競爭法制備喹乙醇快速檢測試紙條及其在鯽魚檢測中應用

林勃勃 韋慶敏 劉 發(fā) 羅志輝,2,3

競爭法制備喹乙醇快速檢測試紙條及其在鯽魚檢測中應用

林勃勃1韋慶敏1劉 發(fā)1羅志輝1,2,3

（1.玉林師范學院，廣西 玉林 537000；2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學與生物技術(shù)重點實驗室，廣西 玉林 537000；3.廣西高校桂東南特色農(nóng)產(chǎn)資源高效利用重點實驗室，廣西 玉林 537000）

目的：在膠體金免疫層析技術(shù)的基礎上采用競爭法制備喹乙醇快速檢測試紙條。方法：采用一鍋法合成顯色用的膠體金，調(diào)控檸檬酸鈉的量，獲得不同最大吸收波長的膠體金。通過對膠體金吸收波長、碳酸鉀添加量等條件的優(yōu)化，獲得膠體金的最大吸收波長為522 nm、碳酸鉀（0.2 mmol/L）添加量為15 μL的最佳條件，在此最優(yōu)條件下制備試紙條，考察試紙條的方法學參數(shù)，并將制備好的試紙條檢測實際樣品。結(jié)果：隨著喹乙醇濃度的減?。?.3×10-1mg/mL，5.3×10-7mg/mL），試紙條的控制線C線一直顯色，而檢測線T線逐漸清晰、顯色，表明試紙條是準確的，檢出限為5.3×10-7mg/mL，所有的檢測在5～8分鐘內(nèi)能完成，并成功用于鯽魚實際樣品的檢測。結(jié)論：該試紙條適用于對肉類中的喹乙醇殘留進行高效靈敏的檢測，有利于保障人們的食品安全。

喹乙醇；膠體金；競爭法；快速檢測；試紙條

引言

喹乙醇是一種化學添加劑，分子量較小，也稱倍育諾、奧喹多司和喹酰胺醇等，因其具有廣譜抗菌性、能使蛋白質(zhì)同化和提高飼料轉(zhuǎn)化率等優(yōu)點而廣泛用于家禽和水產(chǎn)產(chǎn)品飼養(yǎng)中，促進使動物加速生長[1]。但研究發(fā)現(xiàn)長期使用或用量過大，累積在體內(nèi)的喹乙醇會引發(fā)人體各類疾病，甚至有著明顯的致畸形作用或致癌現(xiàn)象，因此，國內(nèi)外對喹乙醇的使用都用明顯的限制[2-6]。2005年，我國明確規(guī)定喹乙醇不能用于家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖當中[7]，然而，近年來，一些不法商家為了追求更大的利益和降低生產(chǎn)成本，不顧國家規(guī)定，濫用喹乙醇，關(guān)于食用含有喹乙醇殘留的水產(chǎn)禽畜而引發(fā)的食品安全問題層出不窮[8]。因此，建立一種快速、便捷、靈敏、準確的喹乙醇檢測現(xiàn)場快檢方法迫在眉睫。

目前對喹乙醇進行檢測的主要方法有：（1）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，曾靜等[9]采用此方法檢測水產(chǎn)品中喹乙醇殘留量得出檢出限為10 μg/kg，此方法的檢出限低且回收率高，濃度在0.5 μg/L～500.0 μg/L時線性關(guān)系良好，適用于檢測水產(chǎn)品中的喹乙醇殘留；（2）超高壓色譜-質(zhì)譜法[10,11]，師真等[12]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定羅非魚中喹乙醇，測得檢測限為0.005 mg/kg；（3）免疫法，免疫法包括了膠體金免疫層析法[13,14]、酶聯(lián)免疫分析法[15]、熒光微球免疫層析[16,17]；（4）電化學分析法[18]，電化學分析法中能較好地對喹乙醇分析和測定的方法是溶出伏安法，有研究表明[19]，使用溶出伏安法檢測喹乙醇殘留的檢出限為7×10-1mol/L。（5）高效液相色譜法，謝小華等[20]采用ODS柱分離喹乙醇，并將此方法用于檢測草魚、鯽魚等水產(chǎn)品的喹乙醇。這些方法大多具有靈敏度高、重復性好等特點，在食品、水產(chǎn)品安全檢測中起到重要的作用。但這些方法大多數(shù)需要專業(yè)人員操作大型精密儀器進行檢測，步驟較為繁瑣，不適合現(xiàn)場大批量檢測，而免疫層析法具有操作方便、檢測時間短、設備便攜等特點，可廣泛適用于現(xiàn)場檢測，進行大面積推廣。

膠體金免疫層析試紙法是實現(xiàn)快速、便捷、靈敏、準確檢測的方法之一[21,22]，廣泛用于生化[23,24]、環(huán)境[25]、食品[26,27]等方面的檢測。然而，由于喹乙醇分子量較小，采用傳統(tǒng)的雙抗免疫夾心法來構(gòu)建膠體金快速檢測試紙條，結(jié)合位點較少，比較容易出現(xiàn)假陽性。因此，本研究提出采用競爭法制備喹乙醇的快速檢測試紙條，以膠體金為顯色劑，與喹乙醇抗體構(gòu)建具有靶向性的捕獲探針，采用喹乙醇-BSA作為檢測線的捕獲劑，通過待測樣品中是否有喹乙醇與金標抗體共同競爭結(jié)合，在檢測線上是否會顯色來判斷陽性或者陰性。如果檢測線和質(zhì)控線都顯色，結(jié)果判斷為陰性；如果檢測線不顯色，質(zhì)控線顯色則檢測結(jié)果為陽性。檢測線的顯色逐漸增強說明喹乙醇濃度越小，實現(xiàn)對喹乙醇實際樣品定性和半定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸（分析純，天津市光復精細化工研究所）；檸檬酸三鈉、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、甲醇、碳酸鉀和牛血清白蛋白（BSA）（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；喹乙醇（分析純）、喹乙醇抗體和喹乙醇-BSA（生化試劑，試上海羽朵生物科技有限公司）；羊抗鼠二抗（IgG）（生化試劑，寧波高新區(qū)海辰生物科技有限公司）；樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水濾紙（上海金標生物科技有限公司）；鯽魚購自玉林名山農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設備

Cary 5000紫外可見分光光譜儀（美國安捷倫公司）；TecnaiG20透射電子顯微鏡（美國FEI公司）；H1850R臺式低速自動平衡離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）； HM3035三維劃膜噴金儀、CTS300數(shù)控裁條機、YK725壓殼機（上海金標生物科技有限公司）；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏儀器設備有限公司）。

1.3 膠體金的合成

本研究按照經(jīng)典的檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[28]，做適當修改。在實驗前先將所有要用到的玻璃儀器放在王水浸泡25 min，再取出分別用蒸餾水、超純水各洗3次，最后置于烘箱，烘干保存。拿出以上烘干儀器，用分析天平稱量0.0326 g的檸檬酸三鈉，用量筒量取100 mL超純水加入到250 mL三頸燒瓶中，然后在100 ℃的水浴條件下加熱回流，并不斷攪拌15 min，加入925 μL的48 mmol/L mM的氯金酸，溶液首先出現(xiàn)灰藍色，其次到藍色、黑藍色、紫紅色，最終變?yōu)榫萍t色，變?yōu)榫萍t色后再持續(xù)加熱攪拌15 min，即可得膠體金溶液，取下自然冷卻、裝瓶，于冰箱中2℃～8℃保存。

1.4 碳酸鉀的用量

取5支離心管，分別往里加入1 mL膠體金，分別加入0 μL、15 μL、25 μL、35 μL、45 μL的0.2 mol/L 碳酸鉀溶液，兩個小時后，觀察離心管中膠體金溶液的顏色，若仍保持為酒紅色，則為最佳的用量以穩(wěn)定溶液的弱堿性和離子強度。

1.5 金標探針制備與純化

取1 mL的膠體金，加入10 μL的1 mg/mL喹乙醇抗體，充分震蕩搖勻8 min，靜止2 h，加入50 μL 10% BSA封閉，放置于冰箱內(nèi)2℃～8℃保存過夜，所標記的探針以5 083 g進行離心10 min，用移液槍吸走上清液，棄去，留下的沉淀用pH為8的 Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS）復溶，置于冰箱中2℃～8℃保存，待用。

1.6 試紙條的制備

試紙條組裝按照經(jīng)典的四步法進行[29,30]。首先，取出聚氯乙烯底板，測量底板每一部分的長度和寬度，進行每一部分原材料適宜寬度和長度的剪裁。接著，將喹乙醇-BSA和羊抗鼠二抗用XYZ三維劃線膜噴金儀劃線到NC膜上，同時將金探針噴于結(jié)合墊上。然后將樣品墊、金標結(jié)合墊、NC膜和吸水墊依次組裝在底板上，為了保證試紙條的流動性良好，在組裝時各部分要有一定的重疊，重疊1 mm左右即可。最后，為保證試紙條的使用壽命，將制作好的試紙條用壓殼機裝殼，與干燥劑一同放入鋁箔袋中封口保存。如圖1所示。

圖1 喹乙醇試紙條組裝示意圖和實物圖

1.7 試紙條的檢測原理與結(jié)果判定

喹乙醇是小分子物質(zhì)，無法使用傳統(tǒng)直接法或間接法檢測，因此，采用競爭法來制備喹乙醇試紙條，如圖1中A線為檢測線（T線），包被喹乙醇-BSA；B線為質(zhì)控線（C線），包被羊抗鼠二抗（IgG）。將待測樣液滴到樣品墊，與金標探針反應，如果樣品中含有喹乙醇，將與金標探針結(jié)合，檢測線上的喹乙醇-BSA則無法捕獲金標探針（被抑制），檢測線不顯色或顯色弱，金標探針繼續(xù)往前走，與質(zhì)控線的二抗結(jié)合，顯色，判定檢測結(jié)果為陽性；反之，若是待測樣液中不含喹乙醇，金標探針則會與喹乙醇-BSA完全抗原結(jié)合，檢測線強顯色，多余的金標則探針繼續(xù)往前與羊抗鼠二抗結(jié)合，質(zhì)控線顯色。需要特別注意的是，若是檢測線與質(zhì)控線都不顯色，則判檢測結(jié)果為無效。

1.8 待測樣品前處理

取市場隨機購買的鯽魚，去皮，取肉，將其放入料理破壁機中攪碎，取5 g已攪碎均勻的鯽魚肉樣品，加入2.5 mL配制好的75%的甲醇水溶液進行充分的震蕩，使其混合均勻，再放入離心機內(nèi)，以2 836 r/min的轉(zhuǎn)速離心8 min，取其上清液，底部殘渣再加入50%的甲醇水溶液2.5 mL，重復步驟，將兩次離心所得到的上清液進行合并，置于離心管中待用。

1.9 數(shù)據(jù)處理

紫外-可見光譜圖在origin7.0完成，其他圖是在photoshop CS3和PPT下處理完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金納米粒子表征

為了提高試紙的顯色度，研究需要粒徑均一的膠體金納米粒子，所合成的膠體金溶液在522 nm處有單一的最大吸收峰，峰形對稱，如圖2A所示。采用電子顯微鏡對其進行表征，如圖2B所示，所合成出納米粒子的粒徑大概在13 nm～15 nm，粒徑均勻，顏色鮮艷適宜用作制備金標探針，可初步達到預期效果。

圖2 膠體金溶液紫外-可見光吸收光譜和透射電子顯微鏡圖

2.2 金標探針最佳碳酸鉀含量的確定

為了保證膠體金的穩(wěn)定性和弱堿性，優(yōu)化了碳酸鉀的不同量，金標探針在過夜之后通過目測可以觀察到出現(xiàn)了較明顯的顏色變化，如圖3所示。在保持其他條件不變的情況下，往1-5號離心管中添加5 μL、15 μL、25 μL、35 μL、45 μL的0.2 mol/L 碳酸鉀溶液，隨著碳酸鉀的加入越多，溶液的顏色逐漸變深。當所加入的體積為15 μL時，2號離心管的金標顏色仍然保持為酒紅色，所測得pH為8，由此確定制備金標探針最適宜添加的碳酸鉀的量為15 μL。

圖3 不同量碳酸鉀的金標探針圖

2.3 不同最大吸收波長的膠體金對金標探針顯色的影響

金標探針的質(zhì)量對試紙條的檢測結(jié)果至關(guān)重要，在金標探針制備完成時，好的金標探針為酒紅色，噴到結(jié)合墊上烘干之后仍然為酒紅色（圖4A），完成試紙條組裝，用樣液進行檢測時，隨著樣液的流動和探針的結(jié)合，在顯色呈現(xiàn)出來的顏色為酒紅色，且不滯留于NC膜上，檢測結(jié)果顯色良好；若是顆粒較大的膠體金（最大吸收波長為530 nm）制作探針，在噴到結(jié)合墊烘干后為暗紫色（圖4B），用樣液進行試紙條檢測時，金標流動性差，滯留在NC膜上，檢測結(jié)果顯色較差，甚至不顯色。因此，為了提高檢測靈敏度，在本研究中選用了最大吸收波長為522 nm的膠體金制作探針。

圖4 不同最大吸收波長的膠體金（A為最大吸收峰為522 nm，B為最大吸收峰為530 nm）制備的探針顯色對比圖

2.4 所制備試紙條的檢出限

配制系列喹乙醇標準溶液：5.3×101 mg/mL、5.3 mg/mL、5.3×10-1mg/mL、5.3×10-2mg/mL、5.3×10-3mg/mL、5.3×10-4mg/mL、5.3×10-5mg/mL、5.3×10-6mg/mL、5.3×10-7mg/mL，5.3×10-8mg/mL，依次分別取50 μL的標準溶液滴到制備好的試紙條進行檢測，隨著試紙的吸水性，溶液往另一邊滲透，3 min后，在顯色區(qū)有明顯的紅色條痕。結(jié)果如圖5所示，隨著濃度的的減?。?.3×101mg/mL～5.3×10-7mg/mL），控制線C線一直顯色，檢測線T線逐漸清晰、顯色，這說明完全抗原與其特異性抗體已經(jīng)結(jié)合成功，所檢測結(jié)果為陽性，而到5.3×10-8mg/mL時T線和C線都顯色，結(jié)果為陰性，實現(xiàn)了對溶液中喹乙醇的定性檢測，同時也顯示了本實驗所制備的試紙條檢出限為5.3×10-7mg/mL，整個檢測過程在5～8分鐘內(nèi)完成。

2.5 測定水產(chǎn)品中的喹乙醇

在本研究中，以市場中的鯽魚為檢測對象，檢驗所制備的試紙條的實用性。買回來的鯽魚按照“1.8”項的方法處理，獲得待測液。同時，取五份待測液，分別加入不同濃度喹乙醇（0、5.0×10-6mg/mL、1.5×10-7mg/mL、5.0×10-7mg/mL、7.5×10-7mg/mL），按照本研究的方法進行檢測，結(jié)果如圖6所示，1號樣品和5號樣品的試紙條T和C線都出現(xiàn)兩條紅杠，說明檢測結(jié)果是陰性。而2號、3號和4號樣品試紙條都只有C線出現(xiàn)紅杠，T線沒有出現(xiàn)紅杠，說明檢測結(jié)果為陽性，加標樣的實驗結(jié)果與理論相符，說明所制備的喹乙醇試紙條具有較好的實用性和可靠性，可廣泛應用于家禽和水產(chǎn)品中喹乙醇的測定。

圖6 鯽魚肉樣品中喹乙醇的檢測

3 結(jié)論

本研究采用競爭法制備了喹乙醇快速檢測試紙條。采用吸收波長為522 nm的膠體金作為顯色劑，偶聯(lián)喹乙醇抗體，構(gòu)建喹乙醇的金標探針，考察探針的穩(wěn)定性和檢測限等條件，在最優(yōu)條件下制備試紙條，獲得所制備試紙條的檢出限為5.3×10-7mg/mL，并在5～8分鐘內(nèi)完成對鯽魚肉的檢測，結(jié)果表明所制備試紙條具有較好的靈敏度和實用性，可廣泛應用于家禽和水產(chǎn)品中喹乙醇的測定。

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Preparation of Rapid Detection Strip of Olaquindox for Competitive Method and Its Application in the Detection of Crucian Carp

Objective: On the basis of colloidal gold immunochromatography technology, competitive method was used to prepare rapid test strips for olaquindox. Methods: The colloidal gold for color development was synthesized by one pot method, and the amount of sodium citrate was adjusted to obtain colloidal gold with different maximum absorption wavelengths. By optimizing the absorption wavelength of colloidal gold and the addition amount of potassium carbonate, the maximum absorption wavelength of colloidal gold was 522 nm and the addition amount of potassium carbonate (0.2 mmol/L) was 15 μL, prepare the test strip under this optimal condition, investigate the methodological parameters of the test strip, and test the actual sample with the prepared test strip. Results: With the decrease of olaquindox concentration (5.3×10-1mg/mL, 5.3×10-7mg/mL), the control line C of the test strip showed color all the time, while the detection line T was gradually clear and colored, indicating that the test strip was accurate, and the detection limit was 5.3×10-7mg/mL, all tests could be completed within 5 to 8 minutes, and successfully used for the detection of actual samples of crucian carp. Conclusion: The test strip is suitable for the highly efficient and sensitive detection of olaquindox residues in meat, which is conducive to ensuring the safety and health of human food.

olaquindox; colloidal gold; competitive method; rapid detection; test strip

O657; S91

A

1008-1151(2022)12-0034-05

2022-09-29

國家自然科學基金（22064018）；廣西自然科學基金（2019JJA120031、2019GXNSFAA245026）；玉林市科技攻關(guān)項目（201934012）；學校高層次人才科研啟動項目（G2020ZK04、G2021ZK15）；廣西教育廳人才項目（2018-18）；大學生創(chuàng)新項目（201910606143）。

林勃勃（1998－），女，玉林師范學院學生，從事食品快速方法研究。

羅志輝，男，玉林師范學院教授，從事納米材料的制備及其分析應用、食品安全檢測研究。