益氣補腎調(diào)脂方通過調(diào)控CDKN1A改善非酒精性脂肪性肝炎的研究

嚴(yán)峻彬，聶云夢，張婷婷，徐素美，陳芝蕓

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院第二中心實驗室，浙江 杭州 310006)

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的一個重要階段。有別于可以通過減脂逆轉(zhuǎn)的單純性脂肪變(nonalcoholic fatty liver,NAFL)[1]，NASH是更加危險的疾病階段[2]，會進(jìn)一步惡化為肝硬化、肝衰竭及肝細(xì)胞癌[3]。大量研究提示，NASH的發(fā)病機(jī)制可能涉及肝臟炎癥、氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞衰老[4]，但NASH發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。目前，臨床缺乏特效藥，以對癥治療為主，包括使用維生素E(抗氧化劑)緩解NASH伴隨的氧化應(yīng)激[5]。NASH在西醫(yī)治療中尚存不足。

根據(jù)臨床表型，NASH歸屬“肝癖”、“積聚”。2012年，中華中醫(yī)藥學(xué)會診斷專業(yè)委員會將其正式歸屬于“肝癖”的范疇[6]。中醫(yī)憑借獨特的整體觀念治療NASH，取得了較好的臨床療效。過食肥甘厚膩，耗傷脾胃，中焦運化失能，中氣虧虛，腎虛氣化不利，共致水濕內(nèi)停，久而生痰，痰濕內(nèi)蘊，生熱化瘀，最終痰、熱、瘀、濕糾結(jié)傷肝。益氣補腎，活血化瘀被視為中醫(yī)治療NASH的基本法則。補益脾腎以補氣行氣、化濕逐痰；活血化瘀以通暢血脈、消散瘀滯。益氣補腎調(diào)脂方(Yiqi-Bushen-Tiaozhi formula，YBTF)是課題組臨床長期用于治療NASH的經(jīng)驗方，由黃芪、淫羊藿、茯苓、白術(shù)、海藻、郁金、桃仁、山楂、何首烏9味中藥組成。方中黃芪伍以茯苓、白術(shù)益氣健脾，補而不膩；淫羊藿、何首烏補腎益精；郁金活血行氣，兼以疏肝；海藻、桃仁輔以山楂共奏活血化瘀之功效；全方具有益氣健脾、補腎益肝、活血化瘀的作用。課題組前期研究證實，YBTF能通過抗氧化應(yīng)激，減輕肝組織氧化損傷，改善高脂高糖誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟脂肪變及炎癥[7]；能直接改善西式飲食造成的小鼠肝損傷：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)升高及脂質(zhì)代謝紊亂：血清總膽固醇(CHOL)升高，血清甘油三酯(TG)降低，但對血清TG水平無明顯影響[8]。多年的臨床應(yīng)用也證明，YBTF具有極佳的改善NASH的療效。但因復(fù)方多靶點、多途徑治療疾病的特點，尚不能明確YBTF治療NASH的確切機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，結(jié)合多學(xué)科技術(shù)內(nèi)容，探究復(fù)方各味藥與疾病的關(guān)聯(lián)，明確中藥復(fù)方的有效成分及作用靶點，為研究中藥復(fù)方的治療機(jī)制提供新的角度。合理運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有助于篩選復(fù)方治療疾病的靶點與機(jī)制。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對YBTF的作用靶點及治療機(jī)制進(jìn)行初步篩選，通過體內(nèi)實驗進(jìn)行驗證，試圖明確YBTF治療NASH的關(guān)鍵靶基因及信號通路，為YBTF的臨床推廣提供理論支持。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及靶基因篩選

1.1 分析工具(Tab 1)

Tab 1 Public databases and analysis software used in study

1.2 篩選YBTF治療NASH的靶點

1.2.1篩選YBTF的活性成分與作用靶點 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug-like，DL)≥0.18為篩選閾值，結(jié)合課題組前期HPLC-MS檢測的YBTF化學(xué)成分[8]，篩選YBTF的活性成分及作用靶點。利用 UniProt 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行作用靶點的名稱轉(zhuǎn)換。口服生物利用度反映藥物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的速度及程度，類藥性則反應(yīng)有效成分與已知藥物的相似性，兩者共為評價藥物內(nèi)在質(zhì)量的重要指標(biāo)。

1.2.2篩選YBTF治療NASH的靶基因 通過GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE89632數(shù)據(jù)集，篩選正常組與NASH組間的差異基因。篩選閾值為p.adjust<0.05，|logFC|>1。使用GeneCards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫以“nonalcoholic steatohepatitis”為關(guān)鍵詞，檢索NASH相關(guān)疾病基因。將YBTF的作用靶點與差異基因、疾病基因取交集，交集基因為YBTF治療NASH的靶基因。

1.3 分析YBTF治療NASH的靶基因并篩選關(guān)鍵治療靶基因

1.3.1GO、KEGG、DO富集分析 使用R語言的R包org.Hs.eg.db將靶點基因的gene symbol轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的EntrezID，接著使用R包clusterProfiler[9]進(jìn)行基因本體論(Gene ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、疾病本體論(Disease ontology,DO)富集分析。篩選條件為p.adjust<0.05，q<0.05。根據(jù)富集分析結(jié)果，明確YBTF治療靶基因的基因功能及涉及的信號通路。

1.3.2構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?使用Cytoscape 3.8.0軟件插件BisoGenet結(jié)合篩選到的YBTF治療NASH的靶基因構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。使用插件CytoNCA進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，依次根?jù)條件度中心性(degree centrality，DC)≥30及中介中心性(betweenness centrality，BC)≥30構(gòu)建子網(wǎng)絡(luò)，篩選位于核心網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶基因。

1.3.3篩選YBTF的關(guān)鍵治療靶基因 通過GO、KEGG富集分析結(jié)果明確YBTF靶基因的基因功能及涉及的通路。結(jié)合蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選出的位于核心子網(wǎng)絡(luò)以及在蛋白互作中發(fā)揮關(guān)鍵作用的靶基因。

2 靶基因篩選結(jié)果的驗證

2.1 分子對接驗證使用Autodock軟件根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)，將YBTF治療NASH的關(guān)鍵靶基因與YBTF的關(guān)鍵活性成分進(jìn)行分子對接，以判斷兩者能否順利結(jié)合，發(fā)揮療效。通過有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫下載配體(YBTF關(guān)鍵活性成分)的3D結(jié)構(gòu)；通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫下載受體(YBTF關(guān)鍵靶基因)的蛋白結(jié)構(gòu)。對受體蛋白進(jìn)行加氫，去除水分子的處理，同時設(shè)置活性口袋，進(jìn)行分子對接。

2.2 動物實驗驗證

2.2.1實驗主要試劑(Tab 2)

Tab 2 The main reagents used in experiment

2.2.2實驗動物分組 24只雄性C57BL/6小鼠(購自于上海西普爾-必凱實驗物有限責(zé)任公司；許可證號：SCXK(滬)2013-0016；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成正常組(Normal diet，ND)、西式飲食組(Western diet，WD)、YBTF治療組(YBTF treatment，YBTF)，每組8只。ND組小鼠予以正常飼料(蛋白質(zhì)占0.215，脂肪占0.123，碳水化合物占0.662)，并自由飲水。WD、YBTF組小鼠予以高脂高糖的西式飲食(豬油占0.10，蛋黃粉占0.05，膽固醇占0.02，膽鹽占0.005，基本飼料占0.825；基本飼料構(gòu)成：蛋白質(zhì)占0.216，脂肪占0.361，碳水化合物占0.423)，并自由飲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的果糖水。其中，第5周起，YBTF組小鼠每天予以22.80 g·kg-1的YBTF流浸膏(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥制劑中心制備)灌胃干預(yù)治療,YBTF藥物構(gòu)成詳見Fig 1。同時給予其他組小鼠相同體積的0.9% NaCl。第16周末處死所有小鼠，實驗前小鼠禁食12 h(飲水不受限)?？崭孤樽硐氯⊙?，分離血清待用；分離肝臟,部分以4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋待用。其余肝組織放入液氮2 h后凍存于-80 ℃冰箱中待用。本次動物實驗得到浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(決議號：ZSLL-2016-139)。

Fig 1 Chinese herbs of Yiqi-Bushen-Tiaozhi formula

2.2.3小鼠肝組織病理檢測 油紅O染色(Oil-red O staining)和蘇木精-伊紅染色(HE staining)檢測小鼠肝組織病變。

2.2.4β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色檢測小鼠肝組織衰老 小鼠肝組織石蠟切片按照常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟、水化。配置β-半乳糖苷酶染色液。肝組織切片加入適量染色液，無CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育14 h。光鏡(200×)觀察染色結(jié)果。

2.2.5Western blot檢測肝組織CDKN1A蛋白表達(dá)水平 使用普利來全蛋白提取試劑盒提取小鼠肝組織的蛋白；使用BCA法進(jìn)行蛋白定量,結(jié)果為20 g·L-1。加2×SDS上樣緩沖液并95 ℃變性后-80 ℃保存。使用10% SDS-PAGE膠，每孔80 μg上樣，200 V恒壓電泳40 min，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜90 min；發(fā)光筆涂抹marker，使用5%小牛血清室溫封閉1 h后，加入相應(yīng)一抗CDKN1A(1 ∶800)，GAPDH(1 ∶5 000)，4 ℃冰箱過夜；TBST洗膜后加入相應(yīng)的抗兔或抗鼠二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h；TBST洗膜后以ECL在FCE型ProteinSimple化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影，AlphaView SA 3.3.0.0軟件分析灰度值，采用目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.2.6qRT-PCR檢測肝組織CDKN1A mRNA表達(dá) 使用RNAiso Plus試劑盒提取肝組織總RNA；采用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒以500 ng總RNA為模板合成cDNA，以下列反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)：2×SYBR 5 μL、10 μmol·L-1上下引物各0.4 μL、10 μg·L-1的cDNA模板2 μL、加雙蒸水(double distilled H2O，ddH2O)補充體積至10 μL，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)性5 min，再95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，循環(huán)擴(kuò)增40次，溶解曲線分析：95 ℃×15 s，60 ℃×5 s，緩慢上升至95 ℃×15 s。以β-actin為內(nèi)參，相對表達(dá)量(2-△△Ct)來表示目的基因CDKN1A的mRNA表達(dá)水平?；蛞镉缮ど锕こ?上海)有限公司設(shè)計并合成 (Tab 3)。

Tab 3 List of qRT-PCR primer

3 結(jié)果

3.1 YBTF活性成分及治療靶基因的篩選TCMSP中無法檢索到山楂、何首烏，因此使用中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫(ETCM)搜索山楂、何首烏的活性成分及作用靶點。結(jié)果顯示YBTF共有223個作用靶點，105個活性成分。在105個活性成分中，只有75個活性成分具有對應(yīng)得作用靶點，其中淫羊藿、桃仁、黃芪的活性成分?jǐn)?shù)量位列前三(Fig 2A)。HPLC-MS檢測結(jié)果則顯示YBTF的主要化學(xué)成分包括有機(jī)氧化物、黃酮類及異黃酮類化合物。分析后發(fā)現(xiàn)槲皮素(quercetin)、常春藤皂苷元(hederagenin)等活性成分同時存在于多味中藥中，是YBTF發(fā)揮療效的重要活性成分(Tab 4)。GSE89632數(shù)據(jù)集中共有19個NASH樣本，24個正常樣本，篩選得到195個差異基因(Fig 2B)。GeneCards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫共篩選出NASH疾病基因748個(Fig 2Ca)；三者的交集基因PTGS2、CDKN1A、IL6、IL1β被視作YBTF治療NASH的治療靶基因(Fig 2Cb)。

Fig 2 Analysis of YBTF active ingredients and screening of target genesA.Screening results of YBTF active ingredients;B.Screening results of differentially expressed genes;C.Screening results of YBTF target genes

Tab 4 Top 5 crucial ingredients of YBTF

3.2 GO、KEGG、DO富集結(jié)果分析GO富集分析主要包括細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)。共計富集到符合篩選條件的生物過程10條，分子功能10條與細(xì)胞組分6條(Fig 3A)。分析后發(fā)現(xiàn)YBTF治療靶基因的基因功能多與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)相關(guān)。KEGG富集分析共富集到93條通路，其中富集到多個基因(基因數(shù)量≥2)的通路共計49條，篩選可信度最高的前20條通路進(jìn)行可視化(Fig 3B)。結(jié)果顯示YBTF的治療靶基因多涉及炎癥、細(xì)胞周期相關(guān)通路。結(jié)合GO、KEGG富集分析的結(jié)果,考慮YBTF的治療靶基因多參與細(xì)胞周期、炎癥的調(diào)控。DO富集分析共富集到505個與YBTF治療靶基因相關(guān)的疾病，篩選與4個關(guān)鍵靶基因均密切相關(guān)的DO富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化(Fig 3C)。其中紅色條柱是肝臟炎癥相關(guān)疾病，結(jié)果顯示與上述YBTF治療靶基因關(guān)系最為密切的肝臟疾病包括肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎，提示PTGS2、CDKN1A、IL6、IL1β可能是與肝組織炎癥相關(guān)的疾病基因。

Fig 3 Enrichment analysis resultsA.GO enrichment analysis results;B.KEGG enrichment analysis results;C.DO enrichment analysis results

3.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果使用Cytoscape 3.8.0軟件的插件BisoGenet、CytoNCA以YBTF治療靶基因為基礎(chǔ)構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，通過節(jié)點度(Degree)≥30及介數(shù)中心度(Betweenness)≥30構(gòu)建子網(wǎng)絡(luò)，篩選出位于核心位置基因(Tab 5)。結(jié)果顯示CDKN1A是YBTF所有治療靶基因中唯一一個位于核心子網(wǎng)絡(luò)中的基因，將其視為是YBTF治療NASH的關(guān)鍵靶基因。

Tab 5 Hub genes in network topology analysis

3.4 篩選YBTF的關(guān)鍵靶基因GO、KEGG富集分析結(jié)果顯示，YBTF的治療靶基因多參與細(xì)胞周期、炎癥的調(diào)控。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示在所有YBTF治療NASH的治療靶基因中，只有CDKN1A位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，是關(guān)鍵靶基因。結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，CDKN1A可以調(diào)控細(xì)胞衰老，是直接反映細(xì)胞衰老的標(biāo)志?；诖?，提出假設(shè)YBTF通過靶向CDKN1A，改善肝細(xì)胞的細(xì)胞衰老，治療NASH。

3.5 分子對接驗證結(jié)果網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示CDKN1A是YBTF治療NASH的關(guān)鍵靶基因，槲皮素、常春藤皂苷元、β-谷甾醇是YBTF發(fā)揮療效的關(guān)鍵活性成分(篩選出現(xiàn)頻率排名前三的活性成分視為關(guān)鍵成分)。因此，使用Autodock軟件進(jìn)行分子對接，Pymol、Discovery Studio 2016軟件用于結(jié)果可視化，驗證YBTF發(fā)揮療效的關(guān)鍵有效成分能否與YBTF的關(guān)鍵靶基因CDKN1A實現(xiàn)對接。分別從PDB數(shù)據(jù)庫下載CDKN1A的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(PDB ID ：2ZVV)；從PubChem數(shù)據(jù)庫下載皮素、常春藤皂苷元、β-谷甾醇的3D結(jié)構(gòu)。小分子配體能否與大分子蛋白結(jié)合主要通過結(jié)合能進(jìn)行判斷，結(jié)合能小于0，說明配體能自發(fā)和受體結(jié)合，結(jié)合能數(shù)值越小表示配體與受體的結(jié)合能力越強，提示活性成分越容易與靶基因結(jié)合，發(fā)揮療效。CDKN1A與槲皮素、常春藤皂苷元、β-谷甾醇的最低自由結(jié)合均小于0(Tab 6)。槲皮素、常春藤皂苷元、β-谷甾醇均能與YBTF的治療NASH的關(guān)鍵靶點CDKN1A實現(xiàn)對接，提示YBTF的重要活性成分槲皮素、常春藤皂苷元、β-谷甾醇可能可以作用于CDKN1A，改善細(xì)胞衰老(Fig 4)。

Fig 4 The docking results of CDKN1A with quercetin,hederagenin,and β-sitosterola.The chemical bond results of the docking of CDKN1A with quercetin (2D);b.The chemical bond results of the docking of CDKN1A with hederagenin (2D);c.The chemical bond results of the docking of CDKN1A with β-sitosterol (2D);d.Docking result of CDKN1A with quercetin (3D);e.Docking result of CDKN1A with hederagenin (3D);f.Docking result of CDKN1A with β-sitosterol (3D)

Tab 6 Molecular docking results of crucial ingredients of YBTF and CDKN1A

3.6 動物實驗驗證結(jié)果

3.6.1YBTF能顯著改善NASH小鼠的炎癥及脂肪變 油紅O染色的結(jié)果表明，WD組小鼠的肝臟脂質(zhì)堆積水平遠(yuǎn)高于ND組小鼠。相較于WD組小鼠，YBTF處理的小鼠肝臟異常脂質(zhì)堆積明顯改善。HE染色結(jié)果表明，WD組小鼠肝組織的炎癥細(xì)胞浸潤較ND組小鼠更嚴(yán)重。YBTF干預(yù)組小鼠肝臟炎性細(xì)胞浸潤程度較WD組小鼠明顯改善(Fig 5)。提示YBTF能顯著改善NASH小鼠的炎癥及脂肪變。

Fig 5 Results of Oil-red O and HE staining(100×)

3.6.2β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色檢測小鼠肝組織衰老 觀察染色結(jié)果表明，ND組未見明顯β-半乳糖苷酶染色深藍(lán)色產(chǎn)物，WD組小鼠肝組織深藍(lán)色產(chǎn)物顯著增多；YBTF干預(yù)組小鼠肝組織β-半乳糖苷酶染色陽性則較WD組小鼠明顯改善(Fig 6)。結(jié)果提示NASH小鼠肝組織伴隨細(xì)胞衰老，YBTF能明顯改善細(xì)胞衰老。同時發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞多集中于脂肪變細(xì)胞周邊，提示脂肪變與細(xì)胞衰老之間可能存在密切關(guān)聯(lián)。

Fig 6 Results of SA-β-Gal staining(200×)

3.6.3Western blot檢測肝組織CDKN1A蛋白表達(dá)水平 相較于予以正常飼料的ND組小鼠，給予西式飲食喂養(yǎng)的WD組小鼠CDKN1A表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。其中，從第5周起,每天予以22.80 g·kg-1的益氣補腎調(diào)脂方流浸膏治療的YBTF組小鼠肝臟CDKN1A表達(dá)量較WD組明顯降低(P<0.05)(Fig 7)。結(jié)果提示持續(xù)攝入高糖高脂的西式飲食在造成NASH小鼠模型的同時更會導(dǎo)致CDKN1A表達(dá)上調(diào)，YBTF干預(yù)治療可逆轉(zhuǎn)該過程。

Fig 7 Results of Western blot *P<0.05 vs ND;#P<0.05 vs WD

3.6.4qRT-PCR檢測肝組織CDKN1A mRNA表達(dá) 課題組前期分別各選取ND、WD、YBTF組3只小鼠的肝組織進(jìn)行基因組測序[9]。分析發(fā)現(xiàn)WD組小鼠，CDKN1A表達(dá)量較ND組小鼠明顯上升，YBTF干預(yù)治療后表達(dá)量明顯下降(P<0.01)(Fig 8A)。qRT-PCR實驗結(jié)果也顯示，在WD小鼠中CDKN1A mRNA表達(dá)量異常升高，YBTF干預(yù)治療可以有效地降低CDKN1A mRNA表達(dá)量(P<0.05)(Fig 8B)。

Fig 8 Results of sequencing and qRT-PCR **P<0.01 vs ND;#P<0.05,##P<0.01 vs WD

4 討論

YBTF是課題組臨床長期使用中藥復(fù)方，具有極佳的改善NASH的療效。課題組已通過miRNA測序結(jié)合實驗明確YBTF可以通過改善炎癥、免疫、氧化應(yīng)激治療NASH小鼠[8]，但未明確YBTF發(fā)揮療效的具體作用靶點。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從中藥復(fù)方單位藥的活性成分、作用靶點入手研究，通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的方式篩選復(fù)方治療疾病的作用靶點，研究方式貼合中藥復(fù)方多靶點、多途徑的治療原則。因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合GO、KEGG富集分析篩選YBTF治療NASH的作用機(jī)制及靶基因，伍以分子對接、WB、qRT-PCR對篩選結(jié)果進(jìn)行驗證。

結(jié)果顯示YBTF可以治療NASH，關(guān)鍵作用靶基因是CDKN1A，又名P21。諸多研究證實，當(dāng)細(xì)胞端粒出現(xiàn)DNA損傷時，CDKN1A能夠通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性，引起細(xì)胞周期停滯，進(jìn)行DNA修復(fù),使細(xì)胞恢復(fù)穩(wěn)態(tài)[10]。但CDKN1A的過表達(dá)則會導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，從而出現(xiàn)一系列細(xì)胞衰老的征象[11]，通過靶向抑制CDKN1A的表達(dá)可顯著改善細(xì)胞衰老[12]。CDKN1A與細(xì)胞衰老密切相關(guān)，是公認(rèn)的細(xì)胞衰老標(biāo)志。

細(xì)胞衰老是在各種應(yīng)激因子誘導(dǎo)下出現(xiàn)的一種細(xì)胞周期停滯且不可逆的狀態(tài)。常見的誘導(dǎo)因素包括端粒功能障礙，遺傳毒性及氧化應(yīng)激等。其中，細(xì)胞端?？s短是細(xì)胞衰老的常見原因。數(shù)次分裂后，由于端?？s短，細(xì)胞激活p53、p21、pRb等途徑，從而導(dǎo)致生長停滯及細(xì)胞衰老。越來越多的證據(jù)表明，衰老是導(dǎo)致NASH惡化的重要危險因素[13]。實驗證明細(xì)胞衰老可誘導(dǎo)線粒體功能障礙，破壞脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致脂質(zhì)在肝細(xì)胞中過度堆積，造成脂肪變[14]。同時，線粒體功能障礙也會導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成[15]。過多的ROS會引起肝臟異常炎癥以及NASH的惡化。動物實驗發(fā)現(xiàn)，予以相同飲食的條件下，不同于抗肥胖組，易肥胖組小鼠肝組織脂肪變更嚴(yán)重，同時細(xì)胞衰老相關(guān)基因p16、p21 mRNA水平也明顯高于抗肥胖組小鼠[16]。體外研究證實，抑制肝細(xì)胞中細(xì)胞衰老相關(guān)基因p53的表達(dá)可改善細(xì)胞凋亡和脂肪變[17]。臨床實驗也發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者肝組織中p53的表達(dá)顯著高于正常組[18]。上述實驗均證明肝細(xì)胞衰老會促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪變及炎癥，造成NASH的惡化，也進(jìn)一步為YBTF以CDKN1A為關(guān)鍵靶基因，改善肝細(xì)胞衰老，治療NASH的機(jī)制提供了理論支持。

YBTF是課題組長期用于治療NASH的驗方，臨床療效顯著。但因YBTF多途徑、多靶點治療NASH的特點，YBTF的治療機(jī)制尚不明確，阻礙了YBTF的臨床推廣。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是合適的用于篩選中藥復(fù)方治療疾病的靶點、機(jī)制的工具。本次研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選YBTF治療NASH的作用靶點，通過動物實驗完成驗證，流程完整；明確YBTF通過改善肝細(xì)胞衰老治療NASH的機(jī)制及關(guān)鍵靶基因CDKN1A，篩選結(jié)果精準(zhǔn)。為臨床應(yīng)用YBTF治療NASH提供理論支撐。后續(xù)實驗將進(jìn)一步明確YBTF對CDKN1A上、下游基因的調(diào)控作用，篩選YBTF改善肝細(xì)胞衰老，治療NASH的作用通路，研究肝細(xì)胞脂肪變與細(xì)胞衰老之間的關(guān)聯(lián)。