易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化技術(shù)提高蒙古黃芪病程相關(guān)蛋白AmPR-10核酸酶活性的研究

王 玨，吳 娜，張育敏，閆海洋，胡麗麗

(山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030600)

病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein,PR)是植物在遭受病原菌侵害或外界環(huán)境壓力下產(chǎn)生的一種抗逆的、有利于自身生長(zhǎng)發(fā)育的蛋白質(zhì)，分為17個(gè)家族，其中PR-10類蛋白具有核酸酶活性[1]，被認(rèn)為與降解RNA類病毒有關(guān)[2]。蒙古黃芪病程相關(guān)蛋白-10(Astragalusmembranaceuspathogenesis-related protein-10，AmPR-10)由158個(gè)氨基酸殘基組成，分子大小約為16.8 kDa。目前已有研究證明天然提取的和重組的AmPR-10都具有核酸酶活性，但是活力均偏低[3-4]，不利于更深入的研究及大范圍的應(yīng)用。

酶分子的定向進(jìn)化是由美國(guó)科學(xué)家Arnold F H于1993年首先提出，技術(shù)理念是通過模擬自然進(jìn)化機(jī)制，對(duì)酶基因進(jìn)行體外修飾，產(chǎn)生基因多樣性，利用高通量篩選技術(shù)，獲得具有預(yù)期特性的修飾酶[5]。定向進(jìn)化可利用多種手段誘導(dǎo)目的基因堿基發(fā)生增添、缺失、替換等突變，代表性的方法為易錯(cuò)PCR[6]。易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化技術(shù)不需要對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有充分的了解，目前已在獲取高活性的幾丁質(zhì)酶A[7]、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶[8]、β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶[9]等方面得到了應(yīng)用。

作者所在課題組[4]前期利用大腸桿菌表達(dá)體系構(gòu)建了AmPR-10的2個(gè)重組子：pET30a-AmPR-10及pET30a-skp-AmPR-10，其中skp是來源于大腸桿菌的分子伴侶，由161個(gè)氨基酸構(gòu)成。外源誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示分子伴侶skp修飾后，AmPR-10表達(dá)量顯著提高。因此，作者選擇分子伴侶skp修飾的AmPR-10全基因skp-AmPR-10為研究對(duì)象，通過易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化技術(shù)篩選核酸酶活性提高的AmPR-10突變體，為進(jìn)一步探索AmPR-10的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，為其它同源蛋白的基因定向進(jìn)化提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

重組子pET30a-skp-AmPR-10由山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院克隆合成。

感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21、質(zhì)粒提取試劑盒、超級(jí)感受態(tài)制備試劑盒、蛋白純化試劑盒、96孔細(xì)菌培養(yǎng)板、2×Taq PCR Master Mix，生工生物工程(上海)有限公司；限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

TC-XP-G型PCR儀，杭州博日科技有限公司；TGL23M型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；BSD-400型振蕩培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；01A037型超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；WD-9413B型凝膠成像分析儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AmPR-10基因定向進(jìn)化模板的選擇

參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行重組子pET30a-AmPR-10及pET30a-skp-AmPR-10構(gòu)建過程中skp及AmPR-10的擴(kuò)增、引物的設(shè)計(jì)、重組子的克隆、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)等。通過比較重組子pET30a-AmPR-10及pET30a-skp-AmPR-10對(duì)目的基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)后者可溶性表達(dá)量更高，因此，確定pET30a-skp-AmPR-10為目的基因定向進(jìn)化的野生型。

1.2.2 目的基因skp-AmPR-10的易錯(cuò)PCR

以重組子pET30a-skp-AmPR-10的質(zhì)粒為易錯(cuò)PCR模板，在PCR體系中添加不同濃度(0 mmol·L-1、0.1 mmol·L-1、0.2 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1)的Mn2+以確定合適的突變率。以skp-AmPR-10作為目的基因設(shè)計(jì)上下游引物，上游引物：5′-CTAGCCATGGTGAAAAAGTGGTTATTAGCT-3′(劃線部分為限制性內(nèi)切酶NcoⅠ的酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-CCGCTCGAGCTTGTATTCAGGATTGGCCA-3′(劃線部分為限制性內(nèi)切酶XhoⅠ的酶切位點(diǎn))。PCR體系為：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，質(zhì)粒模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，氯化錳溶液1 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。

1.2.3 超級(jí)感受態(tài)的制備及突變體文庫的構(gòu)建

將獲得的含有一定突變率的目的基因經(jīng)過酶切回收后與載體pET30a連接，將連接產(chǎn)物加入到提前取出冰上融化的E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，按超級(jí)感受態(tài)制備試劑盒操作說明制備轉(zhuǎn)化效率更高的超級(jí)感受態(tài)。將復(fù)活后的菌液涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)30 min后，將培養(yǎng)皿倒置過夜培養(yǎng)，構(gòu)建轉(zhuǎn)化子數(shù)量較高的突變體文庫。

1.2.4 單克隆的誘導(dǎo)表達(dá)

將固體培養(yǎng)基上的菌落逐個(gè)挑到96孔細(xì)菌培養(yǎng)板中(每孔含200 μL已添加抗生素的LB培養(yǎng)基)，于37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)12～16 h；然后以2%的接種量將各孔中的菌液轉(zhuǎn)接到新的96深孔板中(每孔含500 μL已添加抗生素的LB培養(yǎng)基)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，剩余菌液與甘油以7∶3的比例混勻作為母板于-80 ℃冰凍保存；離心收集誘導(dǎo)后的菌體，于-80 ℃過夜凍存；每孔加入200 μL的RIPA細(xì)胞裂解液，于37 ℃放置1～2 h使菌體裂解；于4 ℃、4 000 r·min-1離心20 min，取上清，測(cè)定目的蛋白活性(以O(shè)D260值表征)。

1.2.5 高通量篩選方法的構(gòu)建

以酵母tRNA為底物，構(gòu)建AmPR-10核酸酶活性檢測(cè)的高通量篩選方法。具體如下：配制2 mg·mL-1的酵母tRNA溶液，于96孔紫外酶標(biāo)板中每孔加入50 μL酵母tRNA溶液與50 μL 菌體裂解后的蛋白液(以野生型蛋白液為對(duì)照)，37 ℃反應(yīng)30 min；反應(yīng)結(jié)束后通過酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)體系的OD260值(測(cè)3組平行數(shù)據(jù)，取平均值)，與對(duì)照組進(jìn)行比較，篩選正向突變體。

1.2.6 突變體的復(fù)篩

高通量篩選方法建立的體系是微量的，在一定程度上存在誤差，常用于目的基因定向進(jìn)化的初篩。為進(jìn)一步測(cè)定突變體的表達(dá)及活性，將初篩得到的突變體進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，超聲破碎菌體獲得目的蛋白；通過SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，純化突變體蛋白；通過考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。以酵母tRNA為底物，擴(kuò)大反應(yīng)體系，測(cè)定蛋白比活[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 易錯(cuò)PCR Mn2+濃度的確定

分子伴侶skp由483個(gè)堿基組成(不包括終止密碼子)，AmPR-10由477個(gè)堿基組成(包括終止密碼子)，所以全基因skp-AmPR-10的擴(kuò)增條帶大小為960個(gè)堿基。在PCR體系中，分別加入不同濃度Mn2+的目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定結(jié)果如圖1所示。

M.DNA marker 1～6,Mn2+濃度(mmol·L-1):0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5

由圖1可以看出，加入不同濃度Mn2+的目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物均在960 bp處顯示明顯條帶；Mn2+可以降低PCR過程中Taq聚合酶的保真性，隨著Mn2+濃度的增加，突變率升高，條帶亮度也隨之降低。因此，既要保證有一定的突變率，又要保證PCR產(chǎn)物量足夠，選擇0.3 mmol·L-1Mn2+進(jìn)行突變體基因的擴(kuò)增。

2.2 高通量篩選AmPR-10突變體結(jié)果

第一輪定向進(jìn)化共篩選單克隆890個(gè)，然后通過高通量篩選方法測(cè)定96孔細(xì)菌培養(yǎng)板中所有單克隆突變體核酸酶活性(OD260值)，并計(jì)算扣除緩沖液樣品對(duì)照平均值后的OD260值，結(jié)果見表1。

表1 突變體核酸酶活性檢測(cè)原始數(shù)據(jù)及扣除緩沖液樣品對(duì)照平均值后的OD260值

由表1可知，位于A4位置的突變體的核酸酶活性明顯提高；緩沖液樣品對(duì)照E1、F1、G1、H1的原始數(shù)據(jù)平均值為3.426，野生型樣品對(duì)照A1、B1、C1、D1的扣除數(shù)據(jù)平均值為0.082，而突變體A4的扣除數(shù)據(jù)(0.155)最大。表明突變體A4的核酸酶活性可能較野生型有所提高，需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩。

2.3 突變體A4核酸酶活性的復(fù)篩和基因測(cè)序

野生型蛋白及突變體A4蛋白的表達(dá)及純化結(jié)果如圖2所示。

M.蛋白質(zhì)marker 1,3,5分別為野生型蛋白未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)及純化后的鑒定結(jié)果 2,4,6分別為突變體A4蛋白未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)及純化后的鑒定結(jié)果

skp與AmPR-10融合表達(dá)后，蛋白大小約為34 kDa。由圖2可以看出，突變體A4蛋白誘導(dǎo)和純化后的SDS-PAGE圖譜均在約34 kDa處出現(xiàn)明顯條帶(泳道4、6)，符合預(yù)期；并且與野生型(泳道3、5)相比，突變體A4的表達(dá)量并沒有明顯減少，說明基因突變沒有影響目的蛋白的可溶性表達(dá)。

分別對(duì)野生型蛋白及突變體A4蛋白進(jìn)行純化，測(cè)定蛋白濃度；以酵母tRNA為底物，測(cè)定兩者的比活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型蛋白的比活為1.1 U·mg-1，突變體A4蛋白的比活為1.6 U·mg-1，較野生型提高45%。

野生型蛋白及突變體A4蛋白的基因測(cè)序結(jié)果如圖3所示。

圖3 野生型蛋白及突變體A4蛋白的基因測(cè)序結(jié)果

由圖3可以看出，與野生型蛋白相比，突變體A4蛋白在465位處多了一個(gè)堿基A，使得第153個(gè)氨基酸密碼子由CCT突變?yōu)镃CA，但均編碼脯氨酸，并導(dǎo)致后續(xù)基因排列的移碼突變。很有意思的現(xiàn)象是，由于移碼的出現(xiàn)，使得原來第154個(gè)氨基酸密碼子變?yōu)門GA終止密碼子，因此，突變體A4在蛋白編碼過程中會(huì)提前終止，與野生型蛋白相比，缺少末端3個(gè)氨基酸，依次為：谷氨酸(Glu)、酪氨酸(Tyr)、賴氨酸(Lys)。而且實(shí)驗(yàn)證明這3個(gè)氨基酸的缺失并沒有影響目的蛋白的表達(dá)和活性，這一結(jié)果對(duì)探討AmPR-10核酸酶活性機(jī)制具有重要參考意義。

通過SWISS-MODE建模，獲得野生型蛋白和突變體A4蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使用Chimera軟件對(duì)其進(jìn)行初步分析，結(jié)果如圖4所示。

由圖4a可以看出，突變體A4蛋白缺失的3個(gè)氨基酸位于AmPR-10空間結(jié)構(gòu)C末端的一段長(zhǎng)α螺旋上(在SWISS-MODE建模中，最后一位賴氨酸沒有顯示)，已有研究[10]報(bào)道，這段區(qū)域?qū)τ贏mPR-10展現(xiàn)核酸酶活性而言，保守性不強(qiáng)，可以作為基因定向進(jìn)化的參考位點(diǎn)，而突變體A4蛋白的測(cè)序結(jié)果也對(duì)這一理性分析提供新的證據(jù)；另一方面，C末端的α螺旋結(jié)構(gòu)猶如手柄狀，對(duì)AmPR-10的空腔形成遮蔽作用，而空腔具有配體結(jié)合活性，在目的蛋白抗逆過程中發(fā)揮作用[11]。因此突變體A4在缺失了3個(gè)氨基酸后，α螺旋的長(zhǎng)度縮短，進(jìn)而對(duì)空腔的遮蔽作用減小，有利于蛋白與配體或底物的結(jié)合，這或許是突變體A4核酸酶活性提高的原因。

圖4 野生型蛋白(a)和突變體A4蛋白(b)的空間結(jié)構(gòu)示意圖

2.4 討論

(1)選擇分子伴侶skp修飾的AmPR-10全基因skp-AmPR-10為研究對(duì)象，這一策略使分子伴侶skp分擔(dān)了定向進(jìn)化過程中的突變壓力，可以避免僅以AmPR-10為目的基因時(shí)，進(jìn)化范圍(基因片段)較小而造成易死突變的現(xiàn)象，并且在一定程度上推遲進(jìn)化平臺(tái)期的出現(xiàn)，增加突變的多樣性。研究方法利于正向突變體的篩選。

(2)以分子伴侶skp與AmPR-10串聯(lián)的全基因?yàn)槟０?skp位于AmPR-10上游)，進(jìn)行了一輪易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變定向進(jìn)化，得到了1個(gè)活性提高的突變體A4，其活性并沒有達(dá)到理想狀態(tài)，僅比野生型提高45%，其空間結(jié)構(gòu)的C末端缺失了3個(gè)氨基酸(谷氨酸、酪氨酸、賴氨酸)，但并未影響到目的蛋白的表達(dá)和活性。因此在后續(xù)研究中，可考慮以突變體A4為基礎(chǔ)，進(jìn)行第二輪定向進(jìn)化，篩選活性進(jìn)一步提高的突變體；或結(jié)合分子伴侶的作用，針對(duì)skp進(jìn)行改造，通過優(yōu)化目的蛋白的折疊和表達(dá)，實(shí)現(xiàn)核酸酶活性提高的目的。篩選核酸酶活性提高的AmPR-10突變體，是一項(xiàng)持續(xù)而重要的工作，在此過程中，可逐步挖掘影響其活性的關(guān)鍵位點(diǎn)或區(qū)域，從而得到高活性的AmPR-10，這對(duì)優(yōu)化蒙古黃芪育種、降低種植過程中病原體侵襲造成的損失具有重要意義。

3 結(jié)論

以分子伴侶skp修飾的AmPR-10全基因?yàn)槟０澹ㄟ^易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化技術(shù)構(gòu)建突變體文庫，以酵母tRNA為底物建立高通量篩選方法，獲得了核酸酶活性提高的AmPR-10突變體。突變體A4的核酸酶活性比野生型提高45%；基因序列在465位增加了1個(gè)堿基A，C末端缺失了3個(gè)氨基酸，從而減小了其C末端α螺旋對(duì)空腔的遮蔽作用，有利于目的蛋白與配體或底物的結(jié)合。該研究結(jié)果對(duì)AmPR-10核酸酶活性機(jī)制的探討具有重要意義，為抗病抗逆黃芪植株的培育奠定了理論基礎(chǔ)。