AJUBA在食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE150細(xì)胞中的功能

路子揚(yáng)，季 敏，蘇麗萍，劉 麗，蘇天園，肖錦玲，管亞玲，蒲紅偉

（新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2第一附屬醫(yī)院病理科，3遠(yuǎn)程醫(yī)療中心，4學(xué)科建設(shè)科，烏魯木齊 830054）

食管癌（esophageal cancer，EC）是食管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，以食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squa?mous cell carcinoma ，ESCC）為主，是發(fā)病率較高的十大腫瘤之一，其死亡率占世界腫瘤死亡率的第六位[1]。近年來食管癌的發(fā)病率雖呈現(xiàn)階段性下降，但患食管癌總?cè)藬?shù)已超過45 萬，死于食管癌的人數(shù)高達(dá)30萬[2]。食管癌早期癥狀并不明顯，患者常在腫瘤增大，吞咽有異物感時(shí)進(jìn)行檢查，此時(shí)腫瘤已發(fā)展至中晚期，導(dǎo)致治療效果差，術(shù)后五年生存率低[3]，因此早期診斷及治療意義重大。基因序列監(jiān)測技術(shù)的發(fā)展使腫瘤治療與精準(zhǔn)治療相結(jié)合，提高了腫瘤的早期診斷與預(yù)后。已有多項(xiàng)研究表明，AJUBA 參與食管癌、皮膚癌、結(jié)直腸癌的發(fā)展過程，但有關(guān)AJUBA在食管鱗癌中的具體作用機(jī)制的研究較少。本研究通過分析AJUBA 在食管鱗癌發(fā)展過程的作用機(jī)制，為其早期進(jìn)展與預(yù)后提供理論依據(jù)，對尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）細(xì)胞株KYSE150 購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。慢病毒由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建，AJUBA 抗體及GAPDH 內(nèi)參抗體均購自英國ABCAM 公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK-8）檢測試劑盒、ECL熒光顯色試劑盒購自北京博奧森公司。高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶、雙抗和胎牛血清均購自美國Gibco 公司，BCA 蛋白定量試劑盒購于中國索萊寶公司。 TRIzol 試劑、primeScriptTMone stEP RT-PCR kit購于美國Invitrogen 公司，QuantiNova SYBR Green PCR Kit 購于德國QIAGEN 公司，8.0 μm 孔徑的Tran?swell小室購于美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常食管鱗狀上皮（SHEE）細(xì)胞系、KYSE150 細(xì)胞系，采用含10%胎牛血清與1%的雙抗的高糖培養(yǎng)基（49:1），置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的KYSE150 細(xì)胞用胰酶消化，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種至6 孔板，加入培養(yǎng)液1 mL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。第2 天，計(jì)算慢病毒所需用量，-80℃冰箱取出，冰浴融化備用。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，細(xì)胞生長至80%開始轉(zhuǎn)染。先換培養(yǎng)液，再將慢病毒液加入6孔板中，輕柔混勻，置于培養(yǎng)箱過夜，孵育12 h，取出6 孔板，棄除上清液，加入10%胎牛血清（FBS）培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72~96 h，觀察熒光表達(dá)情況，感染率高于80%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞穩(wěn)定傳代2~4 代后，進(jìn)行RNA 及蛋白質(zhì)含量的檢測。將細(xì)胞分為對照組與敲降組。其中對照組包括KYSE150 組（未轉(zhuǎn)染的KYSE150 細(xì)胞）和KYSE150shnon 組（轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列），敲降組為KYSE150shAJUBA 組（分別轉(zhuǎn)染KYSE150shAJUBA-1、KYSE150shAJUBA-2、KYSE150shAJUBA-3）。

1.2.3 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)通過胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度后接種至96 孔板內(nèi)，每孔1 000 個(gè)細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。接種細(xì)胞4h 后，顯微鏡下觀察細(xì)胞已貼壁，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入完全培養(yǎng)基100 μL，CCK-8 10 μL，每孔總體積共110 μL。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)箱中孵育2 h。將96 孔板置于酶標(biāo)儀中震蕩30 s，吸光度450 nm，記錄吸光度（OD）值，標(biāo)計(jì)為0 h。此后24、48、72、96 及120 h 的操作同上，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)三次。

1.2.4 Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 采用細(xì)胞周期抑制劑Mitomycin B 進(jìn)行預(yù)處理，以饑餓細(xì)胞24 h。每孔細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)。在Transwell 小室下室中的每個(gè)小室預(yù)先加入500 μL 含10 %胎牛血清的完全培養(yǎng)基，上室加入細(xì)胞懸液，將24孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4%組織細(xì)胞固定液4 ℃固定30 min，0.1%結(jié)晶紫溶液700 μL，室溫下染色5 min。下室倒置于顯微鏡下，每個(gè)小室隨機(jī)選取5 個(gè)視野，拍照，通過Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)三次。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA。取1 μg 總RNA 參照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系37℃，30 min 反應(yīng)，85℃5 s 終止反應(yīng)。qRT-PCR 反應(yīng)依照試劑盒說明進(jìn)行。引物序列如下：AJUBA-正向引物：5'-CCAAG?TATACTGTGTCACCGACT-3'，AJUBA-反向引物：5'-CAAAGTGATAATCCCGGTCCA-3'，GAPDH-正向引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，GAPDH-反向引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)三次。

1.2.6 Western blotting 實(shí)驗(yàn) 將KYSE150 細(xì)胞株與人正常食管鱗狀上皮（SHEE）細(xì)胞株用胰酶消化，PBS 清洗3 次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心30 min，收集上清液。采用二喹啉甲基（BCA）蛋白定量法進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。轉(zhuǎn)膜完成后，5 %脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜。Tris-HCl緩沖鹽溶液加離子去污劑（TBST）洗滌3次后，加入二抗，室溫孵1 h，通過底物化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析與非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染敲降A(chǔ)JUBA 在KYSE150 中的表達(dá)情況在KYSE150 細(xì)胞株中慢病毒轉(zhuǎn)染shAJUBA 96 h 后，熒光顯微鏡下的KYSE150shnon 與KYSE150shAJUBA 細(xì)胞呈綠色熒光，感染率均高于80%。隨后進(jìn)行流式篩選出感染細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，見圖1A。Western blotting 結(jié)果顯示，與對照組相比，敲降組AJUBA 蛋白表達(dá)水平下降，且KYSE150shAJUBA-3下降最為顯著（P<0.000 1），見圖1B、C；qRT-PCR 結(jié)果顯示，敲降組AJUBA 的mRNA 水平下調(diào)，KYSE150shAJUBA-3 的mRNA 表達(dá)水平下降最顯著（P<0.000 1），見 圖1D。 挑 選 敲 降 率 最 高 的KYSE150shAJUBA-3用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 KYSE150敲降A(chǔ)JUBA檢測AJUBA敲降效率

2.2 敲降A(chǔ)JUBA表達(dá)后抑制KYSE150細(xì)胞的增殖能力結(jié)果CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，KYSE150與KYSE150shnon相比，兩組的細(xì)胞增殖速度無差異（P＞0.05），而KYSE150shAJUBA分別與KYSE150、KYSE150shnon相比較，KYSE150shAJUBA在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的增殖速度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖2。

圖2 AJUBA敲降后對細(xì)胞增殖能力的影響（＊＊＊P<0.001）

2.3 敲降A(chǔ)JUBA表達(dá)后抑制KYSE150細(xì)胞的遷移能力對照組中KYSE150與KYSE150shnon Tran?swell小室下室的細(xì)胞數(shù)目無明顯差異（P＞0.05）；敲降組KYSE150shAJUBA組與對照組相比，敲降組細(xì)胞遷移數(shù)目減少，遷移能力顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.000 1），見圖3。

圖3 AJUBA敲降對ESCC細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

食管鱗癌的發(fā)展是由環(huán)境因素、遺傳、生活習(xí)慣與病毒等多因素導(dǎo)致的。尋找影響食管鱗癌發(fā)展的因素對及時(shí)篩查食管鱗癌及食管鱗癌的后續(xù)治療具有重要意義。

AJUBA 是一種多LIM 結(jié)構(gòu)域蛋白，屬于AJUBA/ZyCin 家族[4]，其結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位在生長因子、細(xì)胞基質(zhì)黏附與機(jī)械信號等外部信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著接頭蛋白和支架蛋白的作用[5]。AJUBA 蛋白主要定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，作為穿梭于不同亞細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)，AJUBA 蛋白在細(xì)胞表面及細(xì)胞核之間傳遞信號中發(fā)揮著重要作用[6]。已有研究表明，AJUBA 在食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)發(fā)揮促癌作用并與食管鱗癌預(yù)后相關(guān)[7-8]，但因其研究結(jié)果較少仍待進(jìn)一步研究探討。本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AJUBA 在食管鱗癌組織細(xì)胞中高表達(dá)，并高于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，而在正常食管鱗狀組織細(xì)胞中，AJUBA 在細(xì)胞核低表達(dá)[8]。AJUBA 在正常食管鱗狀組織細(xì)胞核中表達(dá)，而ESCC組織細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，這可能與AJU?BA蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中主要是作為轉(zhuǎn)錄抑制因子來抑制基因的轉(zhuǎn)錄；在細(xì)胞質(zhì)中，AJUBA 蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮有絲分裂作用；在細(xì)胞表面，AJUBA 蛋白可以與鈣黏蛋白（E-cadherin）結(jié)合從而進(jìn)行細(xì)胞連接[5-6,9]。因此，AJUBA 可以執(zhí)行多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、有絲分裂、存活、基因表達(dá)、microR?NA 處理及機(jī)械力傳感[10-11]。研究表明，AJUBA 通過調(diào)節(jié)Wnt、RAS/ERK、JAK/STAT 和Hippo 等主要信號通路[12]，并作為Snail、Sp1 和核激素受體等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)節(jié)因子參與腫瘤進(jìn)展[13-15]。

為探討AJUBA 在食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)所發(fā)揮的生物學(xué)功能，本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定下調(diào)KYSE150 中AJUBA 蛋白的表達(dá)，采用CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn)檢測敲降A(chǔ)JUBA 蛋白在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示敲降A(chǔ)JUBA 后食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖速度受到了顯著抑制。這與AJUBA在多種惡性腫瘤中促進(jìn)細(xì)胞增殖的研究結(jié)果相符[11-13]，可能是AJUBA 的過表達(dá)或AJUBA 的LIM 前（Pre-LIM）結(jié)構(gòu)域的過表達(dá)激活A(yù)JUBA，使原本在正常食管鱗狀上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能的AJUBA 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮中心體功能促進(jìn)有絲分裂，導(dǎo)致細(xì)胞增殖。敲降ESCC 細(xì)胞中AJUBA 的表達(dá)后Transwell 小室下室的細(xì)胞數(shù)目相較于對照組顯著減少，敲降A(chǔ)JUBA 的表達(dá)將會(huì)降低細(xì)胞的侵襲與遷移能力，這表明AJUBA 可能促進(jìn)食管鱗癌中上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的發(fā)生，AJUBA 增多將促進(jìn)ESCC 細(xì)胞的侵襲與遷移。這與AJUBA 在其他腫瘤中過表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移的結(jié)果相符[8,12,16]。AJUBA 與細(xì)胞質(zhì)中不同的多聚體蛋白復(fù)合物有關(guān)，它可通過其LIM基序與α-catenin 相互作用或通過其Pre-LIM 區(qū)域與F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）相互作用控制細(xì)胞黏附的蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合[17]。因此，AJUBA 通過將E-cadherin/αcatenin 黏附受體復(fù)合物與細(xì)胞骨架連接，有助于黏附連接的形成與穩(wěn)定[16]。EMT 是腫瘤轉(zhuǎn)移的可逆的初始過程，在此過程中，極化的上皮細(xì)胞通過細(xì)胞骨架重排轉(zhuǎn)變?yōu)榉蛛x的間充質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致黏附減少和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增加，增強(qiáng)腫瘤的傳播[18]。Zhang 等[19]的研究表明，AJUBA 參與并促進(jìn)肝細(xì)胞癌的EMT 過程，在肝細(xì)胞癌中AJUBA 的高表達(dá)將提高細(xì)胞侵襲性及發(fā)生不良預(yù)后的概率。

綜上所述，AJUBA 促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖與侵襲，可作為ESCC 患者預(yù)測腫瘤大小與浸潤深度的潛在分子標(biāo)志物，有望成為ESCC治療的新靶點(diǎn)。