海立嚙齒桿菌OmpA基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性

邢 進(jìn) 馮育芳 張雪青 高 強(qiáng) 趙德明 岳秉飛

(1.中國食品藥品檢定研究院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所/國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫，北京 102629) (2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurellapneumotropica, Pp)是嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中非常重要的條件致病菌，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)檢測國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，SPF級(jí)動(dòng)物必須排除[1]。北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量抽檢結(jié)果中，嗜肺巴斯德桿菌是檢出率最高的病原菌[2]，是造成SPF級(jí)動(dòng)物不符合標(biāo)準(zhǔn)的主要因素。根據(jù)最新分類學(xué)研究，嗜肺巴斯德桿菌被重新劃分為海立嚙齒桿菌(Rodentibacterheylii,Rh)和嗜肺嚙齒桿菌(Rodentibacterpneumotropica, Rp)，二者分別對應(yīng)原Heyl和Jawetz兩種生物型[3-4]。目前現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)，海立嚙齒桿菌(Rh)和嗜肺嚙齒桿菌(Rp)仍同時(shí)作為嗜肺巴斯德桿菌進(jìn)行檢測。

外膜蛋白A(OmpA)是革蘭陰性細(xì)菌的主要外膜蛋白之一，在綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、流感嗜血桿菌和衣原體等病原菌中具有重要的致病作用。OmpA通過參與細(xì)菌黏附侵襲過程，逃避宿主防御或促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激因子，幫助細(xì)菌在宿主體內(nèi)存活具有重要作用。這些致病作用最常與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病和泌尿生殖系統(tǒng)疾病有關(guān)[5]。

RTX和YadA可能是嗜肺巴斯德桿菌的重要毒力因子[6-7]，二者分別是巴斯德菌科[8]和耶爾森氏菌的主要毒力基因[9]，與嗜肺嚙齒桿菌相比，海立嚙齒桿菌具有更高的毒力[10]，相關(guān)研究多圍繞前者開展[11-12]，尚缺乏針對海立嚙齒桿菌的研究。在北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嗜肺巴斯德桿菌陽性樣本中，以海立嚙齒桿菌感染為主，占比90%[12]，因此有必要對海立嚙齒桿菌展開深入研究。本研究采用同源重組技術(shù)構(gòu)建海立嚙齒桿菌OmpA基因缺失株，研究該基因缺失株的生物學(xué)特性及對小鼠的致病性，為闡明海立嚙齒桿菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。對于優(yōu)化檢測項(xiàng)目，完善我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測體系，不斷提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)4～5周齡雄性15只ICR小鼠，由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(京)2017-0005】，使用許可證號(hào)【SYXK(京)2017-0013】。本實(shí)驗(yàn)由動(dòng)物福利倫理審查，倫理審批號(hào)：中檢動(dòng)(福)第2019(B)023號(hào)。所有受試動(dòng)物經(jīng)qPCR和培養(yǎng)法檢測，海立嚙齒桿菌和嗜肺嚙齒桿菌均為陰性。

1.1.2菌株和載體：海立嚙齒桿菌小鼠分離株P(guān)P320，本實(shí)驗(yàn)室保存；海立嚙齒桿菌ATCC12555、嗜肺嚙齒桿菌ATCC35149購自ATCC；大腸桿菌CMCC44117購自CMCC。自殺質(zhì)粒pDS132由中國食品藥品檢定研究院食品化妝品檢定所崔生輝博士惠贈(zèng)；S17-1λpir購自莊盟生物公司；大腸桿菌DH5α pET-30a菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3主要試劑：哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(OXIOD公司)，胰酪蛋白胨液體培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、LB培養(yǎng)基(BD公司)，SOC液體培養(yǎng)基(Solarbio公司)，氯霉素、卡那霉素(生工生物有限公司)，DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、無菌PBS(Gibco公司)。

高保真PrimerSTAR預(yù)混液(TaKaRa公司)，限制性內(nèi)切酶SacI、SphI(NEB公司)，EasyGeno無縫克隆試劑盒(天根生化科技有限公司)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen公司)，瓊脂糖膠回收試劑盒(全式金有限公司)。

1.1.4引物:根據(jù)Genbank海立嚙齒桿菌 Ppn222全基因組序列(NCBI Reference Sequence: NZ_MLAF01000014.1)、卡那霉素抗性基因(KanR)和pDS132質(zhì)粒序列，CE design1.04(Vazyme)軟件和Primer premier 6.0設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程有限公司合成，見表1。

1.2 方法

1.2.1上下同源臂和Kan抗性基因的擴(kuò)增：試劑盒提取海立嚙齒桿菌分離株P(guān)P320基因組。分別以O(shè)vLF/OvLR、OvRF/OvRR為引物，擴(kuò)增OmpA基因的兩側(cè)序列作為其上下游同源臂；以pET-30a質(zhì)粒為模板，OvKanF/OvKanR擴(kuò)增Kan抗性片斷，PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)。

1.2.2Overlap：PCR構(gòu)建OL-Kan-OR同源片斷：以稀釋10倍的上、下游同源臂和Kan抗性基因PCR產(chǎn)物為模板，引物OvpDSF/OvpDSR擴(kuò)增OL-Kan-OR同源片斷。反應(yīng)條件：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)。

1.2.3自殺重組質(zhì)粒的構(gòu)建：提取S17-1λpir/pDS132質(zhì)粒，經(jīng)SacI和SphI雙酶切線性化。按試劑盒說明，將pDS132線性化質(zhì)粒與PP320上、下同源臂純化片斷連接，反應(yīng)體系：2×EasyGeno Assenmbly Mix 5 μL，切線性pDS132(32 ng/μL)1 μL，OL-Kan-OR(56 ng/μL)1 μL，補(bǔ)水至10 μL，50 ℃反應(yīng)15 min。重組質(zhì)粒加入S17-1λpir感受態(tài)細(xì)胞中，熱激法轉(zhuǎn)化后經(jīng)30 μg/mL氯霉素和10 μg/mL卡那霉素LB篩選，雙酶切后測序驗(yàn)證。

1.2.4OmpA基因缺失株的構(gòu)建：按常規(guī)方法制備PP320電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞[14]，100 μL PP320感受態(tài)細(xì)胞與20 μg 重組自殺質(zhì)粒輕柔混勻，0.2 cm電擊杯中2.5 kV，25 μF，400 Ω電擊，電擊后立即加入1 mL SOC培養(yǎng)基，37℃下180 r/min搖振復(fù)蘇3 h。在卡那霉素(10 μg/mL)和含氯霉素(30 μg/mL)的10%蔗糖BHI瓊脂平板中篩選基因缺失株。隨機(jī)挑選10個(gè)CmR和KanR雙交換子單菌落，用引物RhompAF/RhompAR和KanF/KanR分別PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的OmpA缺失株命名為Rh320△ompA。

1.2.5遺傳穩(wěn)定性：Rh320△ompA在5%血瓊脂平板上連續(xù)傳20代，用16 S rDNA測序引物FD1/RP2、RhompAF/RhompAR和KanF/KanR對各代菌株做菌落PCR鑒定，16 S rDNA產(chǎn)物測序驗(yàn)證。PP320和Rh320△ompA分別用梅里埃API20E紙條和全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進(jìn)行生化和質(zhì)譜鑒定。

1.2.6生長曲線測定：將PP320和Rh320△ompA分別接種于BHI，36 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，調(diào)至相同濃度后接種于250 mL BHI培養(yǎng)瓶中，36 ℃ 200 r/min搖振培養(yǎng)11 h，每隔1 h吸取菌液測定濃度。以菌液的濁度值為縱坐標(biāo)，時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，繪制原分離和突變株的生長曲線。

1.2.7生物被膜形成能力比較：參考文獻(xiàn)[15]報(bào)道的方法，BHI中新鮮培養(yǎng)的PP320及Rh320△ompA調(diào)至濃度為McF0.5，再用BHI稀釋20倍加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，200 μL/孔，重復(fù)6孔，大腸桿菌CMCC44117作陰性對照，36 ℃培養(yǎng)過夜；次日棄去菌液，滅菌去離子水漂洗、晾干后每孔加入200 μL的1%草酸銨結(jié)晶紫染液，染色15 min；棄染液后每孔加入95%乙醇200 μL脫色30 min；漂洗扣干后用酶標(biāo)儀測定630波長下的吸光度值。

1.2.8MLE-12 細(xì)胞的黏附侵襲實(shí)驗(yàn)：參考Steele-Mortimer[16]和Mellor[17]的方法，檢測Rh320△ompA對MLE-12細(xì)胞的黏附能力。血瓊脂上過夜培養(yǎng)的Rh320△ompA用PBS制成0.5×108CFU/mL菌液；離心漂洗后感染細(xì)胞強(qiáng)度MOI為100∶1(細(xì)胞∶細(xì)菌)，37 ℃和5% CO2中培養(yǎng)1 h；貼壁吸出菌液，PBS清洗后重懸細(xì)胞并做10倍梯度稀釋；各稀釋度10 μL加入血瓊脂培養(yǎng)基36 ℃過夜培養(yǎng)，重復(fù)5次，36 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算菌落數(shù)[18]；菌落平均值與相應(yīng)稀釋度相乘即為黏附菌數(shù)，黏附率為黏附菌數(shù)/總菌數(shù)。

1.2.9致病性實(shí)驗(yàn)：前期經(jīng)動(dòng)物感染和改良寇氏法測得PP320腹腔感染小鼠的半數(shù)致死量(LD50)約為107CFU/mL。據(jù)此，PBS制備PP320和Rh320△ompA 1×109CFU/mL菌液，腹腔注射ICR小鼠，分為PP320、Rh320△ompA和PBS 3組，每組各5只，0.5 mL/只，每2 h觀察小鼠狀態(tài)。

1.2.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：PP320和Rh320△ompA的生物被膜測定、對MLE-12細(xì)胞的黏附侵襲結(jié)果和對小鼠致病力結(jié)果差異性分析使用SPSS 19.0(IBM)進(jìn)行。生物被膜結(jié)果采用Student’st-檢驗(yàn)，對MLE-12細(xì)胞黏附侵襲力和致病力結(jié)果采用Pearson卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OmpA缺失突變株的構(gòu)建

2.1.1OmpA缺失片斷OL-Kan-OR的構(gòu)建：以PP320基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到601 bp和720 bp的OmpA基因上、下同源臂；以pET-30a質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到1 013 bp抗性基因；經(jīng)Overlap PCR擴(kuò)增上述膠回收產(chǎn)物，獲得2 334 bp連接片斷OL-KanR-OR，見圖1。

注：1.100 bp DNA Marker；2.OmpA上游同源臂；3.OmpA下游同源臂；4.Kan基因；5.OL-KanR-ORNote：1.100 bp DNA Marker; 2. Upstream homologous arm of OmpA;3. Downstream homologous arm of OmpA;4. Kan gene; 5. OL-KanR-OR圖1 OmpA上、下臂、Kan抗性片斷的擴(kuò)增和同源片斷OL-Kan-OR的構(gòu)建Fig.1 Upstream and downstream homologous armsof OmpA、amplification Kan resistance fragment andConstrucion of homology fragment OL-Kan-OR

2.1.2pDS132-OL-KanR-OR重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建：OL-KanR-OR同源缺失片斷與pDS132酶切線性化質(zhì)粒經(jīng)無縫連接，熱激轉(zhuǎn)入S17-1λpir感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后，用SacI和SphI雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒，獲得5 000 bp和2 000 pb以上酶切片斷，經(jīng)測序驗(yàn)證無誤，成功構(gòu)建pDS132-OL-KanR-OR重組自殺質(zhì)粒，見圖2。

注：1.1 000 bp DNA Marker；2.重組質(zhì)粒SacI/SphI酶切產(chǎn)物；3.pDS132重組質(zhì)粒Note：1.1 000 bp DNA Marker; 2. Xba I and Hind III digested productsof the recombinant plasmid; 3. pDS132 recombinant plasmid圖2 重組自殺質(zhì)粒及酶切驗(yàn)證Fig.2 Agarose electrophoretogram of recombinantsuicide plasmid and digestion

2.1.3OmpA缺失株的篩選及驗(yàn)證：pDS132-OL-KanR-OR重組自殺質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)入PP320感受態(tài)細(xì)胞，篩選CmR和KanR的陽性克隆。挑取10個(gè)單克隆，用引物RhompAF/RhompAR擴(kuò)增OmpA基因，結(jié)果均為陰性；用引物KanF/KanR擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，在1 000 bp左右均出現(xiàn)目的條帶，見圖3，4。

注：1、14：100 bp DNA Marker；2～11.Rh320△ompA突變株；12.PP320單菌落；13.空白對照Note：1、14:100 bp DNA Marker; 2～11. Rh320△ompA mutant strains;12. PP320 single colony; 13. Blank control圖3 Rh320△ompA突變株OmpA基因的擴(kuò)增Fig.3 Amplification of OmpA inmutant strain Rh320△ompA

注：1、14.100bp DNA Marker；2～11.Rh320△ompA突變株；12.PP320單菌落；13.空白對照Note:1,14.100 bp DNA Marker; 2～11. Rh320△ompA mutant strains;12. PP320 single colony; 13. Blank control圖4 Rh320△ompA突變株卡那霉素抗性基因擴(kuò)增Fig.4 Amplification of Kanamycin resistancegene in mutant strain Rh320△ompA

2.2 OmpA缺失突變株的生物學(xué)特性

2.2.1Rh320△ompA突變株的遺傳穩(wěn)定性：Rh320△ompA經(jīng)20代連續(xù)傳代，經(jīng)16S rDNA、OmpA和Kan基因引物擴(kuò)增，結(jié)果一致。16S rDNA目的片斷測序驗(yàn)證無誤，Genbank BLAST比對登錄號(hào)為MH990317.1；各代菌株OmpA片斷陰性，Kan片斷陽性。

PP320和Rh320△ompA突變株用梅里埃API20E生化鑒定試紙條鑒定，各生化項(xiàng)目結(jié)果一致，結(jié)果編碼為111506414，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢?yōu)槭确伟退沟聴U菌(數(shù)據(jù)庫未更新為海立嚙齒桿菌)。

利用全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)對PP320和Rh320△ompA突變株進(jìn)行鑒定，結(jié)果均為嗜肺巴斯德桿菌(數(shù)據(jù)庫未更新為海立嚙齒桿菌)，均出現(xiàn)25～30條左右質(zhì)譜峰，二者僅在8 854.86 m/z處存在峰值差異，其他部分無明顯差異，見圖5。

注：A.PP320；B.Rh320△ompANote：A.PP320；B.Rh320△ompA圖5 PP320與Rh320△ompA的質(zhì)譜峰圖Fig.5 Mass spectrogram of PP320 and Rh320△ompA

2.2.2生長曲線：兩株菌生長曲線基本一致，在6～9 h的對數(shù)生長期，Rh320△ompA繁殖速率略低于PP320，培養(yǎng)至10 h左右，菌液濃度均達(dá)McF3.0的穩(wěn)定期，見圖6。

圖6 PP320和Rh320△ompA的生長曲線Fig.6 Growth curve of PP320 and Rh320△ompA

2.2.3生物被膜檢測：基因缺失株Rh320△ompA和野生株P(guān)P320的A630平均值分別為0.110和0.092，Rh320△ompA生物膜形成能力顯著增加(P<0.01)。

2.2.4侵染MLE-12黏附率檢測：用PP320和Rh320△ompA突變株侵染MLE-12細(xì)胞后，二者的平均感染菌量、平均黏附菌數(shù)和黏附率分別為1.8×105CFU/mL、7.9×104CFU/mL、43.9%和4.1×105CFU/mL、7.5×104CFU/mL、18.3%，黏附力下降顯著(X2=43 619.064，P<0.001)。

2.2.5對小鼠的致病性：注射PP320菌液的小鼠在8 h內(nèi)全部死亡，而注射Rh320△ompA突變株菌液的小鼠死亡率為1/5(20%)，二者對小鼠致死率差異顯著(X2=11.667，P<0.001)，對照小鼠全部正常。發(fā)病小鼠表現(xiàn)為精神沉郁，被毛直立，蜷縮于鼠盒角落。瀕死小鼠眼部紅腫，呼吸急促，部分肛門處沾有糞便；急性發(fā)病小鼠口鼻出血后死亡。

3 討論

細(xì)菌感染宿主引發(fā)疾病甚至死亡的過程需要多種毒力因子的參與。毒力因子大部分是細(xì)菌的一些分泌性蛋白及菌體表面成分，這些蛋白成分可直接對宿主細(xì)胞造成損傷，或者介導(dǎo)細(xì)菌在致病過程中對宿主細(xì)胞的黏附和侵襲過程，也可能具有幫助病原微生物抵御機(jī)體防御系統(tǒng)的作用。外膜蛋白(OMPs)是巴斯德菌中已知與毒力和免疫密切相關(guān)的重要因子[19]，但嗜肺巴斯德桿菌(海立嚙齒桿菌和嗜肺嚙齒桿菌)的毒力因子始終未得到確認(rèn)。其中OmpA在革蘭陰性細(xì)菌中具有多種功能，在某些細(xì)菌中可誘導(dǎo)免疫保護(hù)，作為主要免疫原性蛋白和免疫逃逸素，同時(shí)也是細(xì)菌的一種毒力相關(guān)因子，如黏附素、侵襲素和生物膜的形成也受OmpA蛋白的調(diào)節(jié)。為了揭示OmpA對于海立嚙齒桿菌黏附和致病性的相關(guān)性，本研究利用Overlap PCR制備攜帶Kan抗性基因的上下同源臂片斷，與自殺質(zhì)粒pDS132連接，構(gòu)建自殺重組質(zhì)粒。通過電轉(zhuǎn)化將自殺重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入分離株P(guān)P320感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)相應(yīng)抗生素和蔗糖的雙重篩選，構(gòu)建了本地分離株的OmpA缺失菌株。

通過對OmpA基因缺失株的生化鑒定、質(zhì)譜鑒定、生長速率、生物被膜、對細(xì)胞黏附力變化和對小鼠致病性等生物學(xué)特性的研究。所構(gòu)建的OmpA基因缺失株與野生株相比較，生化特征未發(fā)生改變；質(zhì)譜峰圖株基本一致，但數(shù)據(jù)庫尚未更新，結(jié)果仍報(bào)告為嗜肺巴斯德桿菌；生長曲線基本一致，在6～9 h的對數(shù)增長期略慢于野生株，在本實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)間終點(diǎn)(10 h)時(shí)達(dá)到的菌量相同?；蛉笔е甑纳锬ば纬赡芰Ω哂谝吧?，可能OmpA基因的缺失對Rh320△ompA的生物膜形成起到了反饋調(diào)節(jié)作用，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。基因缺失株對MLE-12細(xì)胞的黏附力低于野生株，表明OmpA的缺失降低了海立嚙齒桿菌對細(xì)胞的黏附能力。基因缺失株對小鼠致死率明顯下降，證實(shí)OmpA在海立嚙齒桿菌的感染過程中對侵襲小鼠起到了關(guān)鍵作用。給菌后的小鼠同樣表現(xiàn)出典型的感染癥狀，精神萎靡、被毛直立、眶周紅腫和排便失禁等，說明相關(guān)致病機(jī)制有待深入研究。