噪聲損傷引起小鼠耳蝸炎癥復(fù)合體NLRP3激活及氫氣的抑制作用

劉達(dá) 塞娜 秦含黛 王建澤 孫健斌 張桐 郭維維 于寧 韓維舉

解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部；國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（北京 100853）

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球約有15億人患有某種程度的聽力損失，其中約4.3億人需要針對聽力損失的康復(fù)服務(wù)[1]。噪聲性耳聾是平、戰(zhàn)時造成聽力損傷的主要原因，不僅影響個人心身健康,也為社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[2,3]。噪聲可以引起內(nèi)耳炎癥[4]，NLR家族含吡咯結(jié)構(gòu)域3（NLRP3）表達(dá)增加，并通過激活下游的半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)及炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6介導(dǎo)了內(nèi)耳的損傷[5,6]。氫氣具有顯著的抗炎作用，但其防治噪聲性耳聾的機制尚不完全清楚。本研究為探索氫氣干預(yù)是否可以通過抑制噪聲后內(nèi)耳NLRP3的表達(dá)從而保護聽力。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

6周齡雄性C57BL/6小鼠購于北京斯貝福生物有限公司。使用隨機數(shù)法分為對照組、噪聲組及噪聲+氫氣組各10只。噪聲組給予120dB SPL白噪聲4小時，將小鼠固定在金屬籠中限制活動，噪聲開始和結(jié)束時使用聽級計測量每個金屬籠噪聲強度為120±1dB。噪聲+氫氣組給予吸入氫氣2h后，給予相同條件噪聲暴露，次日繼續(xù)每日吸入氫氣2小時，共7天。氫氣由Healthgen AMS-H-01制氫機產(chǎn)生后通過管道輸入臨時飼養(yǎng)箱，氣體檢測儀測定箱內(nèi)氫氣濃度穩(wěn)定在大于1000 ppm。對照組不給予噪聲及氫氣處理。聽性腦干閾值反應(yīng)（auditory brainstem response,ABR）測試使用美國TDTⅢ測聽設(shè)備和Biosig軟件系統(tǒng)進行測試，方法如文獻(xiàn)所述[6]。本實驗通過解放軍總醫(yī)院實驗動物福利倫理審查。

1.2 取材及免疫熒光

表面制備法耳蝸鋪片，用于本實驗的一抗有：兔抗 NLRP3多克隆抗體（abcam,ab214185）,兔抗caspase-1多克隆抗體（abcam,ab1872），二抗有Al‐exa Fluor 488羊抗兔IgG抗體，Alexa Fluor 568羊抗兔IgG抗體。充分漂洗后用含DAPI甘油封片。使用蔡司共聚焦顯微鏡選擇405nm（藍(lán)色）、488nm（綠色）及555nm（紅色）波長的激發(fā)光對標(biāo)本進行觀察，以0.26μm厚度層掃標(biāo)本，使用ZEN（blue 2.3 Sp）軟件將圖片通過正交投影疊加處理。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）

Western Blot法定量分析各組小鼠耳蝸NLRP3及caspase-1表達(dá)。分別在噪聲后1天，7天處死動物，提取整個耳蝸蛋白質(zhì),聚丙烯酸胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉,加入抗NLRP3（abcam，ab4207）、抗caspase-1（abcam，ab1872，1:2000）及抗β-actin（immunoway，YM3028）一抗，4℃孵育過夜,次日加入相應(yīng)二抗在室溫孵育1小時，通過凝膠成像系統(tǒng)成像。使用Image J圖像分析軟件測量條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度比值作為相對含量進行統(tǒng)計分析。

1.4 小鼠耳蝸淋巴液提取及炎癥因子檢測

噪聲后7天處死小鼠并取出耳蝸，顯微鑷在耳蝸蝸頂破孔，移液槍抽出淋巴液。每組提取5只小鼠耳蝸淋巴液（共10耳），離心后取10μl上清液，稀釋5倍后進行檢測。ELISA法檢測稀釋液中的IL-1β、IL-6及IL-10濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程并計算炎癥因子濃度值,將濃度值乘以稀釋倍數(shù)得出其在淋巴液中的實際濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間使用成組t檢驗進行比較，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 噪聲暴露及氫氣干預(yù)對耳蝸炎癥復(fù)合體表達(dá)的影響

噪聲后7天取材,使用鬼筆環(huán)肽（phalloidin）與抗NLRP3一抗共染色（圖1a），對照組NLRP3在耳蝸毛細(xì)胞中少量表達(dá)，噪聲組毛細(xì)胞NLRP3熒光強度增強，以內(nèi)毛細(xì)胞更為明顯。噪聲+氫氣組NLRP3熒光強度弱于噪聲組。分別在噪聲后1天、7天取各組耳蝸進行Western Blot實驗，對照組耳蝸內(nèi)NLRP3少量表達(dá)，噪聲組和噪聲+氫氣組在噪聲后1天表達(dá)均顯著增加（P<0.05），但此時噪聲組與噪聲+氫氣組間無顯著差異。噪聲后第7天噪聲+氫氣組比噪聲組顯著降低（P<0.05）（圖1b，c）。

圖1 各組NLRP3免疫熒光染色及Western Blot結(jié)果。a：基底膜鋪片顯示各組小鼠耳蝸毛細(xì)胞NLRP3表達(dá)情況。通過鬼筆環(huán)肽標(biāo)記毛細(xì)胞（綠色熒光），NLRP3（紅色熒光），DAPI標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色熒光），噪聲組NLRP3（箭頭所指）熒光強度較其他兩組強；b：各組小鼠耳蝸NLRP3 Western Blot結(jié)果。從左至右分別為對照組、噪聲組噪聲后1天、噪聲+氫氣組噪聲后1天、噪聲組噪聲后7天、噪聲+氫氣組噪聲后7天；c：各組NLRP3蛋白含量，n=18。*與對照組比P<0.05;#與噪聲組7天比P<0.05.對照組（Ctrl）、噪聲組（NE）和噪聲+氫氣組（NE+HR）。Fig.1 Immunofluorescence and Western Blot results of NL‐RP3 in each group.a:Hair cells were labeled with phalloidin(green),NLRP3(red),nuclear was labeled with DAPI(blue),NLRP3 fluorescence intensity was increased in hair cells after noise exposure(arrow).b:Western Blot result of NLRP3 ex‐pression level of each group.c:NLRP3 expression of each group,n=18;*vs ctrl group,P<0.05;#vs NE 7 days,P<0.05.

2.2 噪聲損傷及氫氣干預(yù)對耳蝸caspase-1的影響

噪聲后7天取基底膜進行免疫熒光，進行毛細(xì)胞與caspase-1共染色（圖2a），對照組基底膜cas‐pase-1表達(dá)較低,噪聲后毛細(xì)胞內(nèi)caspase-1表達(dá)增強,噪聲組噪聲暴露后毛細(xì)胞caspase-1表達(dá)較噪聲+氫氣組更為明顯。分別在噪聲后1天、7天取耳蝸進行Western Blot實驗，對照組耳蝸內(nèi)caspase-1少量表達(dá)，與對照組相比，噪聲組噪聲后1天顯著升高（P<0.05），噪聲+氫氣組表達(dá)升高但無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3b）。噪聲后第7天噪聲+氫氣組比噪聲組顯著降低（P<0.05）（圖2b，c）。

圖2 各組caspase-1免疫熒光染色及Western Blot結(jié)果。a：基底膜鋪片各組顯示caspase-1表達(dá)情況。通過鬼筆環(huán)肽標(biāo)記毛細(xì)胞（紅色熒光），caspase-1（綠色熒光），DAPI標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色熒光），噪聲組caspase-1（箭頭所指）熒光強度較其他兩組強；b：各組小鼠耳蝸caspase-1 Western Blot結(jié)果。從左至右分別為對照組、噪聲組噪聲后1天、噪聲+氫氣組噪聲后1天、噪聲組噪聲后7天、噪聲+氫氣組噪聲后7天；c：各組caspase-1蛋白相含量，n=18。*與對照組比P<0.05;#與噪聲組7天比，P<0.05.對照組（Ctrl）、噪聲組（NE）和噪聲+氫氣組（NE+HR）。Fig.2 Immunofluorescence and Western Blot results of cas‐pase-1 in each group.a:Hair cells were labeled with phalloi‐din(red),caspase-1(green),nuclear was labeled with DAPI(blue),caspase-1 fluorescence intensity was increased after noise exposure in hair cells(arrow).b:Western Blot result of caspase-1 expression level of each group.c:caspase-1 expres‐sion of each group,n=18;*vs ctrl group,P<0.05;#vs NE 7 days,P<0.05.

2.3 小鼠耳蝸淋巴液炎癥因子濃度測定

與對照組相比,噪聲組耳蝸淋巴液IL-1β（P<0.05）、IL-6升高（P<0.01），IL-10降低（P<0.05）。與噪聲組相比噪聲+氫氣組IL-1β顯著降低（P<0.05）、IL-6顯著降低（P<0.01），IL-10顯著增加（P<0.01）（圖3）。

圖3 各組耳蝸淋巴液中炎癥因子濃度測定，n=18。a：IL-1β濃度柱狀統(tǒng)計圖；b：IL-6濃度柱狀統(tǒng)計圖；c：IL-10濃度柱狀統(tǒng)計圖。*P<0.05；**P<0.01.Fig.3 The concentrations of inflammatory factors in the lym‐phatic fluid of each group.a:The column chart of IL-1β con‐centration in each group.b:The column chart of IL-6 concen‐tration in each group,n=18.c:The column chart of IL-10 con‐centration in each group.*P<0.05;**P<0.01.

2.4 ABR測試結(jié)果

小鼠在噪聲暴露前，暴露后1天和7天分別進行ABR測試。噪聲暴露后噪聲組及噪聲+氫氣組的ABR反應(yīng)閾值較對照組顯著升高（P<0.05），氫氣干預(yù)1天后與噪聲組相比ABR閾值無顯著差異（P>0.05）。7天后兩組小鼠聽力均有不同程度恢復(fù)（圖4），氫氣干預(yù)后較噪聲組降低，在24kHz閾值具有顯著性（P<0.05）。

圖4 對照組（紅色）以及噪聲組（藍(lán)色）和噪聲+氫氣組（綠色）在噪聲后7天ABR閾值，n=24（48 ears）。Fig.4 ABR thresholds of control group（red）,noise group（blue）and noise+hydrogen group（green）7 days after noise exposure ，n=24（48 ears）.

3 討論

在日常生活及軍事行動中，噪聲對耳蝸的損傷及由此引起的聽力下降比較常見。在我國現(xiàn)役殲擊機的發(fā)動機艙口噪聲強度在117～130dB（A）之間，有調(diào)查發(fā)現(xiàn)殲擊機飛行員和地勤人員中有近半數(shù)存在高頻聽力下降[7]。針對目前部隊訓(xùn)練、和工業(yè)活動中噪聲暴露影響著眾多年輕人，且缺乏有效的藥物用于噪聲性耳聾防治。在此研究中我們使用120dB SPL的噪聲強度，是軍事活動和工廠作業(yè)中常能達(dá)到的水平，可以造成小鼠聽力永久性閾移[8]。

噪聲可以引起強氧化作用的自由基在內(nèi)耳堆積，促使炎癥因子與趨化因子介導(dǎo)耳蝸炎癥細(xì)胞聚集，是噪聲性耳聾發(fā)病的重要機制之一[9-11]。近年來發(fā)現(xiàn)炎癥復(fù)合體NLRP3在內(nèi)耳炎癥中扮演重要角色[12,13]。NLRP3包括由識別分子、連接分子和效應(yīng)分子組成，在正常細(xì)胞中普遍表達(dá)，但只有過表達(dá)到一定程度時，才會引起下游炎癥因子釋放[14,15]。Toll-like receptors（TLR）、含核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域的蛋白2（NOD2）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GMCSF）受體和腫瘤壞死因子（TNF）受體參與了NLRP3基因的轉(zhuǎn)錄啟動。這些受體激活后引起轉(zhuǎn)錄因子的升高,可以和核因子NF-κB共同促進多種促炎基因的轉(zhuǎn)錄,釋放更多炎癥因子。

噪聲后NLRP3和caspase-1在小鼠耳蝸毛細(xì)胞中表達(dá)增加,二者在噪聲后1天即顯著升高，7天后下降并接近噪聲前水平，說明NLRP3參與了噪聲早期對毛細(xì)胞的損傷過程，并可能存在caspase-1介導(dǎo)的“細(xì)胞焦亡”[16]。過度表達(dá)的NLRP3剪切pro-caspase-1成為有活性的caspase-1，直接或間接促發(fā)釋放IL-1、IL-6等多種促炎性細(xì)胞因子。IL-1β可以通過激活MAPK/JNK信號通路，引起線粒體功能障礙和毛細(xì)胞凋亡[17]。IL-6則通過募集免疫細(xì)胞損傷聽覺神經(jīng)上皮細(xì)胞[18]，引起聽力損失。耳蝸淋巴液中的炎癥因子濃度可以很好的反映內(nèi)耳炎癥程度，噪聲后第7天淋巴液中的IL-1β和IL-6仍顯著高于對照組，說明噪聲引起的炎癥損傷過程仍在持續(xù)。

氫氣作為一種安全無害的小分子氣體，目前已被證實具有抗炎和抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)氫氣可以有選擇的清除有害自由基,對保持細(xì)胞正常功能而毒性較弱的過氧化氫、NO等作用較弱[19-22]，并可以抑制病理過程中炎癥復(fù)合體的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)[23]。氫氣良好的抗炎效果已得到臨床試驗驗證，安全無害的特點使其具有廣闊的臨床前景[24]。文獻(xiàn)報道氫氣可以抑制腦損傷、缺血再灌注和腫瘤等多種疾病中炎癥復(fù)合體的表達(dá)[25-27]，并在炎癥病理過程中發(fā)揮顯著的抑制作用，但氫分子抑制內(nèi)耳炎癥的作用機制與靶點尚不完全清楚。近期研究發(fā)現(xiàn)氫氣對噪聲引起的毛細(xì)胞缺失具有很好的防護效果，在給予2小時的氫氣吸入后進行噪聲暴露，可以發(fā)揮最大保護效果[28]。本研究中噪聲+氫氣組ABR閾值均比噪聲組降低，但只有24kHz具有顯著性，下一步應(yīng)當(dāng)增加樣本量以完善聽力結(jié)果。此外，我們還檢測了小鼠耳蝸淋巴液中抑炎因子IL-10的濃度，發(fā)現(xiàn)噪聲后IL-10的含量顯著降低而氫氣干預(yù)后IL-10的濃度顯著升高。氫氣引起IL-10升高的機制仍需進一步的研究。

綜上所述,噪聲后小鼠耳蝸內(nèi)NLRP3激活并損傷毛細(xì)胞,抑制NLRP3激活可能是氫氣起到預(yù)防作用的分子靶點，進而減少了毛細(xì)胞凋亡，保護聽力。下一步我們將開展氫氣防治軍事噪聲性耳聾的臨床試驗，探索氫氣保護聽力的臨床價值。