八寶丹抑制胃癌細胞移植瘤生長及上皮-間質轉化

魏麗慧，劉建鑫，黃 彬，方 翌，林久茂*

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建福州 350122；3.中西醫(yī)結合基礎福建省高校重點實驗室，福建福州 350122）

胃癌（gastric cancer，GC）是一種常見的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年有100多萬新病例，是男性第四常見的癌癥，女性第七常見的癌癥［1-3］。盡管在外科手術和輔助治療方面取得了很大的進展，但胃癌的高轉移率，五年生存率仍較低［4］。因此，防治腫瘤轉移是提高胃癌患者生存率及生活質量的重要方式。研究發(fā)現(xiàn)，細胞發(fā)生上皮-間充質轉化（EMT）是腫瘤細胞轉移的起始因素［5］。通過EMT過程，上皮細胞極性喪失，細胞間連接中斷，細胞骨架重組，細胞形態(tài)由扁平變?yōu)樗笮?，由此侵入血液系統(tǒng)并轉移到其他器官［6］。因此尋找逆轉EMT的藥物是當前亟待解決的重要問題。

中醫(yī)注重未病先防、已病防變的治“未病”，符合胃癌當前的治療現(xiàn)狀。已有四百多年歷史的傳統(tǒng)中藥復方八寶丹，由天然牛黃、蛇膽、珍珠、羚羊角、三七、天然麝香等名貴中藥材組成，具有清熱解毒、活血化瘀、去黃止痛之效，臨床上被廣泛用于腫瘤和炎癥的治療［7-10］。前期研究表明，八寶丹具有抑制胃癌細胞增殖、誘導細胞凋亡及抑制轉移的作用［11-13］，但是否具有逆轉EMT作用及作用機制尚未見報道。因此，本課題擬在前期實驗的基礎上，通過構建MGC80-3裸鼠皮下移植瘤模型，觀察八寶丹對胃癌細胞EMT的影響及調控機制，進一步豐富八寶丹的抗癌作用及作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 人胃癌細胞株MGC80-3購于中國科學院上海生科院細胞資源中心，保存于福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院實驗中心液氮罐中。

1.2 實驗動物 BALB/c裸鼠，20只，雄性（18～20 g，4周齡，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證：SCXK（滬）2018-0016，在福建中醫(yī)藥大學實驗中心動物房SPF級實驗室飼養(yǎng)，實驗室溫度濕度恒定，每天光照時間12 h，正常飲水及飲食。

1.3 實驗藥物 八寶丹（廈門中藥廠，批號：180101），組方主要包括天然牛黃、蛇膽、珍珠、羚羊角、三七、天然麝香。

1.4 實驗試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、BCA法蛋白定量分析試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SDS-PAGE配制凝膠試劑盒、NC膜（德國Merck Millipore公司）；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（蘇州宇恒生物科技有限公司）；一抗、二抗稀釋液（武漢博士德生物工程有限公司）；E-cadherin、Vimentin、Smad2/3及p-Smad2/3（美國CST公司）；MMP2、MMP9、TGF-β1、β-actin、兔二抗及鼠二抗（美國Proteintech Group公司）。

1.5 實驗儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Countes?全自動細胞計數(shù)儀（美國Life公司）；干式恒溫金屬浴（上海培清科技有限公司）；小型垂直電泳槽、Trans-Blot小型轉印槽轉膜儀、超高靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 八寶丹藥液配制 用生理鹽水將八寶丹配成濃度為25 mg/mL的八寶丹母液，存于4℃冰箱備用。

2.2 細胞完全培養(yǎng)基配制 在RPMI-1640空白培養(yǎng)基中加入10%體積的胎牛血清和1%體積的青霉素-鏈霉素，存于4℃冰箱備用。

2.3 裸鼠皮下移植瘤模型構建 MGC80-3細胞以1.5×105個/mL的密度接種于75 cm2的大培養(yǎng)瓶中，每瓶15 mL，觀察細胞狀態(tài)，當細胞的匯合度長到90%～100%時，用0.25%EDTA胰蛋白酶消化細胞，待細胞從培養(yǎng)瓶底部脫落后加入5 mL的完全培養(yǎng)基終止消化。離心，細胞沉淀用空白RPMI-1640培養(yǎng)基清洗3次后重懸，調整細胞密度為3×106個/mL，與基質膠1∶1充分混勻（冰上進行）。于每只裸鼠右前肢腋窩處注射200μL的細胞懸液，共計20只。接種后每日觀察裸鼠的生長狀態(tài)和移植瘤的生長情況。

2.4 動物分組與給藥 瘤體長約至80～100 mm3時，按瘤體體積隨機分為對照組和八寶丹組各10只。八寶丹組按0.25 mg/kg予八寶丹藥液灌胃，對照組予等容積的生理鹽水灌胃，每周給藥6 d。隔日對裸鼠進行稱重、測量瘤體最長徑L和最短徑W，計算移植瘤體積，繪制移植瘤的生長曲線圖。

2.5 動物取材和標本采集 注射2%的戊巴比妥鈉麻醉后用頸椎脫臼法將裸鼠處死，將瘤體組織剝離取出，先保存于液氮中。

2.6 Western blot法檢測蛋白表達 瘤體放置2 mL的離心管中，加入研磨鋼珠進行研磨，分別加入300～500μL的RIPA裂解液，提取總蛋白。然后用BCA定量試劑盒進行定量。每組樣本取50μg的蛋白上樣，進行電泳，結束后，將蛋白轉移至NC膜上，加入相應的一抗4℃孵育過夜，用TBST清洗3次后，孵育二抗，2 h后用TBST清洗3次，最后于化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影、拍照。

2.7 HE染色法觀察肝、腎組織形態(tài) 肝、腎組織于多聚甲醛溶液中固定48 h后，再轉移至70%無水乙醇脫水12 h。將肝、腎組織取出，修剪成合適大小（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）的組織塊，接著進行脫水，石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟，蘇木素染色，伊紅染色，吹干，封片。在Leica顯微鏡下隨機選取六個視野進行拍照。

2.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，方差齊者采用單因素方差分析；方差不齊者采用秩和檢驗。不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗。

3 結果

3.1 八寶丹抑制移植瘤的生長 如圖1所示，給藥第7天開始，八寶丹組裸鼠移植瘤的體積明顯低于對照組（P＜0.05）。如圖2所示，2組裸鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。以上實驗結果表明，八寶丹具有抑制MGC80-3細胞移植瘤生長的作用，對裸鼠的體質量無影響。

圖1 2組裸鼠瘤體體積比較

圖2 2組裸鼠體質量比較

3.2 2組裸鼠瘤體中E-cadherin、Vimentin蛋白表達比較 如圖3所示，與對照組比較，八寶丹組中E-cadherin的表達明顯上調（P＜0.05），Vimentin的表達明顯下調（P＜0.05），提示八寶丹具有逆轉胃癌細胞EMT的作用。

圖3 2組裸鼠瘤體中E-cadherin、Vimentin蛋白表達比較

3.3 2組裸鼠瘤體中MMP2、MMP9蛋白表達比較如圖4所示，與對照組比較，八寶丹組中MMP2和MMP9蛋白的表達顯著下調（P＜0.05），提示八寶丹可能通過抑制MMP2和MMP9的表達，從而抑制胃癌移植瘤生長及EMT。

圖4 2組裸鼠瘤體中MMP2、MMP9蛋白表達比較

3.4 八寶丹抑制移植瘤細胞TGF-β/Smad信號通路的活化 如圖5所示，與對照組比較，八寶丹組中TGF-β1、p-Smad2/3的表達明顯下調（P＜0.05），而總蛋白Smad2/3沒有改變（P＞0.05），提示八寶丹具有抑制裸鼠皮下移植瘤細胞TGF-β/Smad信號通路活化的作用。

圖5 2組裸鼠瘤體TGF-β、p-Smad2/3、Smad2/3蛋白表達比較

3.5 2組裸鼠肝、腎組織病理形態(tài)觀察 如圖6所示，2組肝細胞無水腫及壞死，肝小葉結構正常、分界明顯，肝細胞索排列整齊，肝細胞索間可見不規(guī)則的肝血竇，竇腔內可見枯否氏細胞。2組腎小球結構清晰，無增生及固縮，腎小囊無膨大，毛細血管叢基底膜無增厚表現(xiàn)。實驗結果提示八寶丹對裸鼠無肝、腎毒性。

圖6 2組裸鼠肝、腎組織HE染色圖（×400）

4 討論

由于缺乏有效的腫瘤轉移治療方法，近十年來胃癌的病死率并沒有明顯下降。并且臨床上許多胃癌患者被診斷時已發(fā)生轉移。因此，迫切需要尋找有效的防治胃癌轉移的藥物。與現(xiàn)代化療藥物相比，中醫(yī)注重未病先防、已病防變治“未病”，并且副作用少，越來越受到患者和臨床醫(yī)生的青睞。具有400多年歷史的中藥復方八寶丹，在包括腫瘤等多種疾病中發(fā)揮很好的治療作用，可以消除腫塊、去除炎癥、減輕疼痛，并且輔助化療可以提高臨床療效，改善患者的不良反應［7-13］。因此，本課題在此研究基礎上，進一步觀察及闡明八寶丹防治胃癌轉移及其作用機制。首先構建了胃癌細胞皮下裸鼠移植瘤模型，證實八寶丹具有抑制瘤體生長的作用，并對裸鼠體質量沒有明顯的影響。這與課題組前期報道的結果一致。另外，大量的證據(jù)表明，上皮性癌細胞在早期入侵血液或轉移到其他組織是由EMT驅動的［5］。細胞在發(fā)生EMT時，失去了細胞極性，與周圍和基質細胞接觸減少，細胞遷移和運動能力增加；同時細胞表型發(fā)生了改變，細胞喪失上皮表型，如E-鈣黏素（E-cadherin）減少，獲得間充質表型，如Vimentin、纖連蛋白、N-鈣黏素等增加［6］。因此，本實驗同時檢測了移植瘤瘤體中EMT相關的蛋白表達，結果表明八寶丹顯著提高E-cadherin表達，降低Vimentin表達。研究提示，八寶丹具有逆轉胃癌細胞EMT的作用。

研究報道，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）屬于鋅依賴性內肽酶家族，其功能主要是降解細胞外基質（ECM），維持細胞外基質的動態(tài)平衡。其中，MMP2和MMP9是其重要的成員，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移過程中發(fā)揮調控的作用，可以促進腫瘤細胞生長、侵襲和轉移，促進腫瘤血管形成［14］。因此在本實驗中，也觀察了八寶丹對MMP2和MMP9蛋白的影響。結果發(fā)現(xiàn)八寶丹顯著的抑制MMP2和MMP9蛋白的表達。

EMT受多條信號通路調控，其中TGF-β/Smad通路是其經(jīng)典調控通路之一［6］。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β與細胞表面受體結合后，形成異源三聚體，異源三聚體通過磷酸化激活受體調節(jié)型Smad（R-smad）蛋白，磷酸化的R-smad蛋白在胞漿中累積，與共同調節(jié)型（Co-smad）smad蛋白結合后，在Co-smad蛋白的幫助下，轉移至細胞核，與靶基因結合，進而調節(jié)細胞增殖、凋亡及EMT相關蛋白的表達。其中Rsmad包括smad2、smad3；Co-smad包括smad4［15］。另外，TGF-β還可誘導MMP-2、MMP9的表達，促進基底膜降解，為腫瘤細胞快速生長、侵襲提供良好的環(huán)境，導致腫瘤發(fā)生與發(fā)展［16］。本研究結果顯示，八寶丹可以下調TGF-β1和p-Smad2/3的表達，證實八寶丹可以阻斷TGF-β/Smad信號通路的活化。但是，對于八寶丹是否通過抑制TGF-β/Smad信號通路的活化發(fā)揮抑制胃癌細胞增殖及逆轉EMT進程還需要進一步驗證。

另外，藥物的安全性問題一直以來是中藥臨床應用關注的熱點。為了評價八寶丹的藥物安全性和探究是否對裸鼠具有肝、腎的毒理作用。在本課題研究中，首先觀察實驗過程中裸鼠的生長狀況，確認了實驗過程中無裸鼠死亡，且活動度可、狀態(tài)良好。在動物實驗結束后，對裸鼠體質量進行動態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)八寶丹對裸鼠體質量沒有影響。并運用HE染色觀察裸鼠的肝、腎的細胞形態(tài)，結果表明八寶丹沒有改變裸鼠肝、腎的細胞形態(tài)。

綜上所述，八寶丹具有抑制胃癌生長及逆轉細胞EMT的作用，下調MMP2、MMP9蛋白的表達及抑制TGF-β/Smad信號通路的活化可能是其重要的調控機制之一。