梁 靜,范 娜,王 瑤,劉 雯,居 敏,葉海燕
(新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院1 檢驗科,2 輸血科,烏魯木齊 830002;3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科,烏魯木齊 830011;4 新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院輸血科,新疆喀什 844000)
血小板輸注無效(platelet transfusion refractori?ness,PTR)發(fā)生率高達30%~70%[1-2],是治療出血性疾病過程中常見的難治性臨床問題[3-4]。非免疫因素引起的PTR 去除病因、對癥處理后可以明顯改善血小板的輸注療效,而免疫性PTR 機制復(fù)雜,是發(fā)生難治性PTR 的重要原因[5]。目前認為血小板特異性抗原(human platelet antigens,HPA)基因多態(tài)性及抗體陽性率與免疫性PTR 的產(chǎn)生密切相關(guān),HPA 抗體引起的PTR 占免疫因素的10%~20%[6-8],常見報道中多以單位點HPA 對PTR 的產(chǎn)生進行分析,如中國人群中HPA-3、HPA-15 系統(tǒng)不配合率最高,歐美國家多由HPA-1a、HPA-5b、HPA-2b 抗體引起PTR 多見[9]。但單位點對復(fù)雜疾病的影響(主效應(yīng))非常微弱,不能全面揭示兩者的關(guān)聯(lián)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步,各種疾病中基因交互作用被相繼報道,但有關(guān)引起免疫性PTR 的HPA 基因間交互作用的研究尚缺乏[10]。本研究擬建立免疫性PTR 的HPA 基因交互作用預(yù)測模型,深入認識免疫性PTR 的發(fā)病機制,探索HPA 基因交互作用在免疫性PTR 風(fēng)險分析中的作用,現(xiàn)報道如下。
1.1 研究對象收集2019 年6 月-2020 年6 月新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院及新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院免疫性PTR 患者190 例作為病例組,納入標(biāo)準(zhǔn):(1)輸注前血小板≤50×109/L;(2)血小板輸注無效(血小板回收率PPR)和輸注后血小板校正增加指數(shù)(CCI),CCI 判斷血小板輸注無效的標(biāo)準(zhǔn)為血小板輸注1 h 后的CCI<7 500 或輸注后24 h后的PPR<4 500;(3)血小板輸注量小于3個治療量,輸注次數(shù)低于3次;患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)抗-HIV 陽性;(2)DIC;(3)敗血癥;(4)脾功能亢進;(5)活動性出血;(6)血容量不足需液體復(fù)蘇;(7)輸注其他血液制品;(8)住院期間服用兩性霉素B、萬古霉素和免疫球蛋白;(9)不能配合完成本研究;同期收集50 例血小板輸注有效的患者作為對照組。本研究獲醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。
1.2 試劑與儀器人類血小板同種抗原HPA1-17 基因分型試劑盒(天津秀鵬),ABI9902PCR 擴增儀(Thermo 公司);2500 型凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司);BG-Power600i 常規(guī)電泳儀(北京百晶公司)。
1.3 HPA 基因分型滿足質(zhì)控要求的標(biāo)本嚴(yán)格按照人類血小板同種抗原HPA1-17(PCR-SSP 法)、Cab基因分型試劑盒說明書上操作進行操作。
1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用多因子降維分析方法(gener?alized multifactor dimensionality reduction,GMDR)0.7軟件對HPA 系統(tǒng)基因分型交互作用建模進行分析。根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果的訓(xùn)練平衡準(zhǔn)確度、測試平衡準(zhǔn)確度、符號檢驗P值及交叉驗證一致性等參數(shù)評估HPA 基因分型交互作用在輸注血小板患者中發(fā)生PTR 的風(fēng)險。HPA 系統(tǒng)基因-基因交互作用模型圖每個方格代表一種基因-基因的交互組合,方格顏色的深淺與該基因-基因組合對疾病的風(fēng)險性呈正相關(guān)。方格顏色越深,表示該組合發(fā)生PTR 風(fēng)險越高。每個方格中,左邊條帶是組合的正向得分,右邊條帶是組合的負向得分,正向得分越高,表明該組合發(fā)生PTR風(fēng)險也越高。
2.1 HPA 基因 分型HPA1~6,15 共7 個基 因位點頻率分布結(jié)果顯示:僅HPA-3 位點等位基因頻率分布在病例組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。
表1 HPA基因位點不同等位基因在對照組和病例組中的分布
2.2 GMDR分析HPA基因系統(tǒng)分型交互作用模型
2.2.1 HPA不同分型交互作用模型 HPA基因分型1階-9 階交互作用模型中第3 階(HPA-3,5,15)模型測試準(zhǔn)確度最大(testing accuracy:0.625),交叉驗證一致性最好(CVC=8/10),該組合提供了最高驗證樣本準(zhǔn)確度與最佳交叉驗證一致性,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001) ,為最佳模型。模型第4 階(HPA-2,3,5,15)及第5 階(HPA-2,3,5,6,15)模型次之,P<0.05。表明第3、4、5階在對照組和病例組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),第1、2、6、7、8、9 階模型準(zhǔn)確度大,但是交叉驗證一致性較差,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。
表2 HPA不同分型交互作用模型
2.2.2 HPA系統(tǒng)基因-基因交互作用模型圖(1)3階[HPA-3 HPA-5 HPA-15]三因子交互作用模型圖。PTR 患者攜帶HPA-3aa、HPA-5aa、HPA-15ab,該組合的方塊顏色最深,正向得分最高為5.2,該組合發(fā)生PTR 風(fēng)險高,見圖1。(2)4 階[HPA-2 HPA-3 HPA-5 HPA-15]四因子交互作用模型圖。PTR 患者攜帶HPA-3aa、HPA-5aa、HPA-15ab、HPA-2aa 的組合方塊顏色最深,正向得分最高為5.2,該組合發(fā)生PTR風(fēng)險高,見圖2。(3)5 階[HPA-2 HPA-3 HPA-5 HAP-6 HPA-15]五因子交互作用模型圖。PTR 患者攜帶HPA-3aa 基因型、HPA-5aa 基因型、HPA-15ab 基因型、HPA-2aa 基因型及HPA-6 aa,該組合的方塊顏色最深,正向得分最高為5.2,該組合發(fā)生PTR 風(fēng)險高,見圖3。
圖1 HPA-3 HPA-5 HPA-15三因子交互作用模型圖
圖2 HPA-2 HPA-3 HPA-5 HPA-15四因子交互作用模型圖
圖3 HPA-2 HPA-3 HPA-5 HAP-6 HPA-15五因子交互作用模型圖
血小板輸注是治療因血小板減少引起的出血性疾病的有效治療措施,但并不是所有患者輸入血小板后都能達到預(yù)期的治療效果,其中一個重要的原因是患者在多次輸血后機體可產(chǎn)生HPA 抗體、HLAⅠ類抗體、血小板膜糖蛋白GPⅣ(CD36)等血小板抗體,導(dǎo)致血小板輸注無效(PTR)[11-12]。如何預(yù)防和避免免疫性PTR發(fā)生是目前臨床上輸注血小板治療的難題。
HPA 作為血小板糖蛋白攜帶的一類特異性抗原,具有單核苷酸多態(tài)性,因此HPA 也呈多態(tài)性分布,目前研究多支持PTR 與HPA 等位基因的多態(tài)性有關(guān)[13],研究表明PTR 患者HPA-2、HPA-3、HPA-15呈明顯的多態(tài)性分布,HPA-3、HPA-15 的雜合度最高[14-15]。趙鳳春等[16]研究顯示HPA-3 基因多態(tài)性與PTR患者有顯著相關(guān)性,為導(dǎo)致PTR的影響因素。但目前大多關(guān)于免疫性PTR 的研究忽略了HPA 基因-基因交互作用對PTR 產(chǎn)生的影響。研究表明在復(fù)雜性疾病的病因研究中易感基因單核苷酸位點的關(guān)聯(lián)分析發(fā)揮著重要作用[17-18],并且復(fù)雜性疾病的發(fā)病風(fēng)險由多個基因共同承擔(dān),而基因-基因交互作用已經(jīng)被認為是復(fù)雜性疾病基本的遺傳學(xué)模式之一[19-20]。
本研究對研究對象進行HPA1-17 基因檢測,結(jié)果顯示:病例組和對照組人群的HPA 基因型頻率數(shù)據(jù)符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡,均未發(fā)生偏離(P>0.05),其中HPA7a-14a、16a、17a 呈單態(tài)性,未檢出相應(yīng)HPA-b 等位基因或b 基因頻率極低;研究發(fā)現(xiàn)HPA-3a 基因位點與發(fā)生免疫性PTR 具有關(guān)聯(lián)性,且攜帶HPA-5a 等位基因的個體可能更容易罹患PTR。進一步通過GMDR 分析建立HPA 不同分型交互作用模型,探究HPA 基因交互作用與免疫性PTR 的關(guān)聯(lián)性,結(jié)果顯示:九階HPA基因交互作用模型中,第1階(HPA-3)、2 階(HPA-3,15)、6 階(HPA-1,2,3,5,6,15)、7 階(HPA-1,2,3,4 ,5,6,15)、8 階(HPA-1,2,3,4,5,6,15,7)、9 階(HPA-1,2,3 ,4 ,5 ,6 ,15,7,8)模型測試準(zhǔn)確度及交叉一致性顯示對免疫性PTR 風(fēng)險預(yù)測無統(tǒng)計學(xué)意義,而第3 階(HPA-3,5,15)、4 階(HPA-2,3,5,15)、5階(HPA-2,3,5,6,15)存在交互作用且與PTR 發(fā)生密切相關(guān),其中第3 階(HPA-3,5,15)模型測試準(zhǔn)確度最大0.625,為血小板輸注患者中評估免疫性PTR 發(fā)生風(fēng)險的最佳模型。第1、2、6、7、8、9 階HPA 基因交互模型差異無統(tǒng)計學(xué)意義,故不作繼續(xù)研究,僅對第3、4、5 階HPA 基因交互模型進行進一步研究。通過HPA 基因系統(tǒng)模型圖顯示,第3階模型PTR 患者攜帶HPA-3aa、HPA-5aa、HPA-15ab,發(fā)生PTR 風(fēng)險高,第5階模型在第3階模型基礎(chǔ)上攜帶HPA-2 aa或HPA-6aa 基因,對免疫性PTR 的發(fā)生有重要推進作用,HPA-2 aa、HPA-6aa 基因可能協(xié)同增強了免疫性PTR發(fā)生的風(fēng)險。
本研究是對免疫性PTR 患者基因-基因交互作用模型構(gòu)建及風(fēng)險預(yù)測的有益嘗試,為深入了解免疫性PTR 的發(fā)生機制及臨床預(yù)防提供了實驗依據(jù)和參考。利用HPA 基因交互作用模型提前對免疫性PTR進行風(fēng)險分析及預(yù)判,篩選合適的血小板制品進行配型,盡量避免PTR發(fā)生。