陳勝慧子,侯曉杰,喬通通,蒲云峰,2,侯旭杰,2*
(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300;2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團重點實驗室,新疆 阿拉爾 843300)
慕薩萊思是具有新疆民族特色的傳統(tǒng)飲品,有近千年的歷史,傳承著新疆刀郎文化的精髓與靈魂[1]。慕薩萊思釀造工藝與現(xiàn)代和傳統(tǒng)葡萄酒釀造工藝存在著很大區(qū)別,其釀造過程一般為將新鮮葡萄(常用和田紅葡萄)洗凈、榨汁、熬煮濃縮后,經(jīng)60 d左右自然發(fā)酵釀制而成[2-4]。根據(jù)個人口味及群體需求的不同,可以添加大蕓、白杏、桑椹、紅花、枸杞、鹿茸、紅棗、枸杞等中藥材[5]。慕薩萊思含有大量的醇類、糖類、有機酸、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[6-7],還含有原花青素、黃酮、花色苷、酚類等生物活性成分[8]。
近年來,隨著人們對傳統(tǒng)民族特色食品的青睞及消費市場需求的增加,慕薩萊思受到的關(guān)注也日益提升。目前,慕薩萊思的研究集中于釀造工藝優(yōu)化[4]、菌種篩選及香氣形成機理方面的研究[3,9],而甲醇和乙醇作為慕薩萊思中極為重要的產(chǎn)品品質(zhì)指標(biāo)和安全性指標(biāo),對其研究報道較少。慕薩萊思相關(guān)企業(yè)以及監(jiān)管機構(gòu),對于能夠準(zhǔn)確且同時測定甲醇和乙醇含量的方法的建立需求迫切。多位學(xué)者研究了葡萄酒、果酒等酒類中甲醇和乙醇含量的測定方法[10-11],但通常僅限于單獨測定樣品中的甲醇或乙醇含量,鮮有建立同時測定甲醇和乙醇含量的方法。李惠明等[12]采用氣相色譜法同時測定了桑葚酒中的甲醇和乙醇含量,但該方法采用外標(biāo)法。在前期的研究中發(fā)現(xiàn),氣相色譜外標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系差,結(jié)果不穩(wěn)定。因此,建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確,并且能夠同時測定慕薩萊思中甲醇和乙醇含量的方法,對慕薩萊思以及其它酒類產(chǎn)品的質(zhì)量和安全控制具有重要意義。
無水乙醇(AR):天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;異丙醇、甲醇(色譜純):賽默飛世爾科技(中國)有限公司;樣品:市售31個不同廠家的慕薩萊思產(chǎn)品,分別用M1~M31表示31個不同的慕薩萊思酒樣。
氣相色譜儀(GC-2014)[配有火焰離子化檢測器(flame ionization detector,F(xiàn)ID)]:日本島津公司;電子分析天平(EL204-IC):梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。
1.3.1 色譜條件
KB-PLOT Q(30 m × 0.32 mm,10 μm)毛細(xì)管柱,進樣口溫度:250℃,檢測器溫度:250℃,載氣為氮氣,流量 1.0 mL/min,進樣體積:1 μL,分流比為 50∶1,程序升溫:初始溫度為120℃,保持2 min,以10℃/min的速率升至170℃,保持3 min。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
1.3.2.1 甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液(5 000 mg/L)
參考GB 5009.266—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測定》[13]中甲醇儲備液配制方法,略做修改。準(zhǔn)確稱取0.5 g(精確至0.001 g)甲醇至100 mL容量瓶中,用蒸餾水定容,混勻,4℃冰箱密封保存。
1.3.2.2 甲醇和乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制
參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》[14]和GB 5009.266—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測定》[13]中標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍配制,取6個100 mL容量瓶,分別吸取2.00、3.00、4.00、5.00、7.00、14.00 mL 無水乙醇,然后分別吸取1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、20.00 mL 甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液至容量瓶中,再用蒸餾水定容、混勻,現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別吸取10 mL甲醇和乙醇混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作液于試管中,然后加入0.10 mL異丙醇,混勻,用0.22 μm針式濾膜過濾,測定甲醇、乙醇和內(nèi)標(biāo)異丙醇色譜峰面積,以甲醇濃度為橫坐標(biāo),以甲醇和異丙醇色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線;以乙醇濃度為橫坐標(biāo),以乙醇和異丙醇色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.4 慕薩萊思酒樣測定
吸取試樣10.0 mL于試管中,加入0.10 mL異丙醇,混勻,用0.22 μm針式濾膜過濾,注入氣相色譜儀中,以保留時間定性分析,同時記錄甲醇、乙醇和異丙醇色譜峰面積,再分別計算甲醇和異丙醇的色譜峰比值、乙醇和異丙醇的色譜峰比值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量。
采用SPSS20.0對所有試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan′s多重比較法分析,每個樣品重復(fù)3次,試驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,顯著水平為P<0.05。
甲醇、乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)品和慕薩萊思酒樣的色譜圖如圖1和圖2所示。
圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of mixed standard
圖2 慕薩萊思酒樣的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of the Musalais sample
甲醇(峰1)、乙醇(峰2)和異丙醇(峰3)的保留時間分別為4.07、5.34、7.09 min,在該分析條件下,甲醇、乙醇和異丙醇色譜峰的分離度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1.5,說明該條件適合慕薩萊思中甲醇和乙醇含量的測定。
參照1.3.1的色譜分析條件,以甲醇和乙醇峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo),甲醇和乙醇濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以濃度最小的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋,然后進樣分析,通過信噪比的計算獲得檢測限(limit of detection,LOD,S/N=3)和定量限(limit of quantitation, LOQ,S/N=10),具體結(jié)果見表1。
表1 甲醇和乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curves of methanol and ethanol
由表1可知,甲醇和乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999 5和0.999 3,表明在試驗濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。從檢測限(LOD)和定量限(LOQ)分析,甲醇的檢測限和定量限為2.34 mg/L和7.02 mg/L,而GB5009.266—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測定》[13]中的檢測限和定量限分別為7.5mg/L和25mg/L[15],說明該方法測定甲醇的檢測限和定量限遠(yuǎn)低于國標(biāo)要求,具有較高的靈敏度。李中賢等[16]采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法建立了單獨測定葡萄酒中甲醇含量的方法,其對甲醇的檢測限為7.20 mg/L,高于本方法中的檢出限。目前,尚無關(guān)于氣相色譜法測定乙醇的檢測限和定量限的相關(guān)報道,但從表1的結(jié)果可以看出,乙醇的檢測限和定量限也較低。上述研究結(jié)果表明,采用目前條件所建立的方法分析慕薩萊思酒中甲醇和乙醇含量,方法的檢測限低,靈敏度高,具有推廣使用的價值。
通過預(yù)試驗,確定含有甲醇的慕薩萊思酒樣,隨機選取其中一個酒樣(M23)進行分析,參照1.3.4的方法進行制備樣品,采用0.22 μm針式濾膜過濾樣品,準(zhǔn)備5份相同的樣品,分別在4℃的條件下放置0、6、12、18、24 h后進樣,然后計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD),結(jié)果見表2。
表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Results of stability test
由表2可知,在24 h內(nèi)測定酒樣中甲醇和乙醇含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.87%和1.79%,兩者的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均<5%,表明該分析條件下,樣品的穩(wěn)定性較好,即在4℃的條件下放置24 h內(nèi),樣品測定結(jié)果穩(wěn)定。
以穩(wěn)定性試驗的慕薩萊思酒樣(M23)為研究對象,參照1.3.4的方法進行樣品制備,采用0.22 μm針式濾膜過濾樣品,平行進樣6次,記錄甲醇、乙醇和異丙醇的峰面積,然后計算慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的平均值和RSD,結(jié)果見表3。
表3 精密性試驗結(jié)果Table 3 Results of precision test
由表3可以看出,甲醇和乙醇的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.39%和1.71%,均小于5%,說明平行測定6次的結(jié)果誤差較小,該方法的精密性和準(zhǔn)確性較高。
以穩(wěn)定性和精密性試驗的酒樣(M23)為研究對象,準(zhǔn)確移取50mL酒樣至100mL容量中,然后準(zhǔn)確吸取一定量的1.3.2.1的甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液,再準(zhǔn)確吸取一定量的無水乙醇,混勻后用蒸餾水定容,參照1.3.4的方法進行樣品制備,采用0.22 μm針式濾膜過濾,每個處理重復(fù)6次,進樣分析,計算回收率,結(jié)果見表4。
表4 回收率試驗結(jié)果Table 4 Results of recovery test
由表4可以看出,甲醇、乙醇的回收率在93.18%~97.66%,回收率均超過90%,說明該方法分析慕薩萊思中甲醇、乙醇含量的回收率較好,可滿足樣品的定量分析需求,具備應(yīng)用于實際生產(chǎn)的條件。
參照1.3.4的樣品制備方法制備樣品。然后按1.3.1的色譜條件進行分析,獲得慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的結(jié)果,結(jié)果見表5。
表5 慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的對比Table 5 Methyl alcohol and ethanol contents in Musalais liquor samples
續(xù)表5 慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的對比Continue table 5 Methyl alcohol and ethanol contents in Musalais liquor samples
通過對31個慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量分析可知,只有5個酒樣中檢測到甲醇,其中M7酒樣中的甲醇含量最高,達(dá)(428.17±10.25)mg/L,且超過葡萄酒中甲醇的限量標(biāo)準(zhǔn),國標(biāo)中規(guī)定白、桃紅葡萄酒中甲醇含量≤250 mg/L,紅葡萄酒≤400 mg/L[13]。而其余4個檢測到甲醇的酒樣中甲醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB 15037—2006《葡萄酒》中規(guī)定的甲醇限量,說明絕大部分慕薩萊思酒樣中甲醇含量較低且符合國家標(biāo)準(zhǔn)。分析M7慕薩萊思酒樣中甲醇含量異常的原因,可能是由于M7樣品的原料中含有紅棗,而紅棗富含果膠和多糖,其在發(fā)酵過程中易產(chǎn)生過量的甲醇,進而導(dǎo)致M7酒樣甲醇含量異常[17-18]。也有多位學(xué)者研究指出在以紅棗為原料制備的發(fā)酵酒中甲醇含量較高,李堅等[19]采用新疆若羌紅棗為原料制備紅棗酒,其中甲醇的含量介于 336.95 mg/L~486.11 mg/L;黃孟陽[20]分析了紅棗酒發(fā)酵過程中甲醇含量的變化規(guī)律發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵過程中其甲醇含量最高可達(dá)601.70 mg/L,采用一系列措施對甲醇生成量進行減控后可降低至223.40 mg/L。這均表明紅棗作為原料生產(chǎn)發(fā)酵酒過程中,甲醇是其必然產(chǎn)物之一,因此極有必要建立簡單有效的方法對其進行檢測。從所測酒樣的乙醇含量分析可知,該批慕薩萊思酒樣的乙醇含量介于7.89%~14.55%,符合GB 15037—2006《葡萄酒》中乙醇含量要求(≥7%),但2/3的酒樣實際乙醇含量與標(biāo)簽標(biāo)識差異較大(>0.5%),部分樣品的乙醇含量與標(biāo)識含量差異超過2%,說明目前慕薩萊思生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品的乙醇含量測定方面存在的問題較為嚴(yán)重,有必要建議企業(yè)開展檢驗人員培訓(xùn)或采用氣相色譜法測定產(chǎn)品的乙醇含量。
本研究采用KB-PLOT Q毛細(xì)管柱,建立了氣相色譜法同時測定慕薩萊思酒樣中甲醇和乙醇含量的方法,該方法與國標(biāo)和文獻方法相比較,既具備同時測定慕薩萊思酒樣中的甲醇和乙醇含量,還具有樣品處理簡單、分析周期短、色譜峰分離度高、檢測限和定量限低、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)勢,適用于慕薩萊思及其它果酒樣品中甲醇和乙醇含量的同時測定。從樣品分析結(jié)果來看,以葡萄為原料釀造的慕薩萊思的甲醇含量均符合GB 15037—2006《葡萄酒》中對甲醇含量的要求,但原料中含有紅棗時,甲醇含量可能會超標(biāo);從慕薩萊思中乙醇含量的測定結(jié)果分析,所有樣品均符合GB 15037—2006《葡萄酒》中乙醇含量要求,但實際測定結(jié)果與標(biāo)簽標(biāo)識乙醇含量差異較大,這可能是由于慕薩萊思屬于傳統(tǒng)民族特色食品,實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的時間較晚,企業(yè)對產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)的檢測方面重視程度不夠。因此,有必要在慕薩萊思生產(chǎn)企業(yè)開展氣相色譜法測定酒樣中甲醇和乙醇含量的相關(guān)培訓(xùn)等工作,為促進新疆慕薩萊思產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展助力。