無菌動(dòng)物在腸道微生物組學(xué)研究中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀

朱 茜 譚 向 武志峰 楊亞鵬 程 偉 魏 泓

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院無菌動(dòng)物平臺(tái)，武漢 430070)

腸道微生物群是動(dòng)物體最大的微生物群，據(jù)估計(jì)成人腸道內(nèi)的微生物共有1014個(gè)，接近人類體細(xì)胞數(shù)量的10倍，而且其編碼基因數(shù)量比人類基因組多100倍[1]。腸道微生物被視為機(jī)體重要的“功能器官”，與營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)等諸多生理過程密切相關(guān)。它可代謝經(jīng)宿主初級(jí)消化后殘余的蛋白質(zhì)、碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)、多酚類等[2-4]營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為機(jī)體提供可利用的營(yíng)養(yǎng)素，如多種維生素，還能依賴其代謝產(chǎn)物通過介導(dǎo)共生菌群與宿主免疫系統(tǒng)相互作用來協(xié)調(diào)腸道穩(wěn)態(tài)，而腸道穩(wěn)態(tài)是保障機(jī)體正常發(fā)育與維持健康的關(guān)鍵。自出生起，微生物群就開始在胃腸道中定植，其組成、分布等構(gòu)成了復(fù)雜的腸道生態(tài)系統(tǒng)。益生微生物可與腸道黏膜黏附、嵌合和結(jié)合，形成菌膜屏障結(jié)構(gòu)，通過競(jìng)爭(zhēng)黏膜位點(diǎn)定植、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物、代謝物抑制、促進(jìn)宿主免疫等方式抑制腸道內(nèi)病原菌入侵[5]，這對(duì)維持宿主腸道穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。腸道微生物產(chǎn)生的代謝物，如短鍵脂肪酸、色氨酸、牛磺酸等，可通過調(diào)節(jié)受體表達(dá)[6]、激活轉(zhuǎn)錄因子、增加屏障保護(hù)作用相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)或直接調(diào)節(jié)腸上皮通透性相關(guān)連接蛋白的表達(dá)等來影響腸上皮屏障功能[3]。膽汁酸也可以調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫細(xì)胞，保護(hù)腸上皮細(xì)胞并對(duì)艱難梭菌等病原體有抵抗力[7]。不僅如此，腸道微生物在誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生和維持腸道各種T細(xì)胞群的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定也起關(guān)鍵作用[8]。此外，已有眾多研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物與骨質(zhì)量[9]、神經(jīng)系統(tǒng)[10]、心血管系統(tǒng)[11]、生物節(jié)律[12]等有關(guān)。伴隨著腸道微生物因具有重要生物學(xué)作用而成為近年的研究熱點(diǎn)，無菌動(dòng)物作為腸道微生物組學(xué)廣泛而深入研究必不可少的核心工具，也越來越受到科研工作者的關(guān)注與重視。

1 無菌動(dòng)物技術(shù)體系的建立

無菌動(dòng)物是利用現(xiàn)有檢測(cè)方法檢測(cè)不到任何活微生物和寄生蟲的動(dòng)物。無菌動(dòng)物概念最早由Louis Pasteur于1885年提出[13]，直到20世紀(jì)30年代，隨著無菌隔離器的研發(fā)，無菌動(dòng)物技術(shù)才得以發(fā)展。

無菌胎生動(dòng)物通常通過子宮切除術(shù)或者胚胎移植實(shí)現(xiàn)，無菌家禽則通過蛋殼表面滅菌獲取，獲取的無菌動(dòng)物將被終身飼養(yǎng)于無菌隔離器中。1928年，Reyniers研制出不銹鋼無菌動(dòng)物隔離器[14]，之后，Trexler發(fā)明了塑料薄膜隔離器，它的制作成本僅為原來的1/10[15]。飼養(yǎng)成本下降和相關(guān)需求提升使得無菌動(dòng)物的飼養(yǎng)量大幅提高。實(shí)際上，自20世紀(jì)50年代以來，無菌動(dòng)物技術(shù)都沒有太大變化[13,16]。作為無菌動(dòng)物的典型代表，無菌小鼠因需求量大與應(yīng)用廣泛，其飼料營(yíng)養(yǎng)研究與實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)等都得以重視，因此無菌小鼠技術(shù)體系在國(guó)內(nèi)外均相對(duì)成熟，但在制備技術(shù)與檢測(cè)方法等方面仍有待提升。

無菌動(dòng)物是檢驗(yàn)宿主與微生物相互作用的重要工具，其中無菌化的基因工程小鼠可以用于研究宿主特定基因與微生物群之間的相互作用；另外，無菌動(dòng)物的菌群或菌株移植模型更是為理解宿主-菌群或菌株相互作用關(guān)系和疾病相關(guān)的微生物影響因素提供了巨大的幫助。因此，無菌動(dòng)物已成為研究微生物組的“金標(biāo)準(zhǔn)”模式動(dòng)物。

2 無菌動(dòng)物應(yīng)用于腸道微生物組學(xué)研究

2.1 無菌動(dòng)物應(yīng)用于畜牧微生物組學(xué)研究

在畜牧生產(chǎn)中，微生物組研究有助于更加全面地了解宿主、微生物、食物及病原體等相互作用關(guān)系，有助于開發(fā)飼料產(chǎn)品、防治畜禽疾病、改良生產(chǎn)性狀和拓展飼養(yǎng)策略等。

飼用抗生素最早追溯到上世紀(jì)中葉，由于它擁有促進(jìn)生長(zhǎng)和控制疾病的功能，被廣泛使用到畜牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中。用無菌雞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[17]抗生素的促生長(zhǎng)作用可能來源于其抗菌作用。目前，抗生素的促生長(zhǎng)作用主要通過調(diào)節(jié)腸道微生物來實(shí)現(xiàn)的觀點(diǎn)已被普遍認(rèn)可，有研究表明，抗生素對(duì)無菌動(dòng)物的生長(zhǎng)性能沒有任何顯著的益處[18-20]，而經(jīng)過低劑量抗生素選擇的菌群顯示促生長(zhǎng)表型可以通過菌群移植轉(zhuǎn)移到無菌動(dòng)物身上[21]。有關(guān)抗生素替代物，如益生菌等的篩選與評(píng)價(jià)可利用無菌動(dòng)物進(jìn)行驗(yàn)證，有研究[22]建立了一種悉生雞模型，并表示該模型適合于研究雞腸道菌群的作用機(jī)制以及確定益生菌的安全性和有效性等應(yīng)用評(píng)價(jià)。

在動(dòng)物疾病方面，利用無菌動(dòng)物構(gòu)建疾病模型可減少干擾因素，以便于了解病征、分析致病機(jī)制并研究防治方法。豬捷申病毒(porcine teschovirus，PTV)是一種僅感染豬的病毒，該病毒的非致病性菌株常見于家豬體內(nèi)，所以獲取非病毒攜帶者用于致病菌株疾病研究相對(duì)困難[23]。有研究[24]發(fā)現(xiàn)通過SPF豬無法建立合適的疾病模型，但在之后的研究中，他們利用無菌豬成功構(gòu)建了PTV模型，誘發(fā)了非化膿性腦脊髓炎為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并證實(shí)了PTV在受感染豬體內(nèi)的分布，該模型具有作為PTV發(fā)病機(jī)制研究模型的價(jià)值[25]。事實(shí)上，無菌動(dòng)物在人類疾病醫(yī)學(xué)上的研究應(yīng)用更為廣泛。

動(dòng)物生長(zhǎng)繁殖等經(jīng)濟(jì)性狀與腸道菌群也存在相關(guān)性。有分析[26]發(fā)現(xiàn)脂肪型榮昌豬和瘦肉型約克夏豬的腸道菌群分布特點(diǎn)、骨骼肌纖維特性和脂質(zhì)代謝特征均存在顯著差異，利用無菌小鼠接種兩者的腸道菌群發(fā)現(xiàn)受體小鼠表現(xiàn)出與供體相似的骨骼肌纖維特征及脂質(zhì)代謝特征，有研究[27]利用無菌小鼠證實(shí)腸道菌群移植可以將不同品種豬的腸道特征部分轉(zhuǎn)移給小鼠。與商品雜交仔豬相比[28]，從江小型仔豬對(duì)早期斷奶應(yīng)激性腹瀉的抵抗力更強(qiáng)，并分析了腸道菌群組成差異，通過無菌小鼠糞菌移植實(shí)驗(yàn)確定和驗(yàn)證了L.gasseri-LA39和L.framenti是介導(dǎo)腹瀉抗性的兩種關(guān)鍵功能株菌。有研究[29]發(fā)現(xiàn)患乳腺炎奶牛的糞菌移植到無菌小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)其出現(xiàn)乳腺炎癥狀，以及血清、脾和結(jié)腸炎癥，而益生菌攝入有助于減輕接種小鼠的乳腺炎病癥，表明恢復(fù)腸道菌群功能的益生菌可能是治療奶牛乳腺炎的潛在策略。以上研究均提示我們畜牧微生物作為內(nèi)在環(huán)境因素，與其生長(zhǎng)繁殖、抗病力等經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)，這些重大發(fā)現(xiàn)為改良畜禽經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)性狀提供了新思路、新途徑。

2.2 無菌動(dòng)物應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)微生物組學(xué)研究

腸道微生物在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病，如肥胖癥、兒童營(yíng)養(yǎng)不良、食物過敏、糖尿病等都與其緊密相關(guān)。

有研究[29]將肥胖志愿者菌群移植到無菌小鼠體內(nèi)成功重現(xiàn)受體小鼠肥胖表型的實(shí)驗(yàn)揭開了現(xiàn)代微生物組學(xué)研究的序幕。無菌嚙齒動(dòng)物被多次用于研究腸道菌群與肥胖之間的因果關(guān)系。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群能影響宿主能量攝入、脂肪儲(chǔ)存和食欲等[30]。盡管發(fā)現(xiàn)特征菌群可以導(dǎo)致肥胖，調(diào)節(jié)腸道菌群可作為治療肥胖癥的一種途徑，但飲食組成的影響也不可輕視。有研究[31]用不同日糧飼喂無菌和常規(guī)小鼠發(fā)現(xiàn)，腸道菌群缺乏依舊不能避免飲食誘導(dǎo)的肥胖，腸道產(chǎn)物空腹誘導(dǎo)的脂肪因子/血管生成素樣蛋白4 (Fiaf/Angptl4)與腸道菌群介導(dǎo)的脂肪存儲(chǔ)沒有必然因果關(guān)系，而以往研究認(rèn)為Fiaf/Angptl4是一種脂蛋白脂肪酶抑制劑，腸道菌群可以使其減少，從而促進(jìn)脂蛋白脂肪酶分解的脂肪酸在宿主脂肪組織中儲(chǔ)存[32]。

在許多發(fā)展中國(guó)家，兒童營(yíng)養(yǎng)不良是公認(rèn)的主要公共衛(wèi)生問題。營(yíng)養(yǎng)不良兒童的腸道菌群發(fā)育受損，而且菌群移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)了營(yíng)養(yǎng)不良的生長(zhǎng)表型可由腸道菌群介導(dǎo)，腸道菌群的不成熟與兒童營(yíng)養(yǎng)不良有因果關(guān)系[33]。有研究[34]發(fā)現(xiàn)構(gòu)建與年齡相符的成熟微生物組是治療兒童營(yíng)養(yǎng)不良的關(guān)鍵，利用無菌小鼠和無菌豬構(gòu)建悉生動(dòng)物模型，并結(jié)合多組學(xué)研究技術(shù)發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)腸道菌群成熟的食物組合。此外，兒童營(yíng)養(yǎng)不良或伴有腸道感染，如人類輪狀病毒(human rotavirus,HRV)是營(yíng)養(yǎng)不良兒童腹瀉的主要病因。有研究[35]建立了首個(gè)健康2月齡嬰兒糞菌移植的新生豬模型，并發(fā)現(xiàn)蛋白營(yíng)養(yǎng)不良加劇了HRV感染，并影響小腸上皮屏障的形態(tài)和功能。

除兒童營(yíng)養(yǎng)不良，食物過敏癥的發(fā)病率在過去50年里急劇增加，特別是在發(fā)達(dá)國(guó)家[36]。為了更好地理解共生菌對(duì)人類食物過敏癥狀的調(diào)節(jié)機(jī)制，有研究[37]將健康嬰兒和牛奶過敏嬰兒的糞便分別移植無菌小鼠，發(fā)現(xiàn)健康嬰兒的菌群可預(yù)防小鼠發(fā)生牛奶過敏，而牛奶過敏嬰兒的菌群無此保護(hù)作用，并鑒定出產(chǎn)生丁酸的梭菌屬細(xì)菌——糞厭氧棒狀菌對(duì)牛奶過敏起保護(hù)作用。腸道細(xì)菌對(duì)于調(diào)節(jié)飲食抗原的過敏反應(yīng)至關(guān)重要，這提示調(diào)節(jié)細(xì)菌群落的干預(yù)措施可能與食物過敏相關(guān)。此外，有研究[38]發(fā)現(xiàn)飲食中過量攝入脂肪引起的微生物群落改變可能增加食物過敏的易感性。總言之，調(diào)節(jié)腸道微生物或許可成為治療食物過敏的一種新策略[39]。

另外，隨著營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的深入發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)人類對(duì)飲食攝入的不同反應(yīng)可能由獨(dú)特的、可量化的宿主及微生物群落特征所驅(qū)動(dòng)。基于個(gè)性化的宿主-微生物-飲食作用關(guān)系的精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)策略將在改善人類健康方面作出巨大貢獻(xiàn)[40]。無菌動(dòng)物的相關(guān)應(yīng)用研究證實(shí)了微生物組學(xué)在精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)研究中的作用，這將進(jìn)一步推動(dòng)無菌動(dòng)物開發(fā)應(yīng)用與精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)微生物組學(xué)的“合作共贏”。

3 制約無菌動(dòng)物技術(shù)體系發(fā)展的因素

盡管無菌動(dòng)物技術(shù)現(xiàn)存已久，但是目前在我國(guó)，無菌動(dòng)物存在生產(chǎn)規(guī)模小、效率低、運(yùn)輸受限等困境。此外，無菌動(dòng)物應(yīng)用和研究體系分離都限制了無菌動(dòng)物體系的發(fā)展、無菌動(dòng)物技術(shù)的普及和應(yīng)用。

3.1 制備門檻和飼養(yǎng)要求高

無菌化制備過程是獲取不同品系或不同基因工程化無菌動(dòng)物的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，無菌哺乳動(dòng)物制備方法主要分為子宮切除法和胚胎移植法。利用子宮切除法制備無菌小鼠時(shí)，手術(shù)時(shí)間難以把握，偏早仔鼠不易成活，偏晚則容易造成微生物污染；此外，該方法獲得的仔鼠離乳率也較低。利用胚胎移植法制備無菌動(dòng)物因技術(shù)要求較高，目前正處于初步研究階段，尚未應(yīng)用于無菌動(dòng)物實(shí)際生產(chǎn)制備。

無菌動(dòng)物的飼料營(yíng)養(yǎng)問題也是制約無菌動(dòng)物體系發(fā)展的重要因素之一。動(dòng)物機(jī)體的代謝、消化等各個(gè)方面都存在差異，導(dǎo)致無法精確供給無菌動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。目前，國(guó)內(nèi)外均沒有無菌動(dòng)物統(tǒng)一的營(yíng)養(yǎng)需求標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于無菌動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求和供給只能依賴于每個(gè)團(tuán)隊(duì)自身探索研究，并形成各自保密的營(yíng)養(yǎng)配方。

有研究充分記錄了第一批無菌大鼠飼養(yǎng)成功過程，展現(xiàn)了無菌動(dòng)物的飼養(yǎng)難度[41]。由于前人的經(jīng)驗(yàn)積累，對(duì)于已有無菌動(dòng)物品系的建立已經(jīng)相對(duì)容易，但對(duì)于新的品系和物種，無菌個(gè)體的獲取及人工喂養(yǎng)等都存在諸多困難，有待克服。以上因素均在不同程度上制約了無菌動(dòng)物的開發(fā)與應(yīng)用，最終導(dǎo)致無菌動(dòng)物技術(shù)體系的發(fā)展嚴(yán)重滯后，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足腸道微生物組以及其他微生物組學(xué)發(fā)展所需。

3.2 維持成本高

無菌動(dòng)物體系對(duì)外在飼養(yǎng)環(huán)境與內(nèi)在物料供應(yīng)均要求嚴(yán)格。外界飼養(yǎng)環(huán)境最好控制在萬級(jí)及以上潔凈程度，而且需要不定時(shí)監(jiān)測(cè)與消毒滅菌處理，這樣才能盡最大可能降低污染的風(fēng)險(xiǎn)，保證高效生產(chǎn)。相比外在環(huán)境潔凈度控制，無菌動(dòng)物的飼料、飲水、墊料等物料物品的潔凈等級(jí)要求更高，必須經(jīng)過更加嚴(yán)格的滅菌和檢測(cè)合格(即無菌狀態(tài))后才可以使用，否則極易造成污染。一旦污染，損失巨大，因此無菌動(dòng)物實(shí)際生產(chǎn)需要大量訓(xùn)練有素的技術(shù)人員，然而實(shí)際工作中并沒有專門化的人員可供招聘，這勢(shì)必導(dǎo)致人員培訓(xùn)與薪資待遇費(fèi)用上漲。無菌動(dòng)物的運(yùn)輸相較一般動(dòng)物來說條件更苛刻，此外，無菌動(dòng)物的規(guī)模維持、微生物檢測(cè)等都要損耗大量的人力、物力、財(cái)力。

總之，無菌動(dòng)物體系從外到內(nèi)，從技術(shù)人員要求到遠(yuǎn)程運(yùn)輸使用等每一步相較于常規(guī)動(dòng)物而言都是升級(jí)，因此無菌動(dòng)物體系整個(gè)維持費(fèi)用成指數(shù)增長(zhǎng)，這必然制約了無菌動(dòng)物體系的開發(fā)與應(yīng)用。

3.3 配套體系不完善

無菌動(dòng)物模型是微生物組學(xué)研究的核心工具，除了自身體系建設(shè)所需設(shè)施設(shè)備有待更新改進(jìn)，相關(guān)配套體系的建設(shè)也不容忽視。

近年來，盡管無菌動(dòng)物隔離設(shè)備的研發(fā)、生產(chǎn)與使用都得到相關(guān)企業(yè)的重視與大力發(fā)展，然而仍存在功能單一、用戶體驗(yàn)不理想、智能化程度低等問題，而且國(guó)內(nèi)嚴(yán)重缺乏無菌動(dòng)物隔離設(shè)備研發(fā)生產(chǎn)的大規(guī)模商業(yè)化公司，這不僅導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)力低下而單臺(tái)隔離設(shè)備價(jià)格高昂，也使得隔離設(shè)備研發(fā)進(jìn)展嚴(yán)重遲緩。此外，無菌動(dòng)物平臺(tái)在微生物組學(xué)研究方面目前只限于模型開發(fā)與應(yīng)用，與后續(xù)的分析測(cè)試等配套系統(tǒng)幾乎完全脫離，因此整合無菌動(dòng)物平臺(tái)與多組學(xué)檢測(cè)分析平臺(tái)，打造無菌動(dòng)物開發(fā)應(yīng)用以及檢測(cè)分析的一體化技術(shù)服務(wù)平臺(tái)將更有利于無菌動(dòng)物體系的優(yōu)化升級(jí)、推廣與應(yīng)用。

4 展望

微生物組學(xué)研究與發(fā)展離不開無菌動(dòng)物的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用，其中腸道功能微生物組學(xué)研究更是如此。無菌動(dòng)物制備技術(shù)整合基因工程技術(shù)、菌群或菌株移植技術(shù)，再結(jié)合表型測(cè)定與多組學(xué)檢測(cè)方法，可探究不同品種或個(gè)體的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)和功能同重要表型性狀的相關(guān)性及因果關(guān)系，也為篩選驗(yàn)證關(guān)鍵功能菌群或菌株提供關(guān)鍵模型。在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，無菌動(dòng)物的廣泛應(yīng)用可積極推動(dòng)人類重大疾病微生物組研究及其精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)藥物產(chǎn)品研發(fā)，如基因與微生物相互作用對(duì)重要疾病表型發(fā)生發(fā)展的影響、腫瘤精準(zhǔn)生物治療；在畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域，無菌動(dòng)物的研究應(yīng)用可積極推動(dòng)畜牧生產(chǎn)中的重要?jiǎng)游锛膊?、重要?jīng)濟(jì)生產(chǎn)性狀相關(guān)微生物組學(xué)的深入研究及其應(yīng)用產(chǎn)品研發(fā)，如開展腸道菌群靶標(biāo)活性飼料研發(fā)、加強(qiáng)腸道菌群靶標(biāo)健康養(yǎng)殖研發(fā)[42]。隨著微生物基礎(chǔ)研究的厚積薄發(fā)，功能微生物組學(xué)將不斷煥發(fā)新的活力，無菌動(dòng)物技術(shù)體系的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用也將不斷被重視，無菌技術(shù)不斷更新發(fā)展，逐步形成產(chǎn)、學(xué)、研一體的綜合性研究應(yīng)用體系。當(dāng)然，為了應(yīng)對(duì)更廣闊的市場(chǎng)需求，現(xiàn)階段無菌動(dòng)物技術(shù)體系在制備技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)供給、設(shè)施設(shè)備研發(fā)等多方面仍需進(jìn)一步完善，建立高效一體化應(yīng)用體系，更好地服務(wù)于科學(xué)研究。