結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從JAK2/STAT3信號(hào)通路探討麻杏甘石湯抗流感病毒的效應(yīng)機(jī)制

陳純靜，趙 澄，張香港，王 平，肖 榮，胡 玨，盧芳國(guó),2

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

流行性感冒的病原體是流感病毒，據(jù)世界衛(wèi)生組織最新發(fā)布的報(bào)道，每年全球有約10億例流感病例，其中300萬(wàn)～500萬(wàn)為重癥病例，導(dǎo)致29萬(wàn)至65萬(wàn)患者死亡[1]。流感病毒屬正黏病毒科,病毒基因組為節(jié)段性負(fù)單鏈RNA，根據(jù)其抗原性和基因序列的不同，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四型。其中，甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)是引起人及動(dòng)物流感的主要病原體[2]，多次引起世界范圍內(nèi)的大流行，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。研究表明，在流感病毒感染過(guò)程中，JAK/STAT信號(hào)通路被激活，在病毒介導(dǎo)的免疫病理反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[3]。

中醫(yī)藥預(yù)防和治療流感在臨床中發(fā)揮著重要的作用。源自《傷寒論》的麻杏甘石湯，由麻黃、杏仁、甘草、石膏配伍而成，具有辛涼宣泄，清肺平喘之功效。我們的前期研究表明，麻杏甘石湯可抑制病毒增殖，并調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮抗流感病毒感染作用[4]。本研究以流感病毒肺部感染模型小鼠為研究對(duì)象，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討JAK2/STAT3信號(hào)通路在流感病毒誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥中發(fā)揮的作用，以及麻杏甘石湯對(duì)該通路的調(diào)控機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物BLAB/c小鼠100只，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK(湘)2019-0009。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

1.2 病毒株A型流感病毒小鼠肺適應(yīng)株(A型，IAV，A/PR/8/34),由湖南師范大學(xué)病毒研究室惠贈(zèng)。

1.3 藥物麻杏甘石湯組方藥材(麻黃、杏仁、石膏、甘草)購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。磷酸奧司他韋膠囊(規(guī)格：75 mg，以?shī)W司他韋計(jì)×10粒，批號(hào)M1057，意大利Delpharm Milano S.r.l.生產(chǎn)，上海羅氏制藥有限公司分裝)購(gòu)自中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院門(mén)診藥房，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為2.165 g·L-1的混懸液；抗病毒顆粒(規(guī)格：9 g×10袋，批號(hào)：2001089，四川光大制藥有限公司)購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診藥房，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為0.39 kg·L-1的溶液。

1.4 試劑兔抗鼠JAK2抗體(Abcam，ab39636)、STAT3抗體(Abcam，ab109085)；β-actin抗體(Proteintech，0070175)；RNA simple總RNA提取試劑盒(TIANGEN，DP419)、NovoScript cDNA合成試劑盒(Novoprotein，E047-01B)、NovoStartSYBR qPCR Super Mixture(Novoprotein，E096-01A)；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；小鼠IL-1β、IL-4 ELISA試劑盒(Elabscience，E-EL-M0037c，E-EL-M0043c)。

1.5 儀器組織光學(xué)掃描顯微鏡(Axioscope 5)+Axiocam 503 color顯微鏡攝像頭(蔡司科技(蘇州)公司)；ELX-800多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；LightCycler96熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。

2 方法

2.1 麻杏甘石湯治療流感病毒感染的潛在靶點(diǎn)的篩選設(shè)置口服生物利用度(OB)≥30%、類(lèi)藥性(DL)≥0.18，利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索麻黃、苦杏仁、甘草的主要活性化合物，并查詢(xún)篩選主要活性化合物的作用靶點(diǎn)，該數(shù)據(jù)庫(kù)未檢索到的礦物藥“石膏”采用文獻(xiàn)研究方法查閱其主要活性化合物及靶點(diǎn)[5]；以“Influenza A virus”為關(guān)鍵詞，分別通過(guò)GeneCards(https://genecards.weiz-mann.ac.il/v3/)；OMIM(https://omim.org/)；PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)；TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)；DrugBank(https://www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得IAV作用于人體的相關(guān)靶點(diǎn)；通過(guò)R4.0.3軟件將各數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行合并并去除重復(fù)靶點(diǎn)。運(yùn)用R4.0.3軟件對(duì)麻杏甘石湯主要活性成分調(diào)控的靶點(diǎn)與流感病毒的疾病靶點(diǎn)取交集。

2.2 KEGG通路富集分析利用R4.0.3軟件對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2.3 制備麻杏甘石湯水煎液根據(jù)《方劑學(xué)》和《中藥藥理學(xué)》中麻杏甘石湯的藥物組成、劑量、制備方法制備該方水煎液，按其組成比例精確稱(chēng)量麻杏甘石湯1劑的藥材量，加入10倍體積蒸餾水后煮沸，改小火后再煎煮30 min，煎煮完畢后濾過(guò)；二煎加入7倍體積蒸餾水，煮沸后再煎煮2 0 min，煎煮完畢后濾過(guò)，合并2次濾液，水浴濃縮至含生藥605 g·L-1。

2.4 分組與給藥100只BLAB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，隨機(jī)將小鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、奧司他韋組(西藥對(duì)照組)、抗病毒顆粒組(中藥對(duì)照組)和麻杏甘石湯組，每組20只小鼠。除正常對(duì)照組外，其余組建立A型流感病毒肺部感染模型。感染24 h后，各藥物組按臨床等效劑量灌胃給藥，每天1次，每次0.2 mL，連續(xù)給藥3、7 d。奧司他韋、抗病毒顆粒、麻杏甘石湯組的給藥劑量分別為0.0216、3.9、6.05 g·kg-1·d-1。對(duì)照組和模型組均給予等量生理鹽水。

2.5 標(biāo)本采集分別于給藥治療d 3、7，將小鼠禁水禁食8 h后，每組隨機(jī)選取10只小鼠，稱(chēng)動(dòng)物體質(zhì)量后，摘眼球放血法處死小鼠，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行解剖，取出小鼠肺臟，用生理鹽水沖洗臟器表面血跡，用濾紙吸干后稱(chēng)取小鼠肺臟質(zhì)量，取部分肺組織置于4%多聚甲醛中固定，部分肺組織置于1.5 mL EP管中，凍存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

2.6 指標(biāo)檢測(cè)

2.6.1體質(zhì)量及肺指數(shù) 肺指數(shù)(mg·g-1)=肺臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.6.2肺組織病理變化情況 取出固定于4%多聚甲醛中24 h的肺組織，經(jīng)石蠟包埋、切片(5 μm)、二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下(×100)觀(guān)察肺組織病理變化。

2.6.3RT-PCR法檢測(cè)肺組織中JAK2、STAT3、IL-1β、IL-4mRNA的表達(dá)水平 取出-80 ℃保存的肺組織，按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組樣品的總RNA，去DNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA做模板，按NovoStartSYBR qPCR Super Mixture試劑說(shuō)明，分別加入β-actin、JAK2、STAT3、IL-1β、IL-4引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)Tab 1。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)體系含cDNA 2 μL，NovoStartSYBR qPCR Super Mixture 10 μL，10 μmol·L-1上下游引物各2 μL，以dd H2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s繪制熔解曲線(xiàn)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

2.6.4Western blot法檢測(cè)肺組織中JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)水平 取出-80 ℃保存的肺組織，加入適量細(xì)胞裂解液與蛋白酶抑制劑，使用組織研磨器進(jìn)行組織勻漿，冰上靜止30 min后離心，提取上清液中組織總蛋白質(zhì)，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取40 μg總蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，封閉處理1 h，分別加入JAK2一抗(1 ∶1 000)、STAT3一抗(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶10 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，避光顯影。

2.6.5ELISA法檢測(cè)肺組織IL-1β、IL-4分泌水平 取出-80 ℃保存的肺組織，加入一定量PBS及蛋白酶抑制劑，使用組織研磨器進(jìn)行組織勻漿，離心后取上清液，分裝保存，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)肺組織中IL-1β、IL-4分泌水平。

2.7 分子對(duì)接查詢(xún)STAT3所對(duì)應(yīng)的麻杏甘石湯活性化合物為甘草查爾酮A(licochalcone a)，從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)下載其sdf格式化合物，用ChemBio3DUltra 14.0.0.117軟件進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org)下載STAT3的晶體結(jié)構(gòu)，利用PyMOL2.4軟件刪除水分子，添加氫等預(yù)處理，利用AutoDock Tools1.5.6可視化軟件確定STAT3的活性口袋，利用AutoDock Vina1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組樣本間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊時(shí)，用LSD進(jìn)行多重比較，方差不齊采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 麻杏甘石湯治療流感病毒感染的潛在靶點(diǎn)篩選按照OB≥30%、DL≥0.18的條件，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)查閱篩選麻杏甘石湯主要活性化合物，并查詢(xún)主要活性化合物調(diào)控的靶點(diǎn)信息，共篩選出對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)共2 124個(gè)，去除重復(fù)后共234個(gè)。分別在GeneCards、OMIM、DrugBank、PharkGkb、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索流感病毒作用于人體的潛在靶點(diǎn)，去掉重復(fù)得到2 089個(gè)流感病毒相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用R4.0.3軟件將麻杏甘石湯主要活性成分調(diào)控的靶點(diǎn)與流感病毒的疾病靶點(diǎn)取交集，得到110個(gè)共同靶點(diǎn)，即麻杏甘石湯治療流感病毒感染的潛在靶點(diǎn)，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Venn plot of intersection target of Maxing Ganshi Decoction and influenza virus

3.2 潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)110個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)交集靶點(diǎn)共富集于170條信號(hào)通路，主要與病毒或病原微生物感染、各細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有著密切聯(lián)系。根據(jù)P值大小進(jìn)行排名，前三位分別是AGE-RAGE、Hepatitis B、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection信號(hào)通路。根據(jù)富集的靶點(diǎn)數(shù)目排名，最多的為Hepatitis B、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Human cytomegalovirus infection 3條信號(hào)通路，均富集31個(gè)靶點(diǎn)。本研究展示了富集靶點(diǎn)數(shù)目排名前三的信號(hào)通路，見(jiàn)Tab 2。結(jié)合本課題組前期基礎(chǔ)，本研究主要探討JAK/STAT信號(hào)通路在流感病毒感染過(guò)程中發(fā)揮的作用以及麻杏甘石湯調(diào)控作用。根據(jù)P值大小，JAK/STAT信號(hào)通路在170條信號(hào)通路中排名84位，P=0.000 000 470 7，富集13個(gè)靶點(diǎn)，見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Potential targets of MXGSD on JAK/STAT signaling pathway

Fig 3 Pathological observation of lung tissues of mice in each group after 3 (upper)and 7 (lower)days of administration (HE,100 ×)

3.3 體質(zhì)量及肺指數(shù)由Tab 3得知：給藥治療3、7 d后，模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量較正常對(duì)照組降低(P<0.05或0.01)；給藥治療3 d后，奧司他韋組、抗病毒顆粒組、麻杏甘石湯組體質(zhì)量較模型對(duì)照組升高(P<0.05或0.01)；給藥治療7 d后，奧司他韋組體重較模型對(duì)照組升高(P<0.05)，抗病毒顆粒組、麻杏甘石湯組體重較模型組有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由Tab 4得知：給藥治療3、7 d后，模型對(duì)照組小鼠肺指數(shù)較正常對(duì)照組升高(P<0.01)；給藥治療3 d后，奧司他韋組、抗病毒顆粒組、麻杏甘石湯組肺指數(shù)較模型對(duì)照組降低(P<0.05或0.01)；給藥治療7 d后，奧司他韋組、麻杏甘石湯組肺指數(shù)較模型對(duì)照組降低(P<0.05)，抗病毒組肺指數(shù)較模型對(duì)照組有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab 2 Top three signaling pathways in number of KEGG targets

Tab 3 Comparison of body weight and weight inhibition rate in each group n=10)

Tab 4 Comparison of lung index and inhibition rate in each group of mice n=10)

3.4 肺組織病理變化由Fig 3得知，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯病理變化，表現(xiàn)為肺泡充血水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)實(shí)變及壞死。與模型對(duì)照組比較，各藥物組小鼠肺部病理?yè)p傷明顯改善，肺泡輪廓恢復(fù)正常，充血水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

3.5 肺組織中JAK2、STAT3、IL-1β、IL-4 mRNA的表達(dá)水平由Tab 5得知，給藥治療3、7 d后，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組JAK2、STAT3、IL-1β表達(dá)量增加(P<0.01)，IL-4基因相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組相比，給藥治療3 d后，各藥物組JAK2、IL-1β表達(dá)量降低(P<0.01)，IL-4表達(dá)量增加(P<0.01)，抗病毒顆粒組和麻杏甘石湯組STAT3表達(dá)量降低(P<0.01)；給藥治療7 d后，抗病毒顆粒組和麻杏甘石湯組JAK2表達(dá)量降低(P<0.01)，各藥物組STAT3、IL-1β表達(dá)量降低(P<0.01)，IL-4表達(dá)量增加(P<0.01)。

3.6 肺組織中JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)水平由Fig 4、5得知，給藥治療3、7 d后，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組JAK2、STAT3蛋白表達(dá)量增加(P<0.01或P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，各藥物組JAK2蛋白表達(dá)量降低(P<0.01)。給藥治療3 d后，與模型對(duì)照組相比，各藥物組STAT3蛋白表達(dá)量降低(P<0.01)。給藥治療7 d后，與模型對(duì)照組相比，奧司他韋組STAT3蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，其余兩藥物組STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異。

Fig 4 Expression level of JAK2 protein in lung tissues of mice in each group n=3)A.Control；B.Model;C.Oseltamivir;D.Antiviral particle;E.MXGSD.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

Fig 5 Expression level of STAT3 protein in lung tissues of mice in each group n=3)A.Control;B.Model;C.Oseltamivir;D.Antiviral particle;E.MXGSD.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group.

3.7 肺組織IL-1β、IL-4分泌水平由Tab 6得知，給藥治療3、7 d后，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組肺組織勻漿中IL-1β表達(dá)量增加(P<0.01)，IL-4表達(dá)量降低(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，給藥治療3 d后，抗病毒顆粒組和麻杏甘石湯組肺組織勻漿中IL-1β表達(dá)量降低(P<0.01)，給藥治療7 d后，奧司他韋組與抗病毒顆粒組肺組織勻漿中IL-1β表達(dá)量降低(P<0.01)，麻杏甘石湯組也較模型對(duì)照組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型對(duì)照組相比，給藥治療3 d后，奧司他韋組和麻杏甘石湯組肺組織勻漿中IL-4表達(dá)量增加(P<0.01)，給藥治療7 d后，各藥物組肺組織勻漿中IL-4表達(dá)量均增加(P<0.01)。

Tab 5 Relative expression of JAK2,STAT3,IL-1 β and IL-4 genes in lung tissues of mice in each group (2-△△Ct) n=3)

Tab 6 Levels of IL-1β and IL-4 in lung tissues of mice in each group n=3)

3.8 STAT3與麻杏甘石湯活性成分分子對(duì)接結(jié)果根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，化合物和靶標(biāo)之間的結(jié)合自由能<-5 kcal·mol-1被認(rèn)為具有較好的結(jié)合作用。本研究查詢(xún)STAT3所對(duì)應(yīng)的麻杏甘石湯小分子配體為甘草查爾酮A(licochalcone A)，通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)及ChemBio3D Ultra軟件得到甘草查爾酮A的3D結(jié)構(gòu)。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載STAT3的晶體結(jié)構(gòu)，PDB ID為：6njs。利用AutoDock Tools1.5.6可視化軟件確定STAT3的活性口袋，活性口袋網(wǎng)格中心的坐標(biāo)為：x=-2.257，y=19.47，z=24.491。借助AutoDock Vina1.1.2軟件，對(duì)STAT3與甘草查耳酮A(licochalcone A)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，兩者的結(jié)合能為-6.3 kca·mol-1，表明STAT3與藥物有較好的結(jié)合活性，見(jiàn)Fig 6。本研究還對(duì)西藥陽(yáng)性對(duì)照藥物奧司他韋與STAT3進(jìn)行了分子對(duì)接，結(jié)果顯示，兩者之間的最小結(jié)合自由能為-3.9 kcal·mol-1，意味著兩者無(wú)很好的結(jié)合活性。

Fig 6 Schematic diagram of molecular dockingbetween STAT3 and licochalcone A

4 討論

眾所周知，病毒感染初期，機(jī)體固有免疫系統(tǒng)被激活，肺部炎癥細(xì)胞募集，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和趨化因子參與機(jī)體免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗病毒作用。但在流感病毒持續(xù)感染或重癥感染的過(guò)程中，免疫系統(tǒng)持續(xù)激活，導(dǎo)致免疫應(yīng)答反應(yīng)過(guò)度，免疫穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而釋放大量炎癥因子，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，形成“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，出現(xiàn)肺部免疫病理?yè)p傷，引起彌漫性肺泡損傷、透明膜形成、纖維蛋白滲出等?！凹?xì)胞因子風(fēng)暴”導(dǎo)致的急性肺損傷被認(rèn)為是流感病毒感染致死的主要原因[7]。目前，關(guān)于流感病毒感染后發(fā)生“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的機(jī)制尚未完全闡明，有研究發(fā)現(xiàn)，甲型流感病毒感染后，宿主細(xì)胞內(nèi)STAT、NF-κB等多條信號(hào)通路激活，導(dǎo)致IL-1β、IL-6、IL-18等炎癥因子的過(guò)度表達(dá)，且炎癥因子的水平與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示相關(guān)信號(hào)通路的激活及下游效應(yīng)分子的分泌可能在流感“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的發(fā)生中起到一定作用[8]。JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是多種細(xì)胞因子發(fā)揮作用的重要信號(hào)通路之一，參與許多重要生理反應(yīng)過(guò)程，與“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的發(fā)生密切相關(guān)[9]。JAK2作為Janus激酶家族成員之一，廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中，其下游效應(yīng)分子為STAT3，STAT3被JAK2磷酸化后發(fā)生二聚化，然后穿過(guò)核膜進(jìn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。JAK2/STAT3信號(hào)通路在免疫調(diào)節(jié)和多種炎癥過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，JAK2過(guò)表達(dá)可促進(jìn)H5N1流感病毒的復(fù)制，而特異性抑制JAK2表達(dá)后，病毒復(fù)制減輕，JAK2可能成為抗流感病毒治療的潛在靶點(diǎn)[10]。

在流感病毒感染的小鼠肺組織中，JAK2、STAT3基因表達(dá)水平及蛋白表達(dá)量較正常小鼠均增加，說(shuō)明機(jī)體JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活，在流感病毒導(dǎo)致的肺部炎癥中發(fā)揮著一定的作用。在數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選流感病毒的靶點(diǎn)時(shí)，物種為“Homo”即人類(lèi)，我們進(jìn)行動(dòng)物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的對(duì)象為小鼠，通過(guò)NCBI對(duì)人和小鼠的JAK2、STAT3蛋白序列進(jìn)行查找及blast比對(duì)，其一致性分別為93.58%、99.48%(E value=0.0)。同時(shí)，本課題組還檢測(cè)了IL-1β、IL-4兩種炎癥因子，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組肺組織勻漿中IL-1β表達(dá)量增加，而IL-4表達(dá)量降低。IL-1β是感染過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，具有廣泛的促炎活性，能夠活化多種炎癥細(xì)胞,介導(dǎo)炎癥介質(zhì)、趨化因子的釋放[11]。IL-4可抑制TNF-α和IL-6等炎癥因子的表達(dá)，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。本研究結(jié)果提示，JAK2/STAT3信號(hào)通路在流感病毒誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥的發(fā)病機(jī)制中有著重要的作用，其機(jī)制可能是該信號(hào)通路激活后下游細(xì)胞因子的表達(dá)水平發(fā)生變化，免疫穩(wěn)態(tài)失衡，促炎因子增多，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)。在早期干預(yù)該信號(hào)通路的激活，可以有效減輕肺部免疫病理?yè)p傷。

中藥在流感防治中發(fā)揮著重要的作用。麻杏甘石湯組方精當(dāng)，療效顯著，為歷代醫(yī)家所重視。現(xiàn)代研究表明，麻杏甘石湯具有較好的解熱、抗炎、抗病毒等作用，對(duì)甲型H1N1流感有很好的療效[12]。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的2018-2020版《流行性感冒診療方案》中，均將該方作為中醫(yī)熱毒襲肺證的基礎(chǔ)治療方[13]。有研究表明，麻杏甘石湯可減輕哮喘大鼠氣道炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與STAT4及IL-13/STAT6/黏蛋白途徑有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，臨床等效劑量麻杏甘石湯能夠下調(diào)流感病毒感染的小鼠肺組織中JAK2、STAT3基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平，降低肺組織中IL-1β分泌水平，增加IL-4分泌水平，改善肺部炎癥。提示該方可通過(guò)抑制流感病毒誘導(dǎo)的JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)，以抵抗流感病毒感染導(dǎo)致的急性肺損傷。我們查詢(xún)了核心靶點(diǎn)STAT3所對(duì)應(yīng)的麻杏甘石湯活性化合物，結(jié)果顯示，麻杏甘石湯中與STAT3具有結(jié)合作用的活性化合物為甘草查爾酮A。分子對(duì)接結(jié)果表明，二者之間的結(jié)合能為-6.3 kcal·mol-1，具有較好的結(jié)合活性。甘草查爾酮A來(lái)源于甘草，屬于麻杏甘石湯方中佐使藥，既能益氣和中，又能防止石膏寒涼傷中，調(diào)和于寒溫宣降之間。研究發(fā)現(xiàn)，甘草查爾酮A具有明顯的抗炎活性，可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來(lái)抑制骨關(guān)節(jié)炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[15]，我們的研究為闡明甘草查爾酮A的抗炎機(jī)制及豐富其臨床應(yīng)用提供了一定的啟發(fā)。同時(shí)，我們對(duì)西藥陽(yáng)性對(duì)照藥物奧司他韋與STAT3進(jìn)行了分子對(duì)接，兩者之間的最小結(jié)合自由能為-3.9 kcal·mol-1，無(wú)很好的結(jié)合活性。奧司他韋屬于神經(jīng)氨酸酶抑制劑，可通過(guò)抑制流感病毒的復(fù)制及播散，發(fā)揮抗流感效應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，麻杏甘石湯可通過(guò)調(diào)節(jié)宿主相關(guān)信號(hào)通路，緩解流感病毒引起的炎癥因子失衡。這也是對(duì)中醫(yī)藥“整體觀(guān)”的一種體現(xiàn)，整體觀(guān)講究免疫平衡，流感的發(fā)生不僅是“外邪”的入侵，也與機(jī)體本身的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，麻杏甘石湯通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡，維護(hù)免疫穩(wěn)態(tài)，在此過(guò)程中，甘草查爾酮A作為其有效的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)結(jié)合STAT3，發(fā)揮抗炎作用。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，麻杏甘石湯對(duì)JAK2也具有一定的調(diào)節(jié)作用，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果并不完全一致。

綜上所述，本研究初步奠定了JAK2/STAT3信號(hào)通路在流感病毒感染導(dǎo)致的肺部炎癥中的地位，并證實(shí)麻杏甘石湯通過(guò)抑制該信號(hào)通路的激活，減輕肺部炎癥，為中醫(yī)藥防治流感提供了一定的數(shù)據(jù)支持。但本研究尚存在諸多不足，例如在藥物劑量方面，我們目前選取的是臨床等效劑量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該劑量的麻杏甘石湯對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路具有一定的作用，但這種作用是否具有量-效關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究，量-效關(guān)系的研究將有助于指導(dǎo)臨床給藥劑量的優(yōu)化。此外，在進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)基因及蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)時(shí)，選取的樣本數(shù)目較少，后期在進(jìn)行量-效關(guān)系的驗(yàn)證時(shí)，我們將會(huì)進(jìn)一步加大樣本量，以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。