)和安全性指標(biāo)，對其研究報道較少。慕薩萊思相關(guān)企業(yè)以及監(jiān)管機構(gòu)，對于能夠準(zhǔn)確且同時測定甲醇和乙醇含量的方法的建立需求迫切。多位學(xué)者研究了葡萄酒、果酒等酒類中甲醇和乙醇含量的測定方法[10-11]，但通常僅限于單獨測定樣品中的甲醇或乙醇含量，鮮有建立同時測定甲醇和乙醇含量的方法。李惠明等[12]采用氣相色譜法同時測定了桑葚酒中的甲醇和乙醇含量，但該方法采用外標(biāo)法。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，氣相色譜外標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系差，結(jié)果不穩(wěn)定。因此，建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確，并且能夠同時測定慕薩萊思中甲醇和乙醇含量的方法，對慕薩萊思以及其它酒類產(chǎn)品的質(zhì)量和安全控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與樣品

無水乙醇（AR）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；異丙醇、甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；樣品：市售31個不同廠家的慕薩萊思產(chǎn)品，分別用M1～M31表示31個不同的慕薩萊思酒樣。

1.2 試驗儀器

氣相色譜儀（GC-2014）[配有火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）]：日本島津公司；電子分析天平（EL204-IC）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

KB-PLOT Q（30 m × 0.32 mm，10 μm）毛細(xì)管柱，進樣口溫度：250℃，檢測器溫度：250℃，載氣為氮氣，流量 1.0 mL/min，進樣體積：1 μL，分流比為 50∶1，程序升溫：初始溫度為120℃，保持2 min，以10℃/min的速率升至170℃，保持3 min。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.2.1 甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液（5 000 mg/L）

參考GB 5009.266—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測定》[13]中甲醇儲備液配制方法，略做修改。準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.001 g）甲醇至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，混勻，4℃冰箱密封保存。

1.3.2.2 甲醇和乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》[14]和GB 5009.266—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測定》[13]中標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍配制，取6個100 mL容量瓶，分別吸取2.00、3.00、4.00、5.00、7.00、14.00 mL 無水乙醇，然后分別吸取1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、20.00 mL 甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液至容量瓶中，再用蒸餾水定容、混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取10 mL甲醇和乙醇混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作液于試管中，然后加入0.10 mL異丙醇，混勻，用0.22 μm針式濾膜過濾，測定甲醇、乙醇和內(nèi)標(biāo)異丙醇色譜峰面積，以甲醇濃度為橫坐標(biāo)，以甲醇和異丙醇色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；以乙醇濃度為橫坐標(biāo)，以乙醇和異丙醇色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 慕薩萊思酒樣測定

吸取試樣10.0 mL于試管中，加入0.10 mL異丙醇，混勻，用0.22 μm針式濾膜過濾，注入氣相色譜儀中，以保留時間定性分析，同時記錄甲醇、乙醇和異丙醇色譜峰面積，再分別計算甲醇和異丙醇的色譜峰比值、乙醇和異丙醇的色譜峰比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0對所有試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan′s多重比較法分析，每個樣品重復(fù)3次，試驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲醇和乙醇的氣相色譜檢測結(jié)果

甲醇、乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)品和慕薩萊思酒樣的色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of mixed standard

圖2 慕薩萊思酒樣的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of the Musalais sample

甲醇（峰1）、乙醇（峰2）和異丙醇（峰3）的保留時間分別為4.07、5.34、7.09 min，在該分析條件下，甲醇、乙醇和異丙醇色譜峰的分離度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1.5，說明該條件適合慕薩萊思中甲醇和乙醇含量的測定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照1.3.1的色譜分析條件，以甲醇和乙醇峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，甲醇和乙醇濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度最小的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，然后進樣分析，通過信噪比的計算獲得檢測限（limit of detection，LOD，S/N=3）和定量限（limit of quantitation， LOQ，S/N=10），具體結(jié)果見表1。

表1 甲醇和乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curves of methanol and ethanol

由表1可知，甲醇和乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.999 5和0.999 3，表明在試驗濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。從檢測限（LOD）和定量限（LOQ）分析，甲醇的檢測限和定量限為2.34 mg/L和7.02 mg/L，而GB5009.266—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測定》[13]中的檢測限和定量限分別為7.5mg/L和25mg/L[15]，說明該方法測定甲醇的檢測限和定量限遠(yuǎn)低于國標(biāo)要求，具有較高的靈敏度。李中賢等[16]采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法建立了單獨測定葡萄酒中甲醇含量的方法，其對甲醇的檢測限為7.20 mg/L，高于本方法中的檢出限。目前，尚無關(guān)于氣相色譜法測定乙醇的檢測限和定量限的相關(guān)報道，但從表1的結(jié)果可以看出，乙醇的檢測限和定量限也較低。上述研究結(jié)果表明，采用目前條件所建立的方法分析慕薩萊思酒中甲醇和乙醇含量，方法的檢測限低，靈敏度高，具有推廣使用的價值。

2.3 穩(wěn)定性

通過預(yù)試驗，確定含有甲醇的慕薩萊思酒樣，隨機選取其中一個酒樣（M23）進行分析，參照1.3.4的方法進行制備樣品，采用0.22 μm針式濾膜過濾樣品，準(zhǔn)備5份相同的樣品，分別在4℃的條件下放置0、6、12、18、24 h后進樣，然后計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Results of stability test

由表2可知，在24 h內(nèi)測定酒樣中甲醇和乙醇含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.87%和1.79%，兩者的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜5%，表明該分析條件下，樣品的穩(wěn)定性較好，即在4℃的條件下放置24 h內(nèi)，樣品測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.4 精密性

以穩(wěn)定性試驗的慕薩萊思酒樣（M23）為研究對象，參照1.3.4的方法進行樣品制備，采用0.22 μm針式濾膜過濾樣品，平行進樣6次，記錄甲醇、乙醇和異丙醇的峰面積，然后計算慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的平均值和RSD，結(jié)果見表3。

表3 精密性試驗結(jié)果Table 3 Results of precision test

由表3可以看出，甲醇和乙醇的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.39%和1.71%，均小于5%，說明平行測定6次的結(jié)果誤差較小，該方法的精密性和準(zhǔn)確性較高。

2.5 回收率

以穩(wěn)定性和精密性試驗的酒樣（M23）為研究對象，準(zhǔn)確移取50mL酒樣至100mL容量中，然后準(zhǔn)確吸取一定量的1.3.2.1的甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再準(zhǔn)確吸取一定量的無水乙醇，混勻后用蒸餾水定容，參照1.3.4的方法進行樣品制備，采用0.22 μm針式濾膜過濾，每個處理重復(fù)6次，進樣分析，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗結(jié)果Table 4 Results of recovery test

由表4可以看出，甲醇、乙醇的回收率在93.18%～97.66%，回收率均超過90%，說明該方法分析慕薩萊思中甲醇、乙醇含量的回收率較好，可滿足樣品的定量分析需求，具備應(yīng)用于實際生產(chǎn)的條件。

2.6 慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的測定

參照1.3.4的樣品制備方法制備樣品。然后按1.3.1的色譜條件進行分析，獲得慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的結(jié)果，結(jié)果見表5。

表5 慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的對比Table 5 Methyl alcohol and ethanol contents in Musalais liquor samples

續(xù)表5 慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的對比Continue table 5 Methyl alcohol and ethanol contents in Musalais liquor samples

通過對31個慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量分析可知，只有5個酒樣中檢測到甲醇，其中M7酒樣中的甲醇含量最高，達(dá)（428.17±10.25）mg/L，且超過葡萄酒中甲醇的限量標(biāo)準(zhǔn)，國標(biāo)中規(guī)定白、桃紅葡萄酒中甲醇含量≤250 mg/L，紅葡萄酒≤400 mg/L[13]。而其余4個檢測到甲醇的酒樣中甲醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB 15037—2006《葡萄酒》中規(guī)定的甲醇限量，說明絕大部分慕薩萊思酒樣中甲醇含量較低且符合國家標(biāo)準(zhǔn)。分析M7慕薩萊思酒樣中甲醇含量異常的原因，可能是由于M7樣品的原料中含有紅棗，而紅棗富含果膠和多糖，其在發(fā)酵過程中易產(chǎn)生過量的甲醇，進而導(dǎo)致M7酒樣甲醇含量異常[17-18]。也有多位學(xué)者研究指出在以紅棗為原料制備的發(fā)酵酒中甲醇含量較高，李堅等[19]采用新疆若羌紅棗為原料制備紅棗酒，其中甲醇的含量介于 336.95 mg/L～486.11 mg/L；黃孟陽[20]分析了紅棗酒發(fā)酵過程中甲醇含量的變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中其甲醇含量最高可達(dá)601.70 mg/L，采用一系列措施對甲醇生成量進行減控后可降低至223.40 mg/L。這均表明紅棗作為原料生產(chǎn)發(fā)酵酒過程中，甲醇是其必然產(chǎn)物之一，因此極有必要建立簡單有效的方法對其進行檢測。從所測酒樣的乙醇含量分析可知，該批慕薩萊思酒樣的乙醇含量介于7.89%～14.55%，符合GB 15037—2006《葡萄酒》中乙醇含量要求（≥7%），但2/3的酒樣實際乙醇含量與標(biāo)簽標(biāo)識差異較大（＞0.5%），部分樣品的乙醇含量與標(biāo)識含量差異超過2%，說明目前慕薩萊思生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品的乙醇含量測定方面存在的問題較為嚴(yán)重，有必要建議企業(yè)開展檢驗人員培訓(xùn)或采用氣相色譜法測定產(chǎn)品的乙醇含量。

3 結(jié)論

本研究采用KB-PLOT Q毛細(xì)管柱，建立了氣相色譜法同時測定慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的方法，該方法與國標(biāo)和文獻方法相比較，既具備同時測定慕薩萊思酒樣中的甲醇和乙醇含量，還具有樣品處理簡單、分析周期短、色譜峰分離度高、檢測限和定量限低、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)勢，適用于慕薩萊思及其它果酒樣品中甲醇和乙醇含量的同時測定。從樣品分析結(jié)果來看，以葡萄為原料釀造的慕薩萊思的甲醇含量均符合GB 15037—2006《葡萄酒》中對甲醇含量的要求，但原料中含有紅棗時，甲醇含量可能會超標(biāo)；從慕薩萊思中乙醇含量的測定結(jié)果分析，所有樣品均符合GB 15037—2006《葡萄酒》中乙醇含量要求，但實際測定結(jié)果與標(biāo)簽標(biāo)識乙醇含量差異較大，這可能是由于慕薩萊思屬于傳統(tǒng)民族特色食品，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的時間較晚，企業(yè)對產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)的檢測方面重視程度不夠。因此，有必要在慕薩萊思生產(chǎn)企業(yè)開展氣相色譜法測定酒樣中甲醇和乙醇含量的相關(guān)培訓(xùn)等工作，為促進新疆慕薩萊思產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展助力。