捏脊按摩對大鼠缺血缺氧性腦病的干預作用及機制研究

黃惠榕，余真鈴，繆少芳，薛佳璐，余夢霞，吳翠娟，仇志琴

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學護理學院，福建福州 350122）

新生兒缺血缺氧性腦病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是指圍生期因缺氧和腦血流減少或暫停所致的腦組織缺氧缺血性損害，嚴重可導致新生兒死亡或造成智能低下、癲癇、共濟失調(diào)等不可逆腦損害，給家庭和社會帶來嚴重負擔［1］。據(jù)估計，HIE的發(fā)病率約為活產(chǎn)兒的1‰～8‰，10%～60%的患兒發(fā)生死亡，至少25%的存活嬰兒有長期的神經(jīng)發(fā)育后遺癥［2］。HIE新生兒存在一定程度缺氧及酸中毒，可引起血管內(nèi)皮細胞受損腫脹及組織器官損傷，激活凝血系統(tǒng)，形成血液高凝狀態(tài)，繼而形成微血栓，導致腦微循環(huán)障礙，進一步加重腦細胞缺血缺氧，如此惡性循環(huán)［3］。組織因子（tissue factor，TF）和組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）是血管內(nèi)皮損傷時由血管內(nèi)皮細胞高度表達分泌的凝血和抗凝物質(zhì)［4］，兩者之間的相互作用可以調(diào)節(jié)人體血栓形成［5］。研究表明，捏脊按摩可能通過增加腦血流量，提高腦部營養(yǎng)供應(yīng)，從而促進HIE幼鼠體格發(fā)育，改善早期神經(jīng)行為［6］。而捏脊按摩治療HIE的作用機制是否與調(diào)節(jié)體內(nèi)TF、TFPI表達水平相關(guān)，目前尚無相關(guān)報道。因此，本研究通過建立HIE大鼠模型，從血液微循環(huán)的角度探討捏脊按摩對HIE大鼠的作用機制，為捏脊按摩治療HIE提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選取42日齡健康清潔級SD大鼠100只，體質(zhì)量（190±20）g，雌雄各半，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心代購并飼養(yǎng)，使用許可證號：SYXK（閩）2020-0002。飼養(yǎng)條件為屏障環(huán)境，室溫22～26℃，光照控制12 h，自由采食飲水。實驗過程對動物的處置符合中華人民共和國科學技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》［7］。

1.2 實驗藥物 單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1，西南藥業(yè)股份有限公司），用0.9%氯化鈉溶液稀釋成濃度為1 mg/mL的GM1溶液。

1.3 實驗試劑 高純氮氣（華新達氣體）；戊巴比妥鈉（上海安譜科學儀器有限公司）；4%多聚甲醛（南通市衛(wèi)寧實驗器材有限公司）；石蠟（上海艾研生物科技有限公司）；中性樹膠（上海鈺博生物科技有限公司）；蘇木素、伊紅（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，廣州和為醫(yī)藥科技有限公司）；大鼠TF ELISA試劑盒、大鼠TFPI ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.4 實驗儀器 XBS-03＋恒溫缺氧箱（杭州愛普儀器設(shè)備有限公司）；TS-92搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；DYY-6C恒溫箱（北京六一生物科技有限公司）；MM721AAU-PW微波爐（廣州美的廚房電器制造有限公司）；M199切片刀（金華市華速科技有限公司）；YD-315石蠟切片機（浙江金華益迪試驗器材）；BMJ-A石蠟包埋機（常州市中威電子儀器有限公司）；BCD-245F普通冰箱（合肥榮事達三洋電器股份有限公司）；E-201-C精密pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；BA210T光學顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；Aquaplore 2S超純水儀（美國艾科浦國際有限公司）；Infinite F50多功能酶標分析儀（瑞士Tecan公司）；PW-812全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；TGL-18M臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；LyserPro GS60201程序式冷凍組織破碎儀（莫納生物科技有限公司）；超低溫冰箱（浙江捷盛制冷科技有限公司）；精密電子秤（昆山優(yōu)科維特電子科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 模型的建立與評估 參照改良Rice-Vannucci法［8-9］建立大鼠缺血缺氧性腦病模型。腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（0.1 mL/100 g）進行麻醉后取仰臥位，75%酒精消毒后在頸前部做縱行正中切口，分離左側(cè)頸總動脈，用4-0絲線結(jié)扎，縫合切口后返回鼠籠恢復2 h，再將大鼠放入37℃恒溫缺氧箱中，以1 L/min的速度通入8%的氧氣和92%的氮氣，2.5 h后取出大鼠，繼續(xù)保溫1 h后作神經(jīng)行為學測定，翻身不能、平衡異常和左旋者視為造模成功。對造模過程中未蘇醒或死亡的動物予以剔除。

2.2 實驗分組 將100只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為治療組（n＝30）、對照組（n＝30）、模型組（n＝15）、假手術(shù)組（n＝10）、正常組（n＝15）。治療組、對照組、模型組均按照“2.1”項進行造模；假手術(shù)組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（0.1 mL/100 g）進行麻醉后，切開頸部皮膚，分離左頸總動脈后，即縫合切口；正常組大鼠未予任何手術(shù)處理。造模期間治療組死亡1只、對照組死亡2只、模型組死亡2只，最終治療組29只，對照組28只，模型組13只，假手術(shù)組10只，正常組15只。

2.3 干預方法 各組大鼠均于造模成功后24 h進行干預。對照組大鼠按20 mg/kg予GM1腹腔注射，每日1次。治療組在對照組干預基礎(chǔ)上加用捏脊按摩，大鼠腧穴和經(jīng)絡(luò)定位參考《實驗針灸學》［10］。捏脊按摩操作方法：用雙手的中指、無名指和小指握成半拳狀，食指半屈在下，拇指伸直從上對準食指前半段，然后頂住皮膚，拇食指前移，提拿皮肉，隨捏隨提，雙手交替捻動并向前推進，即自尾根部沿脊柱兩側(cè)肌膚向上至大椎穴止。捏脊一般以脊柱為中心分3條線，即左右膀胱經(jīng)和督脈，先捏左膀胱經(jīng)3次，次捏右膀胱經(jīng)3次，再捏督脈3次，共計9次。為加強手法感應(yīng)，通常每條線采用“捏三提一法”，即先捏脊1遍，從第2遍開始，每捏3次，向上提拿1次。捏脊按摩每次20 min，每日1次。模型組、假手術(shù)組和正常組大鼠均無干預措施，普通飼養(yǎng)。各組分別于治療第7、14、21 d后隨機抽取若干只大鼠進行取材。

2.4 標本的取材及制備

2.4.1 血清標本采集 每組在不同時間點各取3～10只大鼠，3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，打開腹腔進行腹主動脈采血4～5 mL，并收集于標記好的采血管中，室溫下靜置2 h，于2～8℃下以3 124 r/min離心15 min，吸取上清液，-80℃冰箱保存，用于檢測血清TF、TFPI水平。

2.4.2 腦組織標本采集

2.4.2.1 石蠟切片標本制備 每組在不同時間點各取1～2只大鼠，3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉、腹主動脈采血后，打開胸腔，暴露左心室，用裝有0.9%氯化鈉溶液的注射器針頭迅速刺入左心室尖部，而后在右心耳位置剪開一個小口，用0.9%氯化鈉溶液150 mL快速灌流，再用4%多聚甲醛150 mL進行快速灌流，待肝臟逐漸變白、頭部和肢體變硬后斷頭取腦組織。將硬腦膜與腦組織剝離，完整取出腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。經(jīng)視交叉處冠狀面切取標本，厚度約0.5 cm，乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，輪轉(zhuǎn)式切片機制備成5μm厚度切片，溫水中展開，玻璃貼片，做好標記后常溫室內(nèi)保存，用于觀察腦組織神經(jīng)元病理形態(tài)學改變。

2.4.2.2 ELISA檢測標本制備 每組在不同時間點各取2～8只大鼠，3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉、腹主動脈采血后，沿頭顱中線剪開皮膚和顱骨，在冰盤上完整取腦，冰生理鹽水漂洗除去血液，濾紙吸干后，矢狀離斷為左右半球，取左腦置于凍存管中，封蓋，立即置于液氮中快速冷凍，隨后-80℃冰箱保存，用于檢測腦組織TF、TFPI水平。

2.5 觀察指標及檢測方法

2.5.1 HE染色觀察神經(jīng)元病理形態(tài)學改變 每組每個時間點取5張石蠟切片，60℃烤片12 h；二甲苯脫蠟15 min，3次；梯度乙醇脫苯，蒸餾水浸洗5 min；蘇木素染色1 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍；伊紅染0.5 min，蒸餾水沖洗；用梯度乙醇脫水，每級5 min，再用二甲苯充分透明后樹膠封片，在400倍顯微鏡下觀察缺血缺氧側(cè)腦組織神經(jīng)元的形態(tài)學變化，光鏡下神經(jīng)元細胞核呈藍色，細胞漿呈不同程度的紅色。

2.5.2 ELISA檢測血清TF、TFPI水平 每組每個時間點的血清嚴格按照ELISA試劑盒的說明書進行操作，酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值）。

2.5.3 ELISA檢測腦組織TF、TFPI水平 每組每個時間點取凍存腦組織，融化后，準確稱取樣本重量。低溫冷凍破碎，以0.1 mg樣本加1 mL預冷PBS重懸，于2～8℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液，ELISA法檢測腦組織TF、TFPI的含量，所有操作嚴格按照試劑盒的說明書進行。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較若符合正態(tài)分布，采用雙因素方差分析，方差齊，采用LSD進行兩兩比較，方差不齊，則采用Games-Howell；若不符合正態(tài)分布，采用隨機區(qū)組設(shè)計資料秩和檢驗。

3 結(jié)果

3.1 5組大鼠神經(jīng)元病理形態(tài)學變化 正常組和假手術(shù)組神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊緊密，神經(jīng)細胞輪廓清晰，形態(tài)正常，細胞漿豐富呈淡紅色，細胞核居中呈藍色，無神經(jīng)元丟失。模型組干預7 d，神經(jīng)細胞排列不規(guī)整，胞漿淡染，細胞間隙擴大，細胞核固縮、深染；干預14 d，神經(jīng)細胞排列紊亂，常有核固縮、裂解，細胞結(jié)構(gòu)消失，神經(jīng)細胞變性壞死，膠質(zhì)細胞相對增多，伴有炎性細胞浸潤；干預21 d，可見大量神經(jīng)細胞丟失，細胞間隙明顯增大，存在空腔形成或成空隙狀。對照組和治療組各時間點神經(jīng)元病理損傷有所減輕，以治療組改善最為明顯。見圖1。

圖1 5組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元HE染色圖（×400）

3.2 5組大鼠血清TF、TFPI水平的比較 假手術(shù)組各時間點血清TF、TFPI水平均與正常組相當（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組各時間點血清TF水平均明顯升高（P＜0.05），血清TFPI水平于干預7 d明顯升高（P＜0.05），于干預14、21 d明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，治療組和對照組各時間點血清TF水平均下降（P＜0.05），血清TFPI水平均升高（P＜0.05），治療組改善程度優(yōu)于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 5組大鼠不同時間血清TF、TFPI表達水平比較（±s）

表1 5組大鼠不同時間血清TF、TFPI表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2）P＜0.05；與模型組比較，3）P＜0.05；與對照組比較，4）P＜0.05。

組別n7 d TF/（1 p4g d/mL）21 d正常組15218.78±13.85226.92±11.72224.39±8.77假手術(shù)組10216.30±8.93223.37±9.68228.93±3.14模型組13280.32±5.961）2）280.12±3.531）2）256.98±6.901）2）對照組28264.04±9.531）2）3）263.09±6.621）2）3）247.17±8.191）2）3）治療組29254.32±2.971）2）3）4）255.75±5.491）2）3）4）239.06±7.641）2）3）4）組別n 7 d TFPI/（14 n d g/mL）21 d正常組15323.65±4.92329.98±9.49332.59±3.37假手術(shù)組10323.09±9.15331.13±7.70330.66±9.02模型組13343.21±7.981）2）304.96±4.121）2）312.89±3.621）2）對照組28353.14±3.611）2）3）319.98±7.371）2）3）321.12±4.771）2）3）治療組29363.93±6.841）2）3）4）343.89±7.161）2）3）4）353.03±6.211）2）3）4）

3.3 5組大鼠腦組織TF、TFPI水平比較 假手術(shù)組各時間點腦組織TF、TFPI水平均與正常組相當（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組各時間點腦組織TF水平均明顯升高（P＜0.05），腦組織TFPI水平于干預7 d明顯升高（P＜0.05），于干預14、21 d明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，治療組和對照組各時間點腦組織TF水平均下降（P＜0.05）、腦組織TFPI水平均升高（P＜0.05），治療組改善程度優(yōu)于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 5組大鼠不同時間腦組織TF、TFPI表達水平比較（±s）

表2 5組大鼠不同時間腦組織TF、TFPI表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2）P＜0.05；與模型組比較，3）P＜0.05；與對照組比較，4）P＜0.05。

組別n7 d TF/（14 p gd/g）21 d正常組152 199.91±78.562 250.34±80.032 256.51±54.40假手術(shù)組102 178.75±36.732 278.12±70.232 255.09±30.32模型組132 619.42±43.181）2）2 585.54±36.921）2）2 572.49±30.131）2）對照組282 515.56±45.081）2）3）2 496.13±34.001）2）3）2 448.37±53.171）2）3）治療組292 447.70±32.791）2）3）4）2 399.99±37.771）2）3）4）2 344.35±48.161）2）3）4）組別n7 d TFPI 1/（4 n d g/g）21 d正常組155 234.28±64.685 232.13±37.515 258.74±28.46假手術(shù)組105 178.25±52.635 229.11±16.995 265.25±30.55模型組135 356.70±41.771）2）5 070.45±36.851）2）5 095.89±33.271）2）對照組285 445.56±47.591）2）3）5 145.20±42.021）2）3）5 178.66±54.641）2）3）治療組295 504.92±49.071）2）3）4）5 300.76±40.201）2）3）45 386.06±74.881）2）3）4）

4 討論

HIE是新生兒的常見疾病，具有較高的致殘率和致死率［11］。中醫(yī)學認為，HIE歸屬中醫(yī)“胎怯”“五遲”“五軟”“五硬”等范疇，其病位在腦，病機是髓海不充，腦髓失養(yǎng)，或腦脈痹阻，竅閉神匿，以疏通氣血、醒腦益智、升舉陽氣、協(xié)調(diào)百脈為治則［12］。HIE是一個多因素、多機制的級聯(lián)損傷過程，包括能量代謝障礙、細胞內(nèi)鈣離子超載、興奮性氨基酸毒性、炎性反應(yīng)、自由基和再灌注損傷、凋亡相關(guān)信號通路激活等，缺血缺氧在HIE的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，神經(jīng)細胞凋亡或壞死是最終結(jié)果［13］。

本研究選取督脈和足太陽膀胱經(jīng)，“病變在腦，首取督脈”，督脈為陽脈之海，總督諸陽；足太陽膀胱經(jīng)為巨陽之脈，布散陽氣，兩者均入絡(luò)于腦，形成督脈-足太陽-腦三者互相溝通的有機整體［14］，通過按摩督脈和膀胱經(jīng)發(fā)揮振奮陽氣、充養(yǎng)腦神、清竅健腦之功效［15］。劉家瑞等［16］發(fā)現(xiàn)，捏脊按摩可明顯改善嬰兒期腦癱患兒運動發(fā)育遲緩?，F(xiàn)代研究也表明，捏脊按摩對體表的機械性刺激可通過皮膚觸覺感受器傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，興奮迷走神經(jīng)以及內(nèi)臟自主神經(jīng)叢，促進內(nèi)源性神經(jīng)生長因子（NGF）的表達，使受損腦組織神經(jīng)系統(tǒng)突觸重建而發(fā)揮損傷修復作用［17-18］。捏脊按摩還可通過上調(diào)組織中Bcl-2的表達，抑制Cyt-C從線粒體釋放，降低Caspase-3的表達，減少神經(jīng)元凋亡反應(yīng)的發(fā)生，阻止神經(jīng)元壞死，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護作用［19］。本研究HE染色結(jié)果顯示，治療組和對照組各時間點神經(jīng)元病理損傷程度較模型組均有所減輕，以治療組改善最為明顯，表明捏脊按摩聯(lián)合GM1可抑制HIE模型大鼠神經(jīng)細胞損傷和凋亡，優(yōu)于單一使用GM1，與張林峰［19］研究結(jié)果一致。因此，捏脊按摩可減輕HIE對大鼠的神經(jīng)損害作用，改善HIE模型大鼠的神經(jīng)元損傷和形態(tài)學改變。

HIE新生兒腦組織缺血缺氧時體內(nèi)血液重新分布，血管內(nèi)皮細胞受到損傷，TF暴露，內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)被激活，凝血功能亢進，導致血液呈高凝狀態(tài)，增加彌散性血管內(nèi)凝血的可能［3］。TF是外源性凝血途徑的啟動因子，在機體生理性止血及病理性血栓形成過程中起重要作用；TFPI是目前唯一能生理性抑制TF啟動外源性凝血途徑的一種內(nèi)源性抗凝蛋白，可以調(diào)節(jié)TF的活性［5］。本研究結(jié)果顯示，模型組各時間點血清和腦組織TF水平均明顯高于假手術(shù)組和正常組（P＜0.05），血清和腦組織TFPI水平于干預7 d升高，干預14、21 d均低于假手術(shù)組和正常組（P＜0.05），可能的原因是腦組織缺血缺氧引起受損的血管內(nèi)皮細胞、單核細胞大量分泌TF，凝血功能亢進，TFPI與TF結(jié)合形成TFPI-FⅩa-FⅦa-TF四元復合物，被大量消耗所致［20］。與模型組比較，對照組各時間點血清和腦組織TF水平均下降（P＜0.05），TFPI水平均升高（P＜0.05），可能是由于GM1可通過血腦屏障，嵌入細胞膜，維持細胞內(nèi)外離子平衡、防止細胞內(nèi)鈣離子聚集、抑制氧自由基、減少興奮性氨基酸引發(fā)的神經(jīng)毒性，增加受損腦組織血流量［21］。與對照組比較，治療組各時間點血清和腦組織TF水平均明顯降低（P＜0.05），TFPI水平均明顯升高（P＜0.05）。本研究結(jié)果表明，捏脊按摩聯(lián)合GM1可能通過調(diào)節(jié)TF、TFPI表達水平，降低HIE模型大鼠血液高凝狀態(tài)，改善腦組織微循環(huán)，發(fā)揮治療作用，治療效果優(yōu)于單一使用GM1，與呂桂芬［22］等的研究結(jié)果一致。因此，捏脊按摩可促進微血管擴張，改善血液流變學，從而阻斷缺血缺氧引起的惡性循環(huán)。

綜上所述，捏脊按摩聯(lián)合GM1對HIE有良好的治療作用，治療效果優(yōu)于單一使用GM1，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)TF、TFPI的表達，降低HIE模型大鼠血液高凝狀態(tài)，改善腦組織的血液循環(huán)和營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制HIE模型大鼠神經(jīng)細胞凋亡和壞死，促進神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。