復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)D-半乳糖致PC12神經(jīng)細(xì)胞衰老的改善作用研究

熱孜艷木·亞森，買(mǎi)吾拉尼江·依孜布拉，祖麗菲亞·吾斯曼，迪那拉·恰熱甫汗，買(mǎi)爾旦·玉蘇甫，巴吐?tīng)枴べI(mǎi)買(mǎi)提明

（新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院;2中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011）

細(xì)胞衰老是由過(guò)度的細(xì)胞內(nèi)外壓力或細(xì)胞損害引起的，生長(zhǎng)長(zhǎng)期停滯在細(xì)胞周期G1期的一種狀態(tài)，隨著年齡的延長(zhǎng)，體內(nèi)會(huì)逐漸積累衰老細(xì)胞并引發(fā)與年齡有關(guān)的多種疾病，如骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、各種神經(jīng)退行性疾病例如阿爾茨海默癥等[1]。復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮是由甘草根（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、小茴香（Foeniculum vulgareMill.）、洋茴香（Pimpinella AnisumL.）、葡萄干（Seedless Grape）、玫瑰花（Rose）、無(wú)花果（Ficus carica Linn）、鐵線蕨（Adian?tum capillus-venerisL.）七味藥材所組成的中藥復(fù)方提取所得，該復(fù)方富含多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、苷類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、酚類(lèi)、皂苷類(lèi)、花青素類(lèi)以及三萜類(lèi)成分，具有抗炎、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化等作用[2]。有研究表明，總黃酮通過(guò)調(diào)節(jié)HEPG2細(xì)胞中SOD、GSR 和CAT 等氧化應(yīng)激關(guān)鍵因子的mRNA 表達(dá)能力，降低ROS 水平進(jìn)而達(dá)到抗氧化效果[3]，此外總黃酮還能夠清除過(guò)多自由基、預(yù)防脂質(zhì)過(guò)氧化及增強(qiáng)免疫功能來(lái)延緩機(jī)體的衰老過(guò)程[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方通過(guò)改善對(duì)D-半乳糖導(dǎo)致衰老模型小鼠的亮氨酸、異亮氨酸等生物合成，改善?；撬?、甘氨酸等能量代謝途徑出現(xiàn)的紊亂，以達(dá)到延緩衰老的效果[6]。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從復(fù)方鐵線蕨顆粒中提取的總酚和總黃酮對(duì)HeLa、SiHa 和C-33A 宮頸癌細(xì)胞有顯著的抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖作用[7]。本研究采用D-半乳糖誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模擬衰老模型，探討復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12衰老細(xì)胞的保護(hù)作用及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器HHW-420-2S 型恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；KS12 型超凈工作臺(tái)（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；371 型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（英國(guó)賽默飛公司）；BA210 型倒置顯微鏡（德國(guó)Mtic 公司）；KS12 型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；Multiskan GO 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；BD LSR II型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences 公司）；EYELA CAA-1111 型冷卻裝置（上海愛(ài)郎儀器有限公司）；EYELA N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)郎儀器有限公司）；UV-2550PC 型紫外分光光度儀（日本島津公司）。

1.2 試劑胎牛血清（以色列Biological Industries 公司，批號(hào)：1903226）；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、雙抗、PBS、0.25%胰蛋白酶、7-AAD 偶聯(lián)Annexin V-PE 凋亡測(cè)試試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：O21118、O40902、O21023、N91125、O20410）；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT，賽國(guó)生物科技公司，批號(hào)EZ3412B205)；細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡試劑盒、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：120919200526、122019200413）；D-半乳糖（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：WXBD1291V）；LDH、MDA、SOD 試劑盒（南京建成生物 工 程 研 究 所，批 號(hào)：20200710、20200704、20200713）。標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：YM0316SA13）；30-60、60-100目聚酰胺（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠，批號(hào)：20121022）。

1.3 藥材本復(fù)方由甘草根、小茴香、洋茴香、葡萄干、玫瑰花、無(wú)花果、鐵線蕨等藥材組成，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院藥劑科副主任藥師阿卜瓦爾鑒定。

1.4 細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞株購(gòu)自上海賽百慷生物有限公司。

1.5 方法

1.5.1 復(fù)方鐵線蕨顆粒總黃酮的提取及含量測(cè)定將400 g 的復(fù)方鐵線蕨粉末采用水提醇沉法提取，提取液過(guò)濾并將濾液減壓濃縮，干燥。將30～60目的250 mg 聚酰胺樹(shù)脂用95%無(wú)水乙醇活化裝，將已干燥的樣品用70%乙醇溶解準(zhǔn)備15 mg/mL 溶液，上柱，pH 為5。以1.0 mL/min 的流速洗脫，待色帶流到柱底時(shí)停止洗脫，靜置12 h吸附。用3倍柱體積量的水洗脫并棄洗脫液，再用2倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮干燥呈干粉。在相同條件下將干粉再過(guò)一次裝60～100 目聚酰胺樹(shù)脂的柱子，洗脫液收集減壓干燥成干粉備用。參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定。

1.5.2 D-半乳糖致PC12細(xì)胞衰老模型的建立 使用D-半乳糖干預(yù)PC12 細(xì)胞建立衰老細(xì)胞模型，MTT 法篩選D-半乳糖最佳給藥濃度。將PC12 細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種于96 個(gè)孔板，放置37℃含有5%的CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后次日換液，陰性對(duì)照組孔（無(wú)細(xì)胞）和空白組（有細(xì)胞）孔加200 μL 的完全培養(yǎng)基，模型組孔加200 μL 含有D-半乳糖的培養(yǎng)基使其終濃度為8、16、32、64 mg/mL，繼續(xù)孵育至48 h，棄上清液加MTT 溶液20 μL 并孵育4～6 h 后吸取上清液再加150 μL DMSO，振蕩10 min 使紫色結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值，每組設(shè)6個(gè)平行孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率=（模型組OD 值-陰性對(duì)照組OD 值）/（空白組OD值-陰性對(duì)照組OD值）×100%。

1.5.3 復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞的保護(hù)作用 將細(xì)胞每孔按1×105個(gè)的密度接種于實(shí)驗(yàn)所需孔板，放置37℃含有5%的CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后次日換液，空白組孔和模型組孔加200 μL 的完全培養(yǎng)基，給藥組孔加200 μL 的含有復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮的培養(yǎng)液使其終濃度為8.5、17、34 μg/mL并繼續(xù)孵育24 h 后換液，空白組孔加200 μL 的完全培養(yǎng)基，模型組和低、中、高劑量的給藥組孔加含有D-半乳糖的培養(yǎng)基200 μL 使其終濃度為16 mg/mL，繼續(xù)孵育至48 h，以檢測(cè)復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞的活力、凋亡、周期以及抗氧化能力。

1.5.4 復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞活力的影響 采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力。將PC12 細(xì)胞每孔按1×105個(gè)的密度接種于96 微孔板，按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理PC12 細(xì)胞，吸取細(xì)胞上清液，每組加入MTT 溶液20 μL，孵育4~6 h 后加150 μL 的DMSO，振蕩10 min 使紫色結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組孔（無(wú)細(xì)胞，給予完全培養(yǎng)基），每組設(shè)6個(gè)平行孔，每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率=（給藥組或模型組OD 值-陰性對(duì)照組OD 值）/（空白組OD 值-陰性對(duì)照組OD值）×100%。

1.5.5 復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞數(shù)量的影響 采用細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測(cè)PC12衰老細(xì)胞數(shù)量。將PC12細(xì)胞每孔按1×105個(gè)的密度接種于24 微孔板,按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理PC12細(xì)胞，棄上清用PBS 洗滌1次，加β-半乳糖苷酶染色固定液250 μL 室溫固定15 min，吸除固定液用PBS 洗滌3 次，每次3 min。棄上清，每空加250 μL 工作液放置不含CO2的培養(yǎng)箱里孵育12~16 h。放在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)染藍(lán)色的衰老細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，使用Image-Pro Plus6.0 軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野下染色陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。

1.5.6 復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞凋亡的影響 將PC12細(xì)胞每孔按1×105個(gè)的密度接種于6微孔板，按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理PC12細(xì)胞，收集所有的細(xì)胞以1 000 r/min 離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用PBS 洗滌細(xì)胞，離心棄上清，用100 Annexin V Bing?ding buffer 工作液重懸細(xì)胞，Annexin V-PE 染色劑和7-AAD 染色劑染色各加入5 μL，避光放置15 min，再加入400 μL 的Annexin V Bingding buffer 工作液，400 目的篩網(wǎng)過(guò)濾，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12 細(xì)胞凋亡率。

1.5.7 復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12 細(xì)胞周期的影響 將PC12 細(xì)胞每孔按1×105個(gè)的密度接種于6 微孔板并按“1.5.3”項(xiàng)下處理PC12 細(xì)胞，收集細(xì)胞以1 000 r/min 離心5 min，棄上清加1 mL 的PBS 重懸細(xì)胞再次離心，棄上清，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。加1 mL預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定30 min 以上，離心3~5 min 棄上清，加1 mL 的PBS 重懸細(xì)胞再次離心，棄上清，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。每管細(xì)胞加500 μL 碘化丙啶染色液重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min，染色完24 h 內(nèi)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞周期。

1.5.8 復(fù)方鐵線蕨顆粒總黃酮對(duì)PC12 細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響 將PC12 細(xì)胞每孔按1×105個(gè)的密度接種于96 微孔板并按“1.5.3”項(xiàng)下方法處理PC12 細(xì)胞,觀察細(xì)胞狀態(tài)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定細(xì)胞內(nèi)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的量以及超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）活力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮的含量測(cè)定提取純化完成后所得到的復(fù)方鐵線蕨顆粒總黃酮含量為518.3 mg/g。

2.2 D-半乳糖致PC12 細(xì)胞衰老模型的建立與空白組比較，模型組PC12細(xì)胞用不同濃度的D-半乳糖損傷后細(xì)胞存活率逐漸下降并呈濃度依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)D-半乳糖濃度16 mg/mL時(shí)細(xì)胞存活率降到50%~60%，可見(jiàn)該濃度使PC12 細(xì)胞更好的誘導(dǎo)衰老，故將該濃度確定為后期PC12 細(xì)胞致衰的給藥濃度，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度D-半乳糖給藥組細(xì)胞存活率比較（±s，n=6）

表1 不同濃度D-半乳糖給藥組細(xì)胞存活率比較（±s，n=6）

注：與空白組相比，**P<0.01。

組別空白組D-半乳糖模型組D-半乳糖模型組D-半乳糖模型組D-半乳糖模型組給藥濃度/（mg/mL）0 8 16 32 64存活率/%100±2.19 80.06±6.81**56.94±1.80**56.02±4.24**17.71±1.01**

2.3 復(fù)方鐵線蕨顆粒總黃酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞活力的影響與空白組比較，模型組PC12 細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，不同劑量給藥組PC12 細(xì)胞存活率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表2。

表2 不同濃度復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮細(xì)胞存活率比較（±s，n=6）

表2 不同濃度復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮細(xì)胞存活率比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

組別空白組模型組低劑量給藥組中劑量給藥組高劑量給藥組給藥濃度/（μg/mL）-1.6×104 8.5 17 34存活率/%100.00±2.31 62.14±4.15##88.19±7.81**93.60±8.60**86.04±9.48**

2.4 復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞數(shù)量的影響與空白組比較，模型組PC12 細(xì)胞的β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色率顯著升高，而且從圖1可見(jiàn)染藍(lán)色的衰老細(xì)胞數(shù)量比空白組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，不同濃度的給藥組PC12 細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色率顯著降低，圖1可見(jiàn)染藍(lán)色的衰老細(xì)胞數(shù)量比模型組細(xì)胞減少很多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖1、表3。

表3 不同濃度復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12衰老細(xì)胞的β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色率比較（±s，n=3）

表3 不同濃度復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12衰老細(xì)胞的β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色率比較（±s，n=3）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

組別空白組模型組低劑量給藥組中劑量給藥組高劑量給藥組給藥濃度/（μg/mL）-1.6×104 8.5 17 34 β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色率/%4.08±1.09 12.48±2.08##6.25±2.33**7.12±2.65**7.86±2.01**

圖1 不同濃度復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12衰老細(xì)胞的β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色示意圖（×100）

2.5 復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12衰老細(xì)胞凋亡的影響與空白組比較，模型組PC12 細(xì)胞凋亡率為升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組PC12 細(xì)胞比較，各濃度給藥組PC12細(xì)胞凋亡率為降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)DPC12衰老細(xì)胞凋亡的影響圖

2.6 復(fù)方鐵線蕨顆粒總黃酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞周期的影響與空白組比較，模型組PC12 細(xì)胞在G0/G1期值最高，而各濃度給藥組的PC12 細(xì)胞在G0/G1期值接近于空白組細(xì)胞的G0/G1期值。而模型組細(xì)胞在G2/M期和S期的值降低，不同濃度的復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮干預(yù)后PC12 細(xì)胞在S 期和G2/M 期的值又升高，接近于空白組細(xì)胞的值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)衰老時(shí)細(xì)胞周期停止在G1期，與模型組PC12細(xì)胞在G1期的值跟各給藥組PC12細(xì)胞的比較，都呈現(xiàn)出有所降低的趨勢(shì)，而且呈濃度依賴(lài)性，這說(shuō)明不同濃度的復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)D-半乳糖導(dǎo)致的PC12細(xì)胞衰老有保護(hù)作用，見(jiàn)表4。

表4 不同濃度復(fù)方鐵線蕨顆粒總黃酮對(duì)PC12細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）

表4 不同濃度復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12細(xì)胞周期的影響（±s，n=3）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

組別空白組模型組低劑量給藥組中劑量給藥組高劑量給藥組G0/G1/%64.78±0.12 71.24±0.28##61.52±0.35**58.4±0.30**56.68±0.25**G2/M/%9.38±0.17 1.86±0.24##10.15±0.09**12.52±0.18**12.15±0.12**S/%26.37±0.23 19.61±0.09##28.36±0.17**29.07±0.22**31.13±0.09**

2.7 復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響與空白組比較，模型組PC12細(xì)胞中的MDA 含量和LDH 活力升高，而SOD 的活力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，不同濃度的給藥組PC12 細(xì)胞中MDA 含量和LDH 活力降低，SOD 活力升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表5。

表5 不同濃度復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12衰老細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響（±s，n=6）

表5 不同濃度復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12衰老細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響（±s，n=6）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

組別空白組模型組低劑量給藥組中劑量給藥組高劑量給藥組給藥濃度/（μg/mL）-1.6×104 8.5 17 34 MDA/（nmoL/mL）1.78±0.17 3.48±0.77##2.25±0.32**2.37±0.34**2.40±0.38**SOD/（U/mgprot）107.81±3.76 73.49±2.10##86.99±5.39**95.38±2.78**102.95±7.04**LDH/（U/L）3771.53±168.65 4699±255.45##3932.24±496.02**4021.7±84.69**4349.68±41.84*

3 討論

D-半乳糖是一種還原糖，在正常濃度下會(huì)代謝為葡萄糖。D-半乳糖與胺反應(yīng)形成不穩(wěn)定的化合物，該化合物可以與蛋白質(zhì)中氨基酸的游離胺發(fā)生非酶促反應(yīng)，形成高級(jí)糖基化終產(chǎn)物（advanced glyco?sylation end products，AGEs）。AGEs 與其受體結(jié)合，導(dǎo)致形成氧自由基和ROS。過(guò)量產(chǎn)生的ROS 使蛋白質(zhì)、DNA 和脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能遭到損傷而導(dǎo)致細(xì)胞代謝和功能的變化引發(fā)細(xì)胞衰老[9]。因此本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖處理的PC12 細(xì)胞建立細(xì)胞衰老模型，研究復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞的增殖，凋亡，周期以及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。

引起細(xì)胞衰老的主要因素是氧化應(yīng)激，其發(fā)生的原因是自由基生產(chǎn)和抗氧化反應(yīng)系統(tǒng)的不平衡導(dǎo)致的，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)容易受到氧化應(yīng)激[10]。機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturate fatty acid，PUFA），引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，該作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學(xué)劑，而且會(huì)放大它的作用導(dǎo)致其引起細(xì)胞損傷。因此通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中MDA 含量可以反映出細(xì)胞氧化損傷的程度。細(xì)胞中SOD 能清除氧自由基，使細(xì)胞免除氧化應(yīng)激的傷害[11]。本實(shí)驗(yàn)中復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮使PC12 細(xì)胞MDA 含量降低，SOD活力升高。該結(jié)果表明，復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮能有效地降低PC12衰老細(xì)胞的氧化損傷程度。

通過(guò)細(xì)胞的自我更新能力、細(xì)胞活力[12]、細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線等方面可以評(píng)估細(xì)胞增殖能力。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)衰老時(shí)細(xì)胞周期停止在G1期，而增殖旺盛的細(xì)胞停止在S 期，所以該期值比例明顯較高[13]。在通常情況下用細(xì)胞周期的G2/M 期值與S 期值和來(lái)反映細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱[14]。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮組PC12細(xì)胞G2/M期值與S期值和逐漸上升，結(jié)果說(shuō)明復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮對(duì)PC12 衰老細(xì)胞有增殖作用，使PC12細(xì)胞活力增強(qiáng)。

據(jù)研究報(bào)告顯示，細(xì)胞凋亡也是引起氧化應(yīng)激的原因之一，會(huì)參與細(xì)胞衰老變化過(guò)程[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮明顯降低PC12衰老細(xì)胞的凋亡作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)復(fù)方鐵線蕨顆?？傸S酮改善PC12衰老細(xì)胞的氧化損傷，對(duì)抗D-半乳糖導(dǎo)致的PC12衰老細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期的阻滯，從而實(shí)現(xiàn)PC12神經(jīng)衰老細(xì)胞的保護(hù)作用。