Cajal間質(zhì)細(xì)胞自噬參與兒童原發(fā)性腎盂輸尿管連接部狹窄發(fā)病及機(jī)制研究

李 凱，葉爾登，阿布都賽米·阿布都熱衣木，葉爾番，王 俊，李水學(xué)

(新疆維吾爾自治區(qū)兒童醫(yī)院泌尿外科,烏魯木齊 830000)

先天性腎盂輸尿管連接部狹窄（ureteropelvic junction obstruction，UPJO）是指尿液自腎臟分泌產(chǎn)生流入輸尿管時產(chǎn)生的部分性狹窄，可通過產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病率為0.2%[1]。隨著產(chǎn)前超聲的進(jìn)步，UPJO 的產(chǎn)前檢出率得以提高。目前認(rèn)為，UPJO 主要是由于患者胚胎發(fā)育時期腎盂輸尿管連接部狹窄引起尿液引流不暢導(dǎo)致大量的尿液潴留，進(jìn)一步使腎盞擴(kuò)張和腎盂內(nèi)壓力增高，最終壓迫腎實質(zhì)造成腎實質(zhì)變薄和腎功能損傷[2]。盡管過去幾十年來對UPJO 從胚胎學(xué)、解剖學(xué)、形態(tài)學(xué)以及病理學(xué)等方面進(jìn)行了大量研究，特別是其病因研究取得了一定進(jìn)展，但其確切病因及治療原則與方法仍存在爭議[3]。

在輸尿管組織內(nèi)存有多種類型的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，而這些神經(jīng)組織可能與腎盂輸尿管的蠕動功能存在密切關(guān)[4]，UPJO 的腎盂輸尿管連接部Cajal間質(zhì)細(xì)胞（in?terstitial cells of Cajal，ICC）明顯減少，可能為本病發(fā)病原因[5-6]。ICC 與神經(jīng)傳導(dǎo)支配有關(guān)，它是慢波電位的起搏者和基本電節(jié)律的傳播者。輸尿管中的ICC研究表明，與胃腸道蠕動受ICC 控制一樣，輸尿管蠕動也與ICC 有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)ICC 也分布于輸尿管的全長[7]。ICC 與平滑肌細(xì)胞之間、神經(jīng)細(xì)胞之間可形成網(wǎng)絡(luò)連接，此種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的特點在其控制平滑肌的蠕動和介導(dǎo)神經(jīng)信息傳導(dǎo)的功能中有重要作用[8]。在對UPJO 病因的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，ICC 參與神經(jīng)信號傳導(dǎo)并調(diào)控輸尿管肌層蠕動，其密度降低可能與UPJO 可導(dǎo)致尿液引流受阻有關(guān)[9]。自噬是細(xì)胞內(nèi)一種重要的生物學(xué)過程，細(xì)胞內(nèi)自噬的平衡對細(xì)胞正常生理功能的維持至關(guān)重要[10]。ICC 在UPJO 減少的機(jī)制和原因目前仍不清楚。本研究以ICC 在UPJO表型變化切入點，分析其參與輸尿管蠕動及自噬的機(jī)制，得出ICC 自噬在UPJO 中的發(fā)病作用及關(guān)系，為其今后的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象隨機(jī)選擇新疆維吾爾自治區(qū)兒童醫(yī)院2020年1月－2021年1月初診為UPJO且入院行腎盂輸尿管成形術(shù)患者20 名，術(shù)中收取并保存腎盂輸尿管連接部組織標(biāo)本，建立UPJO 標(biāo)本庫。同期選擇年齡性別匹配，因腎臟腫瘤行腎切除腎盂輸尿管連接部組織的患者15例（排除腎盂輸尿管連接部狹窄，腫瘤患者組織學(xué)證實無侵犯）。建立UPJO 及對照組患者數(shù)據(jù)資料庫，記錄所有患者的臨床病歷資料，包括病理結(jié)果、影像學(xué)結(jié)果、化驗檢查結(jié)果等。研究得到新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并獲得了所有參與者的書面知情同意。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：最終術(shù)中證實為UPJO 組為腎盂輸尿管連接部狹窄，病理結(jié)果證實對照組腫瘤未侵犯腎盂輸尿管連接部；年齡在18 歲以下患者且配合治療，患者及家屬知情同意入組本臨床研究；無其他明顯基礎(chǔ)疾病影響患者生存健康狀況；無其它并發(fā)泌尿系畸形患者；患者為有效臨床隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理結(jié)果證實腫瘤侵犯腎盂輸尿管連接部；臨床失聯(lián)、失訪者；患者及其家長無法配合臨床檢查及治療者；家長拒絕入組研究者；同時存在其他部位腫瘤或嚴(yán)重疾病者；患者住院臨床資料缺失者。

1.3 取材及免疫組織化學(xué)手術(shù)沿縱行方向切取患者的腎盂輸尿管連接部組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm 厚的切片。然后，切片在二甲苯中脫蠟，用梯度乙醇重新水化，室溫干燥48 h 后置入4℃冰箱內(nèi)保存，用酪氨酸激酶受體（tyrosine ki?nase receptor，c-kit）免疫組化染色，染色步驟均按試劑盒說明操作。抗體按1:100 稀釋。c-kit 免疫組化染色UPJO 30 例，對照組20 例，細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕色顆粒狀物質(zhì)者即為c-kit陽性細(xì)胞。

1.4 Masson染色石蠟切片脫蠟水化后，用Harris’s蘇木素染核10 min，水洗1 min，入Masson復(fù)合染色液染色10~20 min。以0.2% 醋酸水溶液速洗1~2 s。5.1%磷鉬酸處理5~8 min，不用水洗1%亮綠SF 染色2~4 min?？焖儆眯迈r95%無水酒精分化兼脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測（qPCR）自噬相關(guān)基因變化使用TRIZOL 試劑從組織中提取總RNA，并使用光密度（260 nm和280 nm）測量RNA純度和濃度。然后，根據(jù)說明書，通過RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在ABI 7500 序列檢測系統(tǒng)中使用QuantiNova SYBR Green PCR 進(jìn)行反應(yīng)。所使用的的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計、合成，以管家基因AC?TIN 為內(nèi)參，引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95℃初始熱活化5 min 后，95℃變性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸40 個循環(huán)。采用2-△△CT法分析目的基因在不同組間的表達(dá)差異。

表1 引物序列信息

1.6 免疫印跡法（Western blot）檢測在含有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液中裂解組織，BCA 試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取等量的總蛋白質(zhì)在SDS-PAGE 上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與以下一抗在4℃下孵育過夜：P62 (1:1 000)、LC3I(1:1 000)、LC3II(1:500) 和β-actin(1:2 000)。用PBS 洗滌3 次，將膜與適當(dāng)?shù)亩挂黄鸱跤?。使用Image J 對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，并使用β-actin 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 組織免疫熒光檢測切片用檸檬酸緩沖液處理并加入山羊血清以阻斷非特異性背景染色。將切片與包括LC3B(1:100)和c-kit(1:50)在內(nèi)的一抗在4°C下孵育1 h。之后，切片用PBS 洗滌3 次并與二抗FITC（山羊抗小鼠，1:200）和TRITC (山羊抗兔，1:100)在37°C 下在黑暗中孵育90 min。切片再次用PBS 洗 滌，加 入600 μL 的Hoechst33258 染 液，室溫避光孵育10 min。洗滌完畢將玻片滴加抗熒光猝滅液封片，置于熒光顯微鏡下觀察，并拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 UPJO 患者ICC 數(shù)量及形態(tài)學(xué)觀察c-kit 染色結(jié)果表明，與對照組相比，ICC 在UPJO 連接部明顯減少（圖1A、1B）。Masson 染色顯示，與對照組相比，UPJO 連接部肌纖維明顯減少，膠原纖維增多（圖1C、1D）。對ICC核肌纖維數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計，匯總分析顯示，與對照組相比，UPJO 患者的UPJ 處的ICC 和肌纖維密度均顯著降低，而膠原纖維的密度則顯著增加（P<0.01）。

圖1 UPJO患者ICC數(shù)量及形態(tài)學(xué)觀察

2.2 UPJO 患者中c-kit 和自噬相關(guān)蛋白LC3 的表達(dá)與對照組相比，UPJO 組c-kit 表達(dá)下降，c-kit 陽性的細(xì)胞中LC3表達(dá)升高（圖2）。

圖2 UPJO患者中c-kit和自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)

2.3 UPJO 患者ICC 和自噬小體變化在對照組中，ICC 呈紡錘形，細(xì)胞核較大，細(xì)胞質(zhì)較少（圖3A）。自噬小體很少（圖3B）。然而，UPJO 患者中觀察到ICC超微結(jié)構(gòu)的改變，以及細(xì)胞器變性或減少，甚至是空泡化(圖3C)。同時在UPJO 患者中觀察到ICC 自噬泡形成，ICC與周圍細(xì)胞之間的縫隙連接較少（圖3D）。

圖3 電鏡觀察UPJO患者中ICC和自噬小體變化（×20 000）

2.4 UPJO 患者中自噬相關(guān)基因變化qPCR 檢測自噬相關(guān)基因P62和LC3結(jié)果表明，與對照組相比，UP?JO組P62基因表達(dá)顯著降低（P<0.05），LC3基因表達(dá)升高（P<0.05），見圖4。

圖4 P62和LC3基因在UPJO患者中表達(dá)情況

2.5 UPJO 患者中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化Western blot 法檢測組織中自噬相關(guān)蛋白P62 和LC3II/LC3I 的表達(dá)水平變化的結(jié)果顯示，與對照組相比，UPJO 組P62 蛋 白表達(dá)降 低，LC3II/LC3I 表達(dá)升高。見圖5。

圖5 P62、LC3I和LC3II蛋白在UPJO患者中表達(dá)

3 討論

UPJO 發(fā)病機(jī)制尚不明確，現(xiàn)在主要認(rèn)為是由于胚胎發(fā)育時輸尿管近端發(fā)育異常引起[11]。胚胎第12周時，輸尿管口及中腎等完成了演變，形成最后位置。如果此時腎盂輸尿管連接部再通過程出現(xiàn)異常，如管化不完全，則會出現(xiàn)梗阻，可能是先天性腎盂輸尿管連接部狹窄引起腎積水的重要原因[12]。輸尿管ICC 中進(jìn)行的研究證實，與胃腸道蠕動受ICC 控制一樣，輸尿管蠕動也與ICC 有關(guān)，且ICC 也分布于輸尿管的全長。本研究結(jié)果證實了ICC 在UPJO 連接部明顯減少，輸尿管固有層的病理生理變化是導(dǎo)致UPJO 的直接原因。Senol 等[13]發(fā)現(xiàn)UPJO 患者固有層的肌纖維減少，膠原纖維增多，考慮可能為梗阻原因，與本研究結(jié)果一致。輸尿管在胚胎發(fā)育期間由于近端缺血造成發(fā)育不良也會導(dǎo)致UPJO 發(fā)生[14]。UPJ 部ICC 密度降低與UPJO 發(fā)病有關(guān)，病理學(xué)檢查結(jié)果也證實正常兒童輸尿管連接處ICC 與內(nèi)層縱行肌纖維平行，并與神經(jīng)元關(guān)系密切，這提示ICC 參與神經(jīng)信號傳導(dǎo)并調(diào)控輸尿管肌層蠕動[15]。

細(xì)胞內(nèi)自噬的平衡對細(xì)胞正常生理功能的維持至關(guān)重要。一旦自噬的平衡遭到破壞就會引發(fā)多種疾病，如糖尿病、癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[16]。細(xì)胞正常生理狀態(tài)下自噬的活性比較低，一旦自噬被誘導(dǎo)后，參與自噬起始的相關(guān)蛋白會在一個特殊的部位組裝，形成自噬小體的前體[17]。具有明顯家族史的UPJO 患者可表現(xiàn)出常染色體顯性或隱性遺傳，符合單基因遺傳病的特征，可能與單個基因的突變有關(guān)[18]。通過UPJO 家系研究發(fā)現(xiàn)TBX18 基因突變與UPJO 發(fā)病關(guān)系密切[19]。自噬主要幫助機(jī)體適應(yīng)代謝應(yīng)激,在細(xì)胞減少和程序性細(xì)胞死亡的開始時變得過度。作為一種獨特的膜運輸形式，自噬過程中自噬體吞噬細(xì)胞器和細(xì)胞溶質(zhì)大分子，并將其輸送到溶酶體進(jìn)行降解[20]。LC3 是哺乳動物細(xì)胞中醇母ATG8基因的同源物,能靶向定位于自噬體膜,參與自噬的形成,LC3 分為I 型和于型,I 型常規(guī)表達(dá)、游離存在于胞質(zhì)中。當(dāng)自體吞噬發(fā)生時,I 型LC3 經(jīng)泛素樣加工修飾過程與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合,形成II型LC3,II 型LC3 蛋白結(jié)合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上,其含量與自唯泡數(shù)量成正比。自噬通過LC3 鏈接胞漿內(nèi)的P62 將散亂蛋白DVL2 募集到自噬體內(nèi)進(jìn)行降解[21]。本研究觀察到ICC 自噬泡形成，ICC 與周圍細(xì)胞之間的縫隙連接較少，同時發(fā)現(xiàn)P62蛋白表達(dá)降低，LC3II/LC3I 表達(dá)升高。本研究證明了ICC 自噬及縫隙連接蛋白的異常表達(dá)參與UPJO 疾病的進(jìn)程，為UPJO患兒中ICC減少的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。