LncRNA GAS5靶向miR-103減輕3T3L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的作用機(jī)制

敖文，徐在革，白楊，劉惠雙

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人口老齡化加劇，2型糖尿病的患病率呈迅速升高趨勢(shì)，已成為繼腫瘤、心血管疾病之后的第3大死亡誘因［1］。2型糖尿病發(fā)病機(jī)制主要為胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島素分泌不足，其中IR貫穿疾病整個(gè)階段［2-3］?？刂坪透纳艻R是預(yù)防和治療糖尿病的根本。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）可以通過(guò)多條途徑靶向調(diào)控胰島素相關(guān)基因表達(dá)，從而影響IR的形成以及胰島素的合成、分泌，這為治療糖尿病提供了新思路［4］。生長(zhǎng)抑制特異因子5（growth arrestspecific 5，GAS5）在2型糖尿病患者血清中呈低表達(dá)，GAS5可結(jié)合胰島素受體啟動(dòng)子，其缺失可抑制葡萄糖攝取和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［5］。微小RNA（microRNA，miRNA）亦參與IR過(guò)程，miR-103作為2型糖尿病的潛在標(biāo)志物，對(duì)預(yù)測(cè)2型糖尿病預(yù)后具有較高的價(jià)值［6］。另有研究發(fā)現(xiàn)，GAS5與miR-103之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)［7］。GAS5是否通過(guò)miR-103在IR中發(fā)揮作用尚不明確。本研究通過(guò)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α誘導(dǎo)3T3L1脂肪細(xì)胞建立IR模型，探究GAS5對(duì)IR的影響，并初步探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 3T3L1小鼠前脂肪細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù)（編號(hào)：KCB 92010YJ）。胰島素、地塞米松、異丁基甲基黃嘌呤（IBMX）、TNF-α（美國(guó)sigma公司）；pEGFP-C1-GAS5、引物均由上海生工生物有限公司合成；Lipofectamine?3000、mimic NC、miR-103 mimic由廣州銳博生物有限公司合成；Krebs-Ringer緩沖液（北京Solarbio公司）；一抗胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）、p-IRS-1、過(guò)氧化物酶體增殖物激 活 受 體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter protein 4，GLUT4）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、p-AKT、βactin，羊抗兔二抗，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（英國(guó)abcam公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）儀（美國(guó)ABI公司，型號(hào)：QuantStudio 3）；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（上海Tanon公司，型號(hào)：4100）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立 3T3L1小鼠前脂肪細(xì)胞在10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代，待細(xì)胞密度達(dá)70%，參考文獻(xiàn)［8］添加含10 mg/L胰島素、1μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化48 h，含10 mg/L胰島素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)4 d，油紅O染色鑒定細(xì)胞分化情況。添加10 ng/L TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)24 h，建立3T3L1脂肪細(xì)胞IR模型。

1.2.2 細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、空載體組、GAS5過(guò)表達(dá)組、GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組、GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組。對(duì)照組為3T3L1脂肪細(xì)胞，其余各組細(xì)胞為IR模型細(xì)胞，空載體組、GAS5過(guò)表達(dá)組、GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組、GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組參考Lipofectamine?3000說(shuō)明書分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C1空載體、pEGFP-C1-GAS5、pEGFP-C1-GAS5+mimic NC、pEGFP-C1-GAS5+miR-103 mimic，轉(zhuǎn)染6 h。

1.2.3 qPCR檢測(cè)細(xì)胞中GAS5、miR-103mRNA水平 收集轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)后的各組細(xì)胞，每組各收集3孔，每孔1 mL，每孔各加1 mL Trizol試劑，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，cDNA合成試劑盒合成cDNA，qPCR檢測(cè)細(xì)胞中GAS5、miR-103mRNA水 平。GAS5引 物：上 游5′-AAGCCATTGGCACACAG?GCATTAG-3′，下游5′-AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA-3′；β-actin引物：上游5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3′，下游5′-AAGGAAGGCTGGAACAGTGC-3′；miR-103引物：上游5′-AGCAGCATTGTACAGGGCTATGAA-3′，下 游5′-TG?GTGTCGTGGAGTCG-3′；U6引物：上游5′-CGCTTCGGCAG?CAGCACATATAC-3′，下游5′-AATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。反應(yīng)體系（20μL）：1μL cDNA（200μg/L）、10μL 2×SYBR qPCR Mix、上游引物/下游引物（均為10μmol/L）0.5 μL/0.5μL，8μL ddH2O；反應(yīng)條件：94℃60 s；95℃30 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算GAS5、miR-103mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 液體閃爍法檢測(cè)葡萄糖攝取能力 實(shí)驗(yàn)前1 d各組置于24孔板中，均用含0.2%胎牛血清白蛋白的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜，用含0.2%胎牛血清白蛋白的Krebs-Ringer緩沖液作用2 h，每孔添加50μL含有1.85×105Bq（約5μCi）2-脫氧3［H］葡萄糖的2-脫氧葡萄糖混合液孵育5 min，磷酸鹽緩沖液清洗，干燥后室溫添加500μL Triton X-100裂解細(xì)胞30 min，取400μL裂解液于液閃計(jì)數(shù)器下檢測(cè)葡萄糖攝取量。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平 磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，添加蛋白裂解酶冰上裂解細(xì)胞10 min，收集至1.5 mL的EP管中，4℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液至新的EP管中即為總蛋白。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣20μg，聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白、NC轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉NC膜2 h，對(duì)應(yīng)一抗IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT（稀釋比例均為1∶300）、β-actin（1∶500），4℃孵育過(guò)夜；加入羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，顯色液避光顯色，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 雙熒光素酶鑒定miR-103與GAS5的靶向位點(diǎn) 生物信息學(xué)在線網(wǎng)站Targetscan（http://www.targetscan.org/）預(yù)測(cè)miR-103與GAS5存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)；將miR-103與GAS5結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)的序列克隆重組至pGL3-basic熒光素酶報(bào)告載體上構(gòu)建GAS5野生型（GAS5 WT）及突變型（GAS5 MUT）熒光素酶報(bào)告載體，分別與miR-103 mimic或mimic NC共轉(zhuǎn)染至3T3L1脂肪細(xì)胞中，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶相對(duì)活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prim 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3T3L1脂肪細(xì)胞分化情況 誘導(dǎo)前，脂肪細(xì)胞呈梭形，與成纖維細(xì)胞形態(tài)類似，突觸伸展于細(xì)胞間隙形成網(wǎng)狀，細(xì)胞質(zhì)中未見紅色脂滴；誘導(dǎo)后，脂肪細(xì)胞呈圓形、胞體變大，胞漿豐富，含有大量脂滴，油紅染色明顯，呈“指環(huán)樣”結(jié)構(gòu)，模型構(gòu)建成功，見圖1。

Fig.1 The establishment of 3T3L1 adipocyte models(Oil red O staining,×400)圖1 3T3L1脂肪細(xì)胞模型制作（油紅O染色，×400）

2.2 各組GAS 5、miR-103mRNA水平比較 與對(duì)照組比較，其他各組細(xì)胞中GAS 5mRNA水平降低，模型組、空載體組、GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組細(xì)胞中miR-103mRNA水平升高（P＜0.05）；與模型組、空載體組比較，GAS5過(guò)表達(dá)組、GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組細(xì)胞中GAS5mRNA水平升高，而miR-103mRNA水平降低（P＜0.05）；與GAS5過(guò)表達(dá)組、GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組比較，GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組細(xì)胞中GAS5mRNA水平降低，miR-103mRNA水平升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of GAS5,miR-103 mRNA levels and glucose uptake capacity between 6 groups of cells表1 6組細(xì)胞中GAS5、miR-103 mRNA水平和葡萄糖攝取能力比較 （n=6，±s）

Tab.1 Comparison of GAS5,miR-103 mRNA levels and glucose uptake capacity between 6 groups of cells表1 6組細(xì)胞中GAS5、miR-103 mRNA水平和葡萄糖攝取能力比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01，a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，c與空載體組比較，d與GAS5過(guò)表達(dá)組比較，e與GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組比較，P＜0.05；模型組、空載體組均不與GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組比較，未標(biāo)注。

組別對(duì)照組模型組空載體組GAS5過(guò)表達(dá)組GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組F GAS5 mRNA 1.01±0.09 0.36±0.05a 0.35±0.06a 0.87±0.08abc 0.86±0.07abc miR-103 mRNA 0.99±0.08 3.47±0.32a 3.44±0.34a 1.39±0.15bc 1.40±0.15bc葡萄糖攝?。╟pm）1 356.39±146.48 675.43±73.91a 684.79±76.36a 1 241.88±147.69bc 1 237.75±134.82bc 0.47±0.05ade 2.67±0.25ade 867.49±92.36ade 110.194＊＊132.922＊＊41.075＊＊

2.3 各組葡萄糖攝取能力比較 與對(duì)照組比較，模型組、空載體組、GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組細(xì)胞葡萄糖攝取能力降低（P＜0.05）；與模型組、空載體組比較，GAS5過(guò)表達(dá)組、GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組細(xì)胞葡萄糖攝取能力提高（P＜0.05）；與GAS5過(guò)表達(dá)組、GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組比較，GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組細(xì)胞葡萄糖攝取能力降低（P＜0.05），見表1。

2.4 各組IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組、空載體組、GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組細(xì)胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平降低，GAS5過(guò)表達(dá)組、GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組細(xì)胞中PPARγ、GLUT4蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組、空載體組比較，GAS5過(guò)表達(dá)組、GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組細(xì)胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平升高（P＜0.05）；與GAS5過(guò)表達(dá)組、GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組比較，GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組細(xì)胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平降低（P＜0.05）。見圖2、表2。

Fig.2 Protein levels of IRS-1,p-IRS-1,PPARγ,GLUT4,AKT,and p-AKT in 6 groups of cells圖2 各組細(xì)胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平

2.5 miR-103與GAS5的靶向位點(diǎn)驗(yàn)證 生物信息學(xué)分析miR-103與GAS5存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。mimic NC+GAS5 WT組、miR-103 mimic+GAS5 WT、mimic NC+GAS5 MUT、miR-103 mimic+GAS5 MUT的熒光素酶相對(duì)活性分別為1.01±0.12、0.48±0.06、0.99±0.08、0.98±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=43.419，P＜0.05），其中與mimic NC+GAS5 WT比較，miR-103 mimic+GAS5 WT熒光素酶相對(duì)活性下降（P＜0.05）；mimic NC+GAS5 MUT與miR-103 mimic+GAS5 MUT熒光素酶相對(duì)活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

Fig.3 Targeting sites of miR-103 and GAS5圖3 miR-103與GAS5的靶向位點(diǎn)

3 討論

目前，臨床主要通過(guò)胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物改善IR，促進(jìn)前脂肪向脂肪轉(zhuǎn)化、增加細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸的含量和細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的積聚，從而降低血漿游離脂肪酸水平，增加組織對(duì)胰島素的敏感性［9-10］；但會(huì)增加患者饑餓感，促進(jìn)患者飲食，導(dǎo)致體質(zhì)量和體脂比例增加，造成肥胖［11］。因此，尋找能調(diào)控IR的基因，避免藥物影響，對(duì)IR相關(guān)疾病治療可能更有意義。本研究結(jié)果顯示，制備IR模型后，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中GAS5mRNA水平降低、miR-103mRNA水平升高，表明IR模型中GAS5、miR-103基因表達(dá)水平發(fā)生改變，提示在IR中基因表達(dá)水平變化可能影響疾病，改變基因表達(dá)水平可能作為新的治療方法。

LncRNA已成為生物學(xué)研究熱點(diǎn)之一，其參與IR發(fā)生、發(fā)展，成為代謝疾病發(fā)展過(guò)程中肝臟IR的精確指標(biāo)，可用于IR相關(guān)疾病的早期診斷和治療［12］。過(guò)表達(dá)H19可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A1，促進(jìn)脂肪酸氧化，進(jìn)而減少骨骼肌中異位脂質(zhì)積累，改善IR［13］。GAS5位于1q25.1染色體上，在生長(zhǎng)停滯成纖維細(xì)胞內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)，靶向提高GAS5水平，可增加脂肪細(xì)胞中胰島素受體的表達(dá)［14］。GAS5作為糖皮質(zhì)激素受體擬似物，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合糖皮質(zhì)激素，達(dá)到抑制糖皮質(zhì)激素的生物學(xué)效應(yīng)目的，而糖皮質(zhì)激素對(duì)IR具有促進(jìn)作用［15］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，GAS5過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中GAS5mRNA表達(dá)水平、葡萄糖攝取能力、細(xì)胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白水平升高，表明GAS5過(guò)表達(dá)可提高細(xì)胞的葡萄糖攝取能力，提示該作用可能與IRS-1相關(guān)蛋白表達(dá)水平有關(guān)。IRS-1作為胰島素信號(hào)通路連接細(xì)胞外蛋白，其活化水平影響胰島素的生理效應(yīng)，IR發(fā)生時(shí)，受炎癥、高胰島素血癥影響，IRS-1磷酸化減弱，胰島素信號(hào)通路被抑制，進(jìn)一步加重IR［16］。PPARγ是活化配體的核受體超家族的一個(gè)成員，在IR時(shí)水平降低，具有胰島素增敏功能；PPARγ直接調(diào)控的下游靶蛋白GLUT4在IR時(shí)下調(diào)，可減少細(xì)胞對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)攝取，引發(fā)脂肪IR［17］。Feng等［18］研究顯示，IRS-1/PI3K/AKT信號(hào)通路在糖原合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用，上調(diào)IRS-1、AKT的磷酸化水平，可促進(jìn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕IR引起的肝損傷。本研究亦顯示，GAS5能夠促進(jìn)p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)，恢復(fù)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕IR。

Tab.2 Comparison of protein levels of IRS-1,p-IRS-1,PPARγ,GLUT4,AKT and p-AKT between 6 groups of cells表2 6組細(xì)胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白水平比較 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of protein levels of IRS-1,p-IRS-1,PPARγ,GLUT4,AKT and p-AKT between 6 groups of cells表2 6組細(xì)胞中IRS-1、p-IRS-1、PPARγ、GLUT4、AKT、p-AKT蛋白水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，c與空載體組比較，d與GAS5過(guò)表達(dá)組比較，e與GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組比較，P＜0.05；模型組、空載體組均不與GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組比較，未標(biāo)注。

組別對(duì)照組模型組空載體組GAS5過(guò)表達(dá)組GAS5過(guò)表達(dá)+mimic NC組GAS5過(guò)表達(dá)+miR-103 mimic組F IRS-1 1.19±0.12 1.21±0.11 1.16±0.15 1.20±0.13 1.22±0.14 1.19±0.13 0.151 p-IRS-1/IRS-1 0.88±0.09 0.57±0.06a 0.59±0.05a 0.79±0.08bc 0.80±0.08bc 0.66±0.07ade 18.000＊＊PPARγ 1.43±0.15 0.86±0.09a 0.88±0.07a 1.21±0.13abc 1.20±0.13abc 0.97±0.09ade 23.580＊＊GLUT4 1.36±0.15 0.48±0.05a 0.49±0.06a 0.87±0.08abc 0.84±0.09abc 0.59±0.07ade 83.683＊＊AKT 0.88±0.09 0.89±0.10 0.86±0.11 0.84±0.09 0.90±0.09 0.91±0.07 0.477 p-AKT/AKT 0.68±0.07 0.45±0.06a 0.46±0.07a 0.62±0.07bc 0.63±0.06bc 0.51±0.04ade 14.548＊＊

miRNA在IR中發(fā)揮重要作用，miR-103為GAS5靶位點(diǎn)之一，可影響IR，并通過(guò)抑制PI3K/AKT通路的激活，引起多囊卵巢綜合征、肥胖、胰島素抵抗、雄激素過(guò)多、不孕等［19］。miR-103在抑郁癥合并IR中與IR指數(shù)、抑郁嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且為IR指數(shù)的影響因素［20］。在本研究中，雙熒光酶靶向關(guān)系結(jié)果證實(shí)，miR-103是GAS5的靶位點(diǎn)，升高GAS5的表達(dá)能夠降低miR-103的表達(dá)，在升高GAS5的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)miR-103能夠降低葡萄糖攝取，降低細(xì)胞中p-IRS-1/IRS-1、PPARγ、GLUT4、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平，且miR-103在IR時(shí)高表達(dá)；miR-103能夠逆轉(zhuǎn)GAS5功能，提示在脂肪細(xì)胞IR中GAS5低表達(dá)，升高GAS5的表達(dá)能夠靶向抑制miR-103的表達(dá)，從而緩解脂肪細(xì)胞IR。

綜上所述，升高GAS5的表達(dá)能夠抑制脂肪細(xì)胞IR，可能與靶向抑制miR-103有關(guān)，但miR-103的下游靶基因較多，其具體靶向蛋白尚需進(jìn)一步研究。