基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討防己黃芪湯治療腎性水腫的機(jī)制與通路*

袁鑫，張林，歐祥琴，王喜紅，唐閣，梁峰

（1．張家界市中醫(yī)醫(yī)院，張家界 427000；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；3．貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴陽 550001；4．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193；5．香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥研究學(xué)院，香港 999077）

水腫是腎臟疾病最常見的臨床表現(xiàn)之一[1]，多發(fā)于眼瞼或顏面，進(jìn)而蔓延至下肢，甚至全身，常伴有蛋白尿、血尿、高血壓等其他臨床癥狀[2]，其發(fā)病機(jī)制主要與腎小球?yàn)V過率改變有關(guān)，腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增生，腎小球?yàn)V過率驟降，“球-管失衡”以致水鈉潴留，發(fā)為水腫[3]。西醫(yī)對腎性水腫的治療多為對癥處理，利尿劑雖顯效較快，但易復(fù)發(fā)，且長期應(yīng)用激素會(huì)導(dǎo)致激素依賴甚至激素抵抗，不利于患者遠(yuǎn)期康復(fù)。既往研究表明，防己黃芪湯對多種原因所致的腎性水腫效果顯著[4-8]，并可逐漸降低激素使用量，減輕不良反應(yīng)，但其具體機(jī)制仍未明確[9]。

中醫(yī)本無腎性水腫之名，根據(jù)臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于“水腫”“血尿”“尿濁”等范疇，其病機(jī)不外乎本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)相兼，肺脾腎3臟虛為本；風(fēng)寒濕熱、濁毒侵犯、瘀血內(nèi)生為標(biāo)。治療大法多以溫補(bǔ)脾腎、溫陽化氣為主[2]。防己黃芪湯是《金匱要略》治療風(fēng)水的代表方，具有補(bǔ)氣健脾、除濕祛風(fēng)、利水消腫之功。其中防己、黃芪兩者配伍，祛風(fēng)利濕不傷表，固表止汗不留邪，白術(shù)健脾利濕，甘草調(diào)和藥性，諸藥相合，相得益彰。目前，防己黃芪湯治療腎性水腫臨床療效已獲肯定，各單味藥化學(xué)成分亦有報(bào)道，但中藥成分復(fù)雜，其相關(guān)機(jī)制研究仍不夠全面。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)雖已廣泛應(yīng)用于藥物靶點(diǎn)的預(yù)測，但尚缺乏實(shí)驗(yàn)或數(shù)據(jù)的支撐，說服力仍有待增強(qiáng)，故本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基礎(chǔ)上聯(lián)合分子對接技術(shù)對其進(jìn)行驗(yàn)證，通過分子對接的結(jié)合情況來探究靶點(diǎn)之間的親和力，驗(yàn)證防己黃芪湯治療腎性水腫相關(guān)通路的可行性，彌補(bǔ)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的不足，探求防己黃芪湯治療腎性水腫的潛在分子機(jī)制，為臨床疾病的治療和相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）（http：//lsp．nwu．edu．cn/tcmsp．php）篩選防己黃芪湯藥物成分靶點(diǎn)；UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www．uniprot．org/）篩選靶點(diǎn)蛋白對應(yīng)的基因；OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www．omim．org/）和 gene card 數(shù)據(jù)庫（https：//genecards．weizmann．a(chǎn)c．il/v3/）檢索腎性水腫相關(guān)的基因；String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db．org/cgi/input．pl）和 Cytoscape 3．7．1 軟件作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；基于 R Stuidio1．2．5042版本的R 4．0．0語言做基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析；利用PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www．rcsb．org/）搜索主要蛋白的結(jié)構(gòu)式；采用PyMOL 2．4．0進(jìn)行切除蛋白配體和分子對接演示；運(yùn)用 AutodockTools 1．5．6 做網(wǎng)格盒子（Grid Box）；應(yīng)用Autodock Vina做分子對接。

1.2 方法

1.2.1 藥物成分篩選 采用TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)檢索防己黃芪湯化學(xué)成分，以藥物成分的口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0．18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，建立符合標(biāo)準(zhǔn)的成分?jǐn)?shù)據(jù)列表。

1.2.2 腎性水腫相關(guān)靶標(biāo)檢測 采用genecard和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞為“Nephritis Edema，Primary nephritic edema，Secondary nephritic edema”的疾病基因信息，對目前公認(rèn)的與腎性水腫（包括原發(fā)與繼發(fā)）相關(guān)的疾病靶基因進(jìn)行篩選，建立excel數(shù)據(jù)列表；通過Microsoft excel 2013軟件的分列功能、Vlookup函數(shù)、Trim函數(shù)、宏程序等相關(guān)插件批量獲取UniProt數(shù)據(jù)庫的對應(yīng)基因，并對靶點(diǎn)基因名稱進(jìn)行校正。

1.2.3 構(gòu)建方劑成分-靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)示意圖 通過R 4．0．0中的VennDiagram程輯包，對兩份數(shù)據(jù)集取交集，得到防己黃芪湯與腎性水腫相關(guān)的潛在共同作用靶標(biāo)，并通過Cytoscape 3．7．1軟件進(jìn)行多元素間的數(shù)據(jù)可視化處理。

1.2.4 通路富集分析 通過R4．0．0中的clusterProfile、pathview、org．Hs．eg．db 等相關(guān)生物包，進(jìn)行防己黃芪湯與腎性水腫靶點(diǎn)的GO和KEGG富集分析。

1.2.5 分子對接驗(yàn)證 1）利用Cytoscape 3．7．1篩選出“藥物-疾病”靶點(diǎn)蛋白度值（Degree）排名前5位的藥物成分。2）應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)成分的結(jié)構(gòu)。3）根據(jù)配體同一性，應(yīng)用PDB數(shù)據(jù)庫下載對應(yīng)蛋白。4）利用 PyMOL2．4．0 對蛋白去水、摘除配體。5）運(yùn)用 Auto Docks Tools 1．5．6 根據(jù)配體曾經(jīng)所在位置尋找Grid Box。6）使用Autock Vina進(jìn)行分子對接，以結(jié)合能值評價(jià)受體與配體的結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 藥物成分篩選結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索防己黃芪湯，設(shè)置OB≥30%且DL≥0．18，共檢索到有效成分122個(gè)，其中防己3個(gè)，黃芪20個(gè)，甘草92個(gè)，白術(shù)7個(gè)，其中白術(shù)和黃芪共有成分1個(gè)，甘草和黃芪共有成分7個(gè)。防己黃芪湯部分活性化合物基本信息見表1。

表1 防己黃芪湯部分有效活性物質(zhì)Tab.1 Part of effective active substances in Fangji Huangqi decoction

2.2 方劑-成分-靶標(biāo)排名 根據(jù)2．1所搜索的藥物成分，使用UniProt數(shù)據(jù)庫，查詢相關(guān)靶點(diǎn)基因的信息，共獲得藥物靶基因229個(gè)，并導(dǎo)入Cytoscape 3．7．1制作網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree值篩選排名前5位的成分，見表2。

表2 根據(jù)Degree排名前5的成分和靶點(diǎn)Tab.2 Top five components and targets according to degree

2.3 腎性水腫靶標(biāo)成分篩選 根據(jù)“Nephritis edema，Primary nephritic edema，Secondary nephritic edema”這3個(gè)關(guān)鍵詞，使用OMIM、genecard數(shù)據(jù)庫，共搜索到187個(gè)與腎性水腫相關(guān)的靶基因，與2．2所得的藥物靶標(biāo)取交集，共得到39個(gè)相交基因，交集基因信息見表3。

表3 藥物-疾病靶基因交集Tab.3 Intersection of drug-disease gene

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將2．3所獲取的藥物與疾病靶標(biāo)交集導(dǎo)入String網(wǎng)，物種選擇Homo sapiens，將隨機(jī)交互可信度設(shè)置為0．4，最低評分為0．4時(shí)為中等可信度，0．7表示高可信度，0．9表示最高可信度。本研究選用中等可信度的PPI網(wǎng)絡(luò)，下載對應(yīng)的TSV格式網(wǎng)絡(luò)圖，將R4．0．0的靶點(diǎn)作條形圖，見圖1；Cytoscape 3．7．1 作 PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖1 蛋白互作條形圖Fig.1 Barplot of protein interaction

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network of protein interaction

條形圖顯示了蛋白互作度，由圖可知，較為重要的蛋白分別是白介素（IL）-6（34）、腫瘤壞死因子（TNF）（34）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）（33）、腺苷酸激酶同工酶（ATK1）（31）、IL-10（31）等。網(wǎng)絡(luò)圖中，蛋白互作度越大，所對應(yīng)的顏色越深。

2.5 GO功能和KEGG富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 利用 R4．0．0 中的 org．Hs．eg．db和clusterProfiler包對防己黃芪湯的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 功能富集分析，pvalue Cutoff=0．05，qvalue Cutoff=0．05，提取核心交互靶點(diǎn)20個(gè)，蛋白的作用機(jī)制主要與細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子結(jié)合受體、受體配體活動(dòng)、生長因子活性等因素有關(guān)。見圖3。

圖3 GO富集分析Fig.3 GO terms enrichment

2.5.2 KEGG 富集分析 利用 R4．0．0 中的 org．Hs．eg．db和clusterProfiler包對防己黃芪湯的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，設(shè)定pvalue Cutoff=0．05，qvalue Cutoff=0．05，共得到 108 條通路，提取核心通路20個(gè)，見圖4。防己黃芪湯治療腎性水腫的主要通路有晚期糖基化終產(chǎn)物與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）通路、瘧疾通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路、TNF通路、低氧誘導(dǎo)因子信號通路等。AGE-RAGE通路富集情況。見圖5。

圖4 KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment

圖5 AGE-RAGE通路富集情況Fig.5 AGE-RAGE signal pathway

2.6 分子對接驗(yàn)證 根據(jù)蛋白互作圖中排名前5位的蛋白（IL-6、TNF、VEGFA、ATK1、IL-10），在 PDB數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，共檢索出IL-6 23個(gè)，TNF 599個(gè)，VEGFA 41個(gè)，ATK1 0個(gè)，IL-10 15個(gè)。以配體作為篩選項(xiàng)，根據(jù)排名前5藥物成分（槲皮苷、山奈酚、芒柄花黃素、異鼠李素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮）的分子結(jié)構(gòu)選擇對應(yīng)的蛋白，經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)篩選，發(fā)現(xiàn)TNF-α抑制劑3EWJ和3E8R的配體結(jié)構(gòu)與藥物成分結(jié)構(gòu)類似，故對其進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。

經(jīng) PyMOL 2．4．0去除水分子后切除 3EWJ的配體642，切除3E8R的配體615，保存為pdb格式，使用 AutodockTools 1．5．6 把文件格式統(tǒng)一轉(zhuǎn)換成pdbqd，并根據(jù)原配體所在位置設(shè)置網(wǎng)格盒子相關(guān)參數(shù)，根據(jù)參數(shù)使用Autodock Vina做分子對接。

一般認(rèn)為分子對接時(shí)，結(jié)合能值越低，對接構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大，結(jié)合能小于0說明配體和受體可自發(fā)結(jié)合[10]。對接結(jié)果見表4，根據(jù)分子結(jié)合能打分比較，可見山奈酚與3EWJ和3E8R的對接結(jié)合能最低，山奈酚與3EWJ和3E8R對接時(shí)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

表4 防己黃芪湯核心成分與3EWJ和3E8R的分子對接結(jié)果Tab.4 Molecular docking results of Fangji Huangqi decoction with 3EWJ and 3E8R

3 結(jié)論

防己黃芪湯可能通過槲皮素、山奈酚、異鼠李素等化學(xué)成分作用于 IL-6、TNF、VEGFA、ATK1、IL-10等因子，進(jìn)而調(diào)控AGE-RAGE和TNF信號通路以發(fā)揮治療腎性水腫的藥效作用。

4 討論

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得防己黃芪湯的化學(xué)成分共122種，基于該活性成分的預(yù)測靶點(diǎn)共229個(gè)，腎性水腫的靶基因共189個(gè)，其中疾病基因與藥物基因配對且符合評分0．4的PPI網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)共39個(gè)，選擇度值最大的5個(gè)靶點(diǎn)做分子對接驗(yàn)證。

所得出的5個(gè)最大度值靶點(diǎn)中（IL-6，TNF，VEGFA，ATK1，IL-10），IL-6 和 TNF-α 在防己黃芪湯的治療中研究較為廣泛。在人體研究中，杜衛(wèi)軍等學(xué)者[11]認(rèn)為防己黃芪湯能通過IL-6、TNF-α改善腎病綜合征患者的炎性反應(yīng)；李玉卿等[12]的隨機(jī)對照研究發(fā)現(xiàn)防己黃芪湯能明顯降低IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平，改善慢性腎炎患者的微炎癥狀態(tài)。在動(dòng)物研究中，俞東容等[13]認(rèn)為防己黃芪湯能調(diào)節(jié)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中TGF-β、BMP-7的表達(dá)，減輕腎臟損害；范穎等[14]通過阿霉素誘導(dǎo)腎病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)防己黃芪湯能有效抑制大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF－β1）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）的表達(dá)，改善炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制腎小管轉(zhuǎn)分化、腎小管萎縮；李武等[15]在慢性腎衰大鼠模型中發(fā)現(xiàn)防己黃芪湯可下調(diào)VEGFA的表達(dá)，且VEGFA和AKT與腎臟纖維化存在一定的相關(guān)性[16]，這可能與PI3K/AKT/VEGFA通路有關(guān)[17]。上述研究表明，防己黃芪湯可通過調(diào)節(jié) IL-6、TNF、VEGFA、ATK1、IL-10來發(fā)揮治療腎性水腫的藥效作用，且這些因子與AGERAGE和TNF信號通路有關(guān)。

在52個(gè)GO富集分析中，多為細(xì)胞凋亡和增殖、炎性反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)等。細(xì)胞因子活性、生長因子活性可能是防己黃芪湯治療腎性水腫的關(guān)鍵生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者外周血單核細(xì)胞組織因子促凝活性明顯升高，這可能與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制、病程進(jìn)展相關(guān)[18]。

在108個(gè)KEGG通路中，AGE-RAGE信號通路、瘧疾信號通路、TNF信號通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路、低氧誘導(dǎo)因子信號通路的度值排名最為靠前。AGE-RAGE通路可通過改變蛋白質(zhì)的生理功能、觸發(fā)細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致濾過屏障解體、引發(fā)氧化應(yīng)激和腎臟纖維化，加快慢性腎臟病的進(jìn)展[19]。腎小球AGE的積累可使單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP－1）高表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞聚集，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積累及腎纖維化。糖尿病腎病發(fā)展的重要機(jī)制包括AGE-RAGE信號通路，此機(jī)制可激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF－κB），促進(jìn) VEGF 和 TGF－β1的產(chǎn)生，最終會(huì)引起氧化應(yīng)激，加速腎功能惡化[20]。在糖尿病腎病的研究中，一項(xiàng)生物信息學(xué)研究[21]指出，防己黃芪湯治療2型糖尿病與AGE-RAGE信號通路有關(guān)；黃芪對腎小球系膜細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，黃芪桂枝五物湯可通過阻斷AGEs/RAGE/NF-κB信號通路中組織細(xì)胞表面RAGE的表達(dá)、抑制NF-κB激活及其引發(fā)TNF-α觸發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而減輕糖尿病大鼠神經(jīng)病變[22]。而如圖4所示，TGF-β1、TNF-α、VEGF 均是AGE-RAGE 的重要組成，故防己黃芪湯治療糖尿病腎性水腫的機(jī)制可能與AGE-GARE通路有關(guān)。對其余3條通路進(jìn)行分析，瘧疾通路與腎損傷關(guān)系密切，瘧疾可通過減少血容量[23]，促進(jìn)血管收縮、溶血、腎小球免疫復(fù)合物沉積、微循環(huán)功能障礙和橫紋肌溶解[24]而致腎損傷；流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號通路可以激活 NF-κB、MAPK，促進(jìn)腎臟炎癥發(fā)生[25]；低氧誘導(dǎo)因子信號通路可誘導(dǎo)腎小管炎癥反應(yīng)和腎間質(zhì)纖維化形成[26]。通過分子對接技術(shù)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，在分子對接模型中，TNF-α抑制劑3EWJ和3E8R的配體結(jié)構(gòu)與藥物成分結(jié)構(gòu)類似，分子對接模型顯示對接結(jié)果良好，配體與受體能主動(dòng)結(jié)合，提示3EWJ和3E8R可能是山奈酚與TNF作用的靶蛋白，TNF是AGE-RAGE和TNF通路的重要組成部分，分子對接結(jié)果支持AGE-RAGE與TNF通路。

以上實(shí)驗(yàn)均為本研究所得出的相關(guān)通路提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，5條信號通路均可能是防己黃芪湯治療腎性水腫的關(guān)鍵通路，但結(jié)合既往研究與分子對接驗(yàn)證結(jié)果，筆者認(rèn)為腎性水腫的通路更可能與AGE-GARE和TNF信號通路有關(guān)，這兩條通路研究較為廣泛。既往研究發(fā)現(xiàn)加味防己黃芪湯能夠通過調(diào)控TNF-α、IL-10進(jìn)而減輕腎臟的炎性反應(yīng)，降低原發(fā)性腎病綜合征患者IL-1β、IL-6、IL-10[27]及TNF-α的表達(dá)水平，上述相關(guān)因子在兩條通路中均有表達(dá)，故防己黃芪湯很可能通過調(diào)控AGE-RAGE和TNF信號通路而改善腎性水腫。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，初步探討了防己黃芪湯治療腎性水腫的潛在作用機(jī)制。文章雖通過TCMSP得到防己黃芪湯的有效化學(xué)成分，但中藥成分之間相互作用復(fù)雜，且復(fù)方制劑影響因素較多，后期可通過UPLC、UPLC-Q-TOF-MS等方法對防己黃芪湯成分進(jìn)行檢測，本課題組將在后續(xù)研究中設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)以進(jìn)行驗(yàn)證。