西部煤礦區(qū)深色有隔內(nèi)生真菌修復(fù)機(jī)理與生態(tài)應(yīng)用模式

畢銀麗，彭蘇萍，王淑惠

(1.西安科技大學(xué) 西部礦山生態(tài)環(huán)境修復(fù)研究院 陜西 西安 710054；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京) 煤炭資源與安全開采國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100083)

西部煤礦區(qū)是我國(guó)礦產(chǎn)資源開發(fā)的主產(chǎn)區(qū)。該區(qū)域?qū)俑珊蛋敫珊禋夂?，年降雨量少，蒸發(fā)量大，土壤貧瘠，生物種群?jiǎn)我?。煤炭開采是導(dǎo)致礦區(qū)土地退化的直接驅(qū)動(dòng)力，不同煤炭開采工藝對(duì)生態(tài)環(huán)境的損傷特征存在差異，如井工開采致使礦區(qū)采煤沉陷地頻發(fā)，沉陷裂縫發(fā)育損傷植物根系，降低土壤肥力，植被成活率降低，礦區(qū)生態(tài)環(huán)境更加脆弱，生態(tài)修復(fù)難度增加；露天開采剝離表土，土層搬運(yùn)堆放致使排土場(chǎng)土壤無(wú)結(jié)構(gòu)性，土壤養(yǎng)分低，擾動(dòng)土壤生物種群銳減，生態(tài)重構(gòu)效果差。為了解決西部礦區(qū)土壤生產(chǎn)力的恢復(fù)和生態(tài)群落重建問題，采用物理、化學(xué)和生物修復(fù)技術(shù)均可為礦區(qū)土地復(fù)墾提供有力的支持和保障，生物修復(fù)技術(shù)更具高效與可持續(xù)性。以微生物作為提升土壤功能的重要手段，可從根本上系統(tǒng)修復(fù)礦區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能，挖掘和激發(fā)土壤潛在肥力，對(duì)加快土壤改良、植被重建，促進(jìn)礦區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展具有重要作用。

目前微生物復(fù)墾技術(shù)在煤礦區(qū)生態(tài)修復(fù)中的作用與應(yīng)用受到越來(lái)越多專家學(xué)者關(guān)注，其中應(yīng)用最多的微生物是叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF)，該菌已在西部煤礦區(qū)取得了良好生態(tài)修復(fù)效應(yīng)，技術(shù)應(yīng)用趨于成熟。隨著西部煤礦區(qū)微生物生態(tài)修復(fù)規(guī)模化應(yīng)用，對(duì)菌劑的需求量更大。AMF無(wú)法純培養(yǎng)，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，對(duì)宿主植物有一定選擇性，施用范圍受植物種類一定限制。礦區(qū)生態(tài)修復(fù)對(duì)菌劑普適性與快速培養(yǎng)的需求使研究者開始關(guān)注另外一種微生物，深色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophytes，DSE)。由于DSE具有廣泛的宿主適應(yīng)性，作為土壤微生物的重要組成部分，其發(fā)揮的生態(tài)學(xué)功能也引起了學(xué)者們廣泛興趣。

DSE泛指一類定殖于宿主植物根表皮、皮層，甚至維管束組織細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙，形成深色有隔菌絲和微菌核特征結(jié)構(gòu)的內(nèi)生真菌。研究表明，DSE具有與AMF相似的生態(tài)學(xué)功能，能促進(jìn)宿主生長(zhǎng)，提高宿主抗逆性。DSE可以純培養(yǎng)，菌劑可以規(guī)?；a(chǎn)，可為煤礦區(qū)大面積退化土地的修復(fù)快速提供充足微生物菌劑來(lái)源。西部煤礦區(qū)擾動(dòng)土壤養(yǎng)分貧瘠，逆境脅迫(如高溫、干旱、鹽堿化、重金屬污染、酷寒等)致使生態(tài)種群?jiǎn)我?，生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性差，是西部礦區(qū)土地復(fù)墾與生態(tài)修復(fù)的主要障礙因子。利用DSE在土壤和植物根系中的生態(tài)位優(yōu)勢(shì)，探究其在西部礦區(qū)生態(tài)修復(fù)的應(yīng)用潛力。筆者主要從DSE的生態(tài)功能和礦區(qū)生態(tài)修復(fù)機(jī)理方面進(jìn)行梳理，探索DSE菌劑在西部礦區(qū)生態(tài)修復(fù)的應(yīng)用模式，為礦區(qū)生態(tài)修復(fù)提供新的技術(shù)和應(yīng)用方向。

1 DSE生態(tài)特征

植物根際中存在大量DSE，DSE在空間和宿主植物中均未表現(xiàn)出特異性。有文獻(xiàn)表明在我國(guó)西部陜西、內(nèi)蒙古、新疆和寧夏煤礦區(qū)植物根際均發(fā)現(xiàn)有DSE定殖，闡明DSE生態(tài)特征可為其修復(fù)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1.1 DSE分類特征

在顯微鏡下觀察植物根內(nèi)DSE的形態(tài)學(xué)特征，深色有隔菌絲和微菌核是DSE的主要特征結(jié)構(gòu)(圖1)。單個(gè)菌絲沿根的主軸生長(zhǎng)，可以在皮層細(xì)胞之間生長(zhǎng)，也可以在表皮細(xì)胞之間的凹陷處生長(zhǎng)。菌絲在皮層細(xì)胞間隙延伸并形成菌絲網(wǎng)，有時(shí)可延伸至細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)菌絲。菌絲顏色深淺不一，常見為深棕色至淺棕色，且隨著菌絲的延伸，顏色可逐漸變淺。菌絲壁較厚，具明顯的橫隔。菌絲直或曲，常伴有樹枝狀隨意隆起的分枝，并存在菌絲特化結(jié)構(gòu)，如沿植物根細(xì)胞內(nèi)壁盤曲的菌絲圈等。微菌核是由細(xì)胞壁膨大加厚的細(xì)胞緊密堆積形成，形狀大小不一。顏色多為深棕色，偶見較淺的顏色，分布于表皮、皮層細(xì)胞中或細(xì)胞間隙，少見于維管組織內(nèi)，有時(shí)可見其與菌絲相連。研究學(xué)者根據(jù)形態(tài)將微菌核定殖結(jié)構(gòu)分為聚合型(腦狀、啞鈴狀)和離散型(帶狀、鏈狀、星點(diǎn)狀等)。

圖1 植物根內(nèi)DSE定殖結(jié)構(gòu)Fig.1 DSE colonization structure in roots

DSE可進(jìn)行分離培養(yǎng)。培養(yǎng)基中的DSE菌落多呈圓形或橢圓形，顏色以灰色、黑色和褐色為主，表面平整或隆起具有褶皺，多有絨毛狀覆蓋，有些DSE產(chǎn)球形或橢圓形孢子，有些DSE不產(chǎn)孢。早期使用的長(zhǎng)rRNA基因序列分析支持了DSE的多系統(tǒng)起源，DSE分類研究運(yùn)用核糖體DNA-ITS序列分析技術(shù)進(jìn)行基因序列檢測(cè)。分子生物學(xué)分類可用于研究形態(tài)類群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為更好地了解其與宿主的相互作用奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)DSE真菌的分子結(jié)合形態(tài)系統(tǒng)研究和分類單元的重新評(píng)價(jià)，將為在形態(tài)相似、遺傳序列不同的類群中分離出具有不同生態(tài)功能的DSE開辟道路。

1.2 不同宿主植物DSE定殖特點(diǎn)

DSE作為內(nèi)生真菌，其與宿主植物間的互作關(guān)系以及定殖情況均會(huì)隨著外界環(huán)境條件的不斷變化而變化。植物物候是影響內(nèi)生真菌在宿主植物中定殖的關(guān)鍵因素。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)最高水平的內(nèi)生真菌定殖通常發(fā)生在宿主植物生長(zhǎng)季節(jié)的高峰或后期，內(nèi)生真菌數(shù)量的增減取決于植物的營(yíng)養(yǎng)需求和植物向真菌提供的光合產(chǎn)物輸出量，以及真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求和真菌向植物提供的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的數(shù)量。這一相互作用反映了隨宿主植物生長(zhǎng)季節(jié)的變化，植物根系向內(nèi)生真菌提供光合產(chǎn)物的輸出量不同，2者之間的營(yíng)養(yǎng)交換發(fā)生變化，進(jìn)而影響內(nèi)生真菌的定殖情況。DSE定殖與植物物候有關(guān)，但目前對(duì)于DSE與植物物候之間的關(guān)系仍不明確。MULLEN等發(fā)現(xiàn)，在生長(zhǎng)季節(jié)開始時(shí)，毛茛屬根內(nèi)DSE定殖率非常高，促進(jìn)了植物對(duì)氮的吸收。LI Han等研究發(fā)現(xiàn)夏季黑果枸杞根內(nèi)DSE菌絲定殖率高，促進(jìn)寄主植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用；冬季微菌核定殖率高，有助于宿主植物抵御寒冷環(huán)境。然而，也有研究學(xué)者在高山苔原濕草甸植物群落中對(duì)4種多年生草本植物在萌芽期、盛花期、幼果期、果實(shí)成熟期和落葉期5個(gè)物候期進(jìn)行采樣研究，發(fā)現(xiàn)DSE菌絲定殖率隨著時(shí)間的推移和宿主植物的不同均未發(fā)生顯著變化。這可能由于不同種類宿主植物的物候期對(duì)DSE定殖的影響程度不同。

DSE的宿主范圍較大，且缺乏宿主特異性，同種DSE可以定殖于多種宿主植物，例如，DSE ()能夠定殖大于20個(gè)物種，但不同宿主植物根系中DSE定殖率存在差異。植物種類對(duì)DSE菌絲定殖率和總定殖率具有顯著直接影響。在濕地生態(tài)系統(tǒng)中，DSE的定殖在單子葉植物中比雙子葉植物中更普遍。此外，研究表明DSE在根系較老的部分能更頻繁地定殖，表明DSE更喜歡衰老的根系組織。

1.3 不同生境中DSE生態(tài)型

在一個(gè)寄主物種中，微生物的生存環(huán)境相比宿主的基因型對(duì)其影響更大。研究表明從南非沿海平原和低地到熱帶、溫帶、亞高山、高山、海洋南極和北極地區(qū)的各種生境的宿主植物根系中均可觀察到DSE的定殖結(jié)構(gòu)，未表現(xiàn)出明顯的區(qū)域或環(huán)境特異性。隨海拔的升高，DSE菌絲變粗，顏色逐漸變深，橫隔膜縮短；微菌核由分散顆粒狀聚集成簇、成團(tuán)，并出現(xiàn)迷宮狀，顏色也顯現(xiàn)不同變化規(guī)律，且菌絲定殖率、微菌核和總定殖率逐漸增大。

DSE分布和定殖具有明顯的空間異質(zhì)性，與土壤因子密切相關(guān)。一些研究者認(rèn)為，土壤溫度和土壤濕度在定殖水平中發(fā)揮作用。土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、速效鉀、磷酸酶等土壤因子與DSE定殖率密切相關(guān)，但不同研究學(xué)者對(duì)于土壤因子與DSE定殖情況存在正/負(fù)相關(guān)性差異。土壤重金屬含量也會(huì)影響DSE在宿主植物根內(nèi)的定殖。DSE定殖情況與土層深度也存在相關(guān)關(guān)系，DSE總侵染率和定殖率隨土層加深而減小。此外，有研究發(fā)現(xiàn)根際DSE菌絲定殖率高于根圍。

可見，DSE在不同宿主植物和生境中存在不同的生態(tài)特征，但對(duì)于宿主植物種類和生境具有廣泛適應(yīng)性，且對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)，具有普適性。DSE可作為礦區(qū)生態(tài)修復(fù)的菌劑材料。

2 DSE在西部煤礦區(qū)生態(tài)修復(fù)作用機(jī)理

西部煤礦區(qū)氣候干旱、土壤貧瘠、采煤擾動(dòng)致使生物種群減少，生態(tài)系統(tǒng)脆弱。以微生物作為受損生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)的切入點(diǎn)，可從根本上改善土壤的生物組成結(jié)構(gòu)，提升土壤質(zhì)量，恢復(fù)土地生態(tài)系統(tǒng)。礦區(qū)修復(fù)植被的健康與適應(yīng)性不僅與植物基因組有關(guān)，還與環(huán)境中的多種生物因子有著錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系。DSE對(duì)宿主植物的生態(tài)作用是多方面的，其促進(jìn)宿主礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，保護(hù)宿主免受非生物脅迫(水分脅迫、鹽脅迫、重金屬脅迫、寒冷脅迫等)和生物脅迫(病原菌傷害)都發(fā)揮重要作用，可增強(qiáng)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性。

2.1 DSE對(duì)宿主植物礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收的作用機(jī)理

西部礦區(qū)土壤貧瘠，磷是關(guān)鍵的限制因子。而磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，在植物體內(nèi)不僅參與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組成，而且在新陳代謝和遺傳信息傳遞等方面都起著重要作用。HASELWANDTER和READ給接種DSE后，發(fā)現(xiàn)其能增加植物的生物量和莖稈中的磷含量。JUMPPONEN和TRAPPE研究發(fā)現(xiàn)，DSE可以分解不溶性磷酸鹽供宿主植物利用。徐潤(rùn)冰將DSE菌片分別接種于有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)DSE能分泌酸性磷酸酶和質(zhì)子，將難溶性磷轉(zhuǎn)換成可溶性磷酸根。通過(guò)對(duì)不同磷水平下接種DSE()對(duì)玉米磷吸收的影響發(fā)現(xiàn)DSE對(duì)不同形式的磷酸根吸收功能不同，DSE通過(guò)增強(qiáng)植物磷吸收相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)植物分泌質(zhì)子，增加細(xì)胞內(nèi)可溶性磷酸根；還可以通過(guò)分泌大量酸性和堿性磷酸酶來(lái)分解難溶性磷，促進(jìn)玉米磷元素吸收。

2.2 DSE對(duì)宿主植物抗逆性的作用機(jī)理

西部礦區(qū)生境差，植物的適應(yīng)性弱而導(dǎo)致生態(tài)修復(fù)難。DSE對(duì)各種逆境，如干旱、低溫、鹽度、重金屬等表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受力。植物可與內(nèi)生真菌結(jié)合以提高其對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性，提高生態(tài)修復(fù)效率。

..DSE對(duì)植物對(duì)水分脅迫的抗性作用

在干旱脅迫下，DSE對(duì)植物的定殖可以增加植物生物量，調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)，穩(wěn)定光合作用參數(shù)，降低氣孔導(dǎo)度，減少整體水分損失。LIU YAN等發(fā)現(xiàn)接種DSE()可有效降低干旱脅迫對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷，幫助宿主改善根系的形態(tài)和構(gòu)型，擴(kuò)大根系的吸收范圍，增加根系與土壤的接觸，提高植物適應(yīng)脅迫環(huán)境的能力。此外，接種DSE可以通過(guò)調(diào)節(jié)根系中激素含量水平和比例來(lái)調(diào)節(jié)根系形態(tài)和構(gòu)型，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，抵抗干旱脅迫環(huán)境，從而提高宿主的抗旱性。在干旱條件下，ZHANG Qiaoming等接種DSE(GM25)促進(jìn)高粱(L. Moench)生長(zhǎng)，加快植株光合速率和蒸騰速率，提高次生代謝產(chǎn)物花青素含量，改善次生代謝相關(guān)的酶活性。

..DSE對(duì)植物鹽脅迫的抗性機(jī)理

鄧勛等在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)DSE()，發(fā)現(xiàn)DSE對(duì)NaCl和NaSO耐受性較好。之后，進(jìn)一步將DSE接種到樟子松苗木中，通過(guò)提高宿主植物的抗氧化酶活性，同時(shí)降低丙二醛(MDA)和游離脯氨酸含量來(lái)緩解鹽脅迫對(duì)樟子松苗木的傷害。MATEU等研究發(fā)現(xiàn)蘆葦根內(nèi)的DSE()增強(qiáng)了蘆葦?shù)哪望}性，提高了在易受海水入侵地區(qū)的存活率。此外，DSE自身產(chǎn)生的黑色素、甘露醇和海藻糖等代謝產(chǎn)物可以幫助宿主提高對(duì)鹽脅迫的抗性。ZHAN Fangdong等發(fā)現(xiàn)黑色素可以消除鹽脅迫產(chǎn)生的自由基，DSE中分離出的黑色素被報(bào)道具有很高的抗氧化活性。甘露醇和海藻糖等被認(rèn)為是保護(hù)植物免受非生物脅迫引起的細(xì)胞損傷的重要滲透物質(zhì)，DSE細(xì)胞可以吸收來(lái)自宿主的蔗糖，最終將其轉(zhuǎn)化為甘露醇和海藻糖。值得思考的是，干旱和鹽脅迫誘發(fā)了類似的整體脅迫(水分虧缺狀態(tài))，觸發(fā)了類似的植物早期反應(yīng)；因此，幫助植物抵御鹽度的微生物也可能使植物耐受干旱脅迫。

..DSE對(duì)植物重金屬脅迫的抗性機(jī)理

DSE可以將金屬離子或其絡(luò)合物直接泵出宿主植物細(xì)胞外，通過(guò)細(xì)胞外螯合防止重金屬元素滲透到細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞間隔中絡(luò)合和隔離重金屬元素以抑制其毒性。例如，DSE可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)以PCs絡(luò)合物或谷胱甘肽絡(luò)合物形式存在的重金屬至宿主植物細(xì)胞液泡或其他位于細(xì)胞質(zhì)的泡囊中區(qū)隔儲(chǔ)存，將金屬離子FeS簇結(jié)合物從宿主植物線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，并區(qū)隔儲(chǔ)存。

在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平上，DSE可以通過(guò)參與調(diào)控宿主植物根系細(xì)胞壁合成通路相關(guān)基因的表達(dá)，激活細(xì)胞壁合成關(guān)鍵酶的活性，強(qiáng)化細(xì)胞壁對(duì)根系吸收的游離重金屬離子的固持與區(qū)室化作用，進(jìn)而改變重金屬離子在植物根組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上的分布，限制其向原生質(zhì)體和地上部分的運(yùn)輸，以減輕重金屬毒害。此外，利用微陣列或RNA-seq技術(shù)進(jìn)行了DSE和轉(zhuǎn)錄組研究，以確定其涉及金屬耐受性的基因。這2項(xiàng)研究報(bào)告了中谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶和Nramp金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能特征，這是DSE中惟一可用的功能基因組數(shù)據(jù)。

..DSE對(duì)植物抗寒的作用機(jī)理

低溫可引起生物分子間的物理和化學(xué)變化，低溫(<15 ℃)和冰凍(<0 ℃)條件對(duì)植物的發(fā)育有重要的限制。在極地和高山生態(tài)系統(tǒng)中，DSE可能對(duì)植物養(yǎng)分獲取有積極影響，從而提高植物對(duì)寒冷條件的耐受力。UPSON 等研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在5 ℃條件下，接種6種DSE的可以顯著提高宿主植物的地上和地下生物量。同樣，養(yǎng)分有效性也改變了DSE()和大麥()之間相互作用的結(jié)果，在8 ℃條件下，無(wú)論土壤養(yǎng)分有效性高或低，植株生物量和粒重均得到提高。

..DSE對(duì)植物抗病的作用機(jī)理

微生物可以通過(guò)增強(qiáng)植物的抵抗力或耐受性，或通過(guò)它們對(duì)植物病原體的直接拮抗來(lái)保護(hù)植物免受病原體的傷害。一些研究表明，DSE具有控制植物病害的潛力。DSE()通過(guò)積累HO和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性保護(hù)水稻植株不受稻瘟病病原菌()侵染，DSE()降低了離體卷心菜中黃萎病病原菌()的癥狀，DSE()降低了感染病原菌()的番茄植株的萎蔫病，DSE(sp.)在提供有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中增強(qiáng)了甜瓜幼苗對(duì)病原菌(f. sp.)的抗性?？梢?，DSE可以通過(guò)改變植物的生物化學(xué)特性進(jìn)而提高植物的抗病性或耐受性。DSE可以通過(guò)增強(qiáng)植物抗氧化系統(tǒng)，調(diào)節(jié)抗病相關(guān)酶活性和抗病相關(guān)物質(zhì)的含量，提高植物抗病性。此外，還可通過(guò)改善植物根際微環(huán)境，增加微生物群落穩(wěn)定性，從而提高植物的存活能力，增強(qiáng)植物抗病性。

2.3 DSE代謝物對(duì)宿主植物的刺激效應(yīng)

3 DSE在西部煤礦區(qū)生態(tài)修復(fù)應(yīng)用模式

微生物菌劑在礦區(qū)生態(tài)環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用被認(rèn)為是可持續(xù)技術(shù)，具有經(jīng)濟(jì)高效、低能耗、不產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)，礦區(qū)微生物修復(fù)具有較大的應(yīng)用潛力和市場(chǎng)。目前關(guān)于DSE的研究大多限于DSE生態(tài)多樣性調(diào)查和室內(nèi)抗逆機(jī)理，對(duì)DSE菌劑的開發(fā)及生態(tài)修復(fù)應(yīng)用仍處于起步階段。利用DSE特性開發(fā)出液體應(yīng)用方法和固體菌劑產(chǎn)品，規(guī)?；瘧?yīng)用于礦區(qū)生態(tài)修復(fù)將是微生物復(fù)墾新的思路和方向。

3.1 DSE菌液浸種搭載無(wú)人機(jī)飛播生態(tài)修復(fù)模式

常規(guī)液體菌劑野外規(guī)?；瘧?yīng)用是將液體發(fā)酵菌液直接施用于根際土壤，菌劑的需求量大，且液體儲(chǔ)存、運(yùn)輸成本高，大面積礦區(qū)復(fù)墾實(shí)踐很難推廣。考慮礦區(qū)生態(tài)修復(fù)普遍采用大面積撒播灌草種子，且地形復(fù)雜多變，采用低成本高效的菌液浸種搭載無(wú)人機(jī)飛播技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多物種組合的立體快速生態(tài)修復(fù)效果(圖2)。

圖2 無(wú)人機(jī)飛播作業(yè)及飛播參數(shù)試驗(yàn)Fig.2 Uar broadcast operation and broadcast parameters test

微生物菌液浸種可以促進(jìn)植物健康生長(zhǎng)，提高植物抗逆性。采用濃度為20%的DSE(sp.)針A2-7的菌液浸泡玉米種子12 h可以促進(jìn)種子快速萌發(fā)，并顯著促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)，對(duì)于在西部煤礦區(qū)植被重建具有重大的應(yīng)用推廣價(jià)值。

無(wú)人機(jī)飛播具有作業(yè)速度快、工作效率高、適用范圍廣、操作便利等優(yōu)點(diǎn)。在西部采煤沉陷區(qū)，可以通過(guò)對(duì)采煤沉陷區(qū)地形圖的坡度分級(jí)和地面覆蓋率，確定無(wú)人機(jī)飛播過(guò)程中的撒播系數(shù)和飛行參數(shù)，如在陜北張家峁礦區(qū)飛播豌豆的無(wú)人機(jī)飛行高度為2 m、飛行速度為4 m/s、材料漏速為8.22 kg/min，作業(yè)間距為6 m。通過(guò)無(wú)人機(jī)飛播遙控式作業(yè)，不僅可以提高種子撒播均勻度、減少勞動(dòng)力成本，還可以使地形復(fù)雜的西部礦區(qū)實(shí)現(xiàn)“全覆蓋”生態(tài)修復(fù)。

3.2 DSE固體菌劑生態(tài)修復(fù)模式

生長(zhǎng)活躍的DSE菌絲體相比微菌核在土壤中生長(zhǎng)更快、更活躍。DSE菌液可以濃縮菌絲體干燥后制成DSE固體菌劑膠囊，也可采用礦區(qū)本地采礦伴生黏土制丸粒，具有廣闊的應(yīng)用前景(圖3)。膠囊和丸粒固體菌劑可常溫保存，解決液體菌劑不宜長(zhǎng)期儲(chǔ)存且運(yùn)輸不便等問題。DSE(sp.)針A2-1在60 ℃下干燥，常溫保存20 d仍可保持DSE生物活性，固體菌劑研發(fā)可延長(zhǎng)DSE菌存活時(shí)間，更大程度發(fā)揮其促進(jìn)礦區(qū)生態(tài)恢復(fù)的價(jià)值。菌劑接種到根際土壤后繁殖迅速，侵染率高。培養(yǎng)10 d的DSE固體菌劑對(duì)紫花苜蓿的促生作用顯著，能夠提高紫花苜蓿的養(yǎng)分吸收能力。

圖3 固體菌劑研制Fig.3 Development of solid bactericide

3.3 DSE菌液葉面肥涂抹生態(tài)修復(fù)模式

DSE菌液進(jìn)入土壤后容易被土壤吸附或者固定，影響菌肥效應(yīng)的發(fā)揮，所需菌液量較大，費(fèi)工費(fèi)力。將葉面肥DSE菌液以葉片涂抹方式接入，可以最大效率提高菌肥的利用率，產(chǎn)生較好的接菌生態(tài)效應(yīng)，可以提高葉片對(duì)菌液有效養(yǎng)分的吸收。DSE菌液代謝物是影響宿主植物和土壤環(huán)境的重要化合物，影響植物在分子水平上的反應(yīng)，促進(jìn)色素、次生代謝物、激素、抗氧化劑和生物堿的生物合成，這對(duì)宿主植物促生等也發(fā)揮著重要作用。

盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在葉面直接涂抹DSE菌液可以明顯促進(jìn)蛋白桑生長(zhǎng)，提高蛋白桑營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)(圖4)，對(duì)蛋白桑生物量的貢獻(xiàn)率高達(dá)226%。采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析(UPLC-MS)檢測(cè)DSE菌液代謝產(chǎn)物，含有137余種化合物，包括氨基酸和肽類、有機(jī)氧化合物、脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子、有機(jī)雜環(huán)化合物、苯丙烷和聚酮化合物等11種類型，其中以氨基酸和肽類為主，占總化合物的36.45%。

圖4 DSE代謝物葉面涂抹效果Fig.4 Foliar coating effect of DSE metabolites

氨基酸和肽類化合物作為葉面肥可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高抗凍、抗旱、耐鹽、光合活性和對(duì)真菌、細(xì)菌和病毒的抵抗力。相比直接施入土壤方式，葉面肥涂抹更為高效。后期需要考慮環(huán)境參數(shù)的影響(如日照、降水)，需對(duì)植物吸收、運(yùn)輸和利用葉面肥養(yǎng)分的物理、化學(xué)、生物和環(huán)境等機(jī)理進(jìn)一步探索，進(jìn)一步提升DSE菌液作為葉面肥的功效。

綜上所述，DSE菌劑產(chǎn)品可對(duì)西部煤礦區(qū)生態(tài)修復(fù)產(chǎn)生積極促進(jìn)作用，有潛在的生態(tài)修復(fù)利用價(jià)值，但DSE生態(tài)修復(fù)的長(zhǎng)期生態(tài)效應(yīng)仍有許多未知需要探索，各種非生物因素(植物種類、土壤pH值、水分、質(zhì)地、養(yǎng)分和鹽度等)均可能會(huì)影響DSE菌劑的定殖和生態(tài)效應(yīng)，DSE對(duì)西部礦區(qū)生態(tài)修復(fù)長(zhǎng)期作用效果仍有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 語(yǔ)

DSE作為自然界土壤中的一類廣譜真菌，對(duì)于促進(jìn)土壤養(yǎng)分活化，增加植物生物量，抵抗逆境具有重要的作用，可以減緩煤炭開采對(duì)土壤性狀和生物種群的損傷，對(duì)于煤礦區(qū)受損生態(tài)修復(fù)具有積極促進(jìn)意義。DSE浸種搭載無(wú)人機(jī)飛播、固體菌劑研發(fā)、DSE葉面肥的開發(fā)等多樣化生態(tài)修復(fù)模式將會(huì)為西部煤礦區(qū)土地復(fù)墾與生態(tài)修復(fù)提供多樣化的技術(shù)支撐，具有重要的現(xiàn)實(shí)生態(tài)意義。預(yù)計(jì)在未來(lái)，多樣化的DSE菌劑材料將應(yīng)用礦區(qū)生態(tài)修復(fù)，以加速實(shí)現(xiàn)西部礦區(qū)的生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

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