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    一株羅非魚源甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的分離鑒定

    2022-02-26 08:33:46深圳市漁業(yè)發(fā)展研究中心黃浦江徐遠(yuǎn)珍
    海洋與漁業(yè) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:羅非魚革蘭氏芽孢

    ■ 文|深圳市漁業(yè)發(fā)展研究中心 黃浦江 徐遠(yuǎn)珍

    羅非魚原產(chǎn)于非洲,包括亞種在內(nèi)共計(jì)100多種。羅非魚肉質(zhì)鮮美,無間刺,蛋白含量高,富含8種人體所需的必需氨基酸、不飽和脂肪酸等,素有“白肉三文魚”之稱。同時(shí),因其具有生長快、食性雜、耐低氧、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn),被評定為最具發(fā)展?jié)摿Φ牡厣珒?yōu)勢品種。

    甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌抗菌肽在生物保鮮劑上具有廣闊的應(yīng)用前景,甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽可使羅非魚片保質(zhì)期延長4d以上。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的抑菌代謝產(chǎn)物常見有:抑菌蛋白、蛋白酶、纖維素酶、氨肽酶、抑菌肽等,甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在細(xì)菌病的治療和食物保鮮上具有廣闊的前景。本研究使用的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌采自于深圳某羅非魚養(yǎng)殖場羅非魚腸道,研究人員對其進(jìn)行了革蘭氏染色、16S rRNA鑒定及生化鑒定,旨在為今后篩選提高羅非魚抗病能力、促進(jìn)羅非魚健康生長的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌提供理論依據(jù),從而為研發(fā)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌在羅非魚及其他經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動物養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供參考。

    材料與方法

    1.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌分離純化

    本次使用的羅非魚(200±50)g置于超凈工作臺中,用75%的酒精棉球擦拭魚體表面,解剖取出腸道。用無菌生理鹽水沖洗數(shù)遍,清除腸道內(nèi)容物,置于玻璃勻漿器中加入1mL生理鹽水進(jìn)行研磨,研磨充分后用三倍無菌生理鹽水連續(xù)稀釋,用渦旋攪拌機(jī)混勻,分別涂布于TSA、MRS、TPY、PDA平板上,每個(gè)平板涂布100μL,各種平板設(shè)置6個(gè)重復(fù),其中3個(gè)置于30℃無氧條件中培養(yǎng),另外3個(gè)置于30℃有氧條件中培養(yǎng)。48h后挑取單個(gè)菌落,反復(fù)劃線分離至獲得純菌株。通過革蘭氏染色、鏡檢,初步篩選出革蘭氏陽性桿菌。

    2.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的鑒定

    挑取上述從羅非魚腸道分離出的革蘭氏陽性菌株,提取其DNA,送公司測序。利用NCBI的Blast程序比對分析16S rRNA基因序列測序結(jié)果。利用最大簡約法和鄰接法進(jìn)行分析,用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,重復(fù)次數(shù)為1000。

    3.生化鑒定

    菌株的生化鑒定主要通過HBI蠟樣芽孢桿菌生化鑒定條和單盒生化鑒定管來鑒定。鑒定方法遵照鑒定條(管)使用說明書中的方法,在超凈工作臺上操作,用酒精棉球擦拭鑒定條(管),鑒定條用打孔器打孔,鑒定管用鑷子打開鋁蓋,注入100μL菌懸液,封蓋培養(yǎng),培養(yǎng)條件、時(shí)間及結(jié)果判定參照說明書。

    結(jié)果與分析

    1.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的分離

    從羅非魚腸道中分離出1株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌,命名為TPS-A。分離得到的菌株革蘭氏染色為陽性,顯微鏡下觀察為桿狀(圖1)。

    圖1 菌株TPS-A革蘭氏染色圖

    2.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的鑒定

    采用16sRNA PCR技術(shù)對該菌株進(jìn)行鑒定。經(jīng)廣州生工生物技術(shù)有限公司測序證實(shí),菌株TPS-A的DNA bp值為1454(圖2),基因庫編號為MK130896。

    圖2 泳道M:DNA marker DL 2000泳道1:TPS-A PCR 產(chǎn)物

    系統(tǒng)發(fā)育分析表明(圖3),菌株TPS-A與B.methylotrophicus strain CBMB205、B.velezensis strain FZB42、B.siamensis strain PD-A10的相似性分別為99.79%、98.26%、95.34%,與B.methylotrophicus strain一類物種的親緣關(guān)系最高且聚為一支,所以推薦鑒定該菌種為B.methylotrophicus strain。

    圖3 基于TPS-A 16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

    3.生化鑒定結(jié)果

    根據(jù)生化鑒定條(管)說明書提供的判定標(biāo)準(zhǔn),得出菌株TPS-A的生理生化特性如表1。菌株TPS-A,淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽肉湯試驗(yàn)等試驗(yàn)均為陽性,溶酶菌肉湯試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)等試驗(yàn)均為陰性,糖發(fā)酵結(jié)果為,菌株TPS-A可以發(fā)酵葡萄糖,不能發(fā)酵肌醇等。

    表1 羅非魚腸道分離芽孢桿菌TPS-A 的生化鑒定結(jié)果

    結(jié)論

    本次研究通過平板劃線分離、革蘭氏染色、鏡檢、16S rRNA以及生理生化鑒定等方法,成功從羅非魚腸道中分離得到了一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌,因其不具有常用抗生素耐藥性基因,使得這菌株在耐藥性基因產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移等相關(guān)研究中具有廣闊的前景,也能為羅非魚源甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的篩選、鑒定、分析和應(yīng)用提供參考。

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