TRPV1/SIRT1介導(dǎo)吳茱萸次堿抗Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞衰老

余艷榮，汪小英，祝思路，王寒霞，彭維杰,4，羅 丹

(1.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，2.南昌大學(xué)藥學(xué)院基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006;3.阜陽(yáng)市人民醫(yī)院藥劑科，安徽阜陽(yáng) 236000；4.贛南醫(yī)學(xué)院，醫(yī)用組織工程材料與于生物制造江西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000)

血管老化是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理改變，表現(xiàn)為血管結(jié)構(gòu)和功能的改變，包括動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度增加，順應(yīng)性降低和血管炎癥表現(xiàn)。血管老化與構(gòu)成血管壁的細(xì)胞衰老有關(guān)，其中衰老的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)出現(xiàn)遷移、表型轉(zhuǎn)變等功能紊亂，并向成骨樣細(xì)胞分化而加速血管鈣化。大量研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)，作為腎素血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，在高血壓、年齡等多種因素誘導(dǎo)的血管老化中起到關(guān)鍵作用。老年人和老齡動(dòng)物的動(dòng)脈血管壁及VSMCs中Ang Ⅱ顯著增高，而Ang Ⅱ長(zhǎng)期刺激可激活衰老通路p53/p21，誘導(dǎo)VSMC出現(xiàn)應(yīng)激性早衰[1]。

SIRT1(sirtuin1)是一種依賴于NAD+的去乙?；?，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)各種代謝活動(dòng)，尤其和細(xì)胞衰老密切相關(guān)，被稱為長(zhǎng)壽蛋白[2]。檢測(cè)不同年齡人體血管發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌中SIRT1水平隨年齡增長(zhǎng)而顯著降低，伴隨血管平滑肌功能的改變，提示年齡相關(guān)的SIRT1水平下降導(dǎo)致VSMC衰老及功能失調(diào)[3]。此外，Ang Ⅱ引起的高血壓小鼠血管壁SIRT1水平下降，發(fā)生動(dòng)脈斑塊區(qū)域的SIRT1表達(dá)也較對(duì)應(yīng)正常區(qū)域下降[4]。而用藥物或基因手段上調(diào)SIRT1水平則可明顯抑制Ang Ⅱ、高糖和動(dòng)脈粥樣硬化等因素誘導(dǎo)的VSMC衰老和功能紊亂[5]。因而，SIRT1被認(rèn)為是抑制VSMC衰老和血管老化的熱門靶點(diǎn)。

吳茱萸次堿(rutaecarpine，Rut)是中藥吳茱萸中的主要活性物質(zhì)，具有顯著的心血管保護(hù)效應(yīng)，其舒血管和降壓作用已被廣泛研究[6]。我們和其他學(xué)者的前期研究表明，Rut可顯著抑制Ang Ⅱ引起的VSMC增殖和表型轉(zhuǎn)換，并減輕高血壓導(dǎo)致的血管重構(gòu)[7]。Zhou等[8]報(bào)道，在高血壓動(dòng)物模型中，Rut可降低其內(nèi)皮祖細(xì)胞的衰老，且抑制Ang Ⅱ引起的內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老，表明Rut具有潛在的抗細(xì)胞衰老作用。大量證據(jù)表明，Rut的主要心血管效應(yīng)均與激活瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1 (transient receptor potential vanillic acid subtype 1，TRPV1)有關(guān)，后者廣泛存在于心血管系統(tǒng)，VSMC也能表達(dá)TRPV1。在Ox-LDL引起的VSMC源性泡沫細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，TRPV1激動(dòng)劑辣椒素可上調(diào)SIRT1的水平，提示TRPV1參與調(diào)節(jié)SIRT1表達(dá)[9]。因而本研究進(jìn)一步在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的VSMC衰老模型中，探討Rut的保護(hù)作用，并研究其信號(hào)通路是否與TRPV1/SIRT1途徑有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑Rut(上海君拓生物技術(shù)有限公司)，Ang Ⅱ、TRPV1抑制劑CAPZ(Sigma,USA)，AMPK抑制劑Compound C(Selleck,USA)，β-半乳糖苷酶和活性氧檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物有限公司)，SIRT1抗體，p-AMPK抗體和AMPK抗體(Cell Signaling,USA)，p21抗體(ABclonal)，p53抗體(Proteintech)和山羊抗兔/小鼠IgG二抗(武漢BOSTER)；BCA蛋白定量試劑盒，Transwell 小室(3422)(Costor,USA)

1.2 儀器電泳儀和自動(dòng)曝光儀(BIO-RAD，USA)，熒光顯微鏡(Olympus,日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組取出大鼠胸主動(dòng)脈，組織塊貼壁法原代培養(yǎng)VSMCs，傳代后取第3～8代用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下：① Control組：正常對(duì)照組；② Ang Ⅱ誘導(dǎo)衰老組：加入終濃度為1 μmol·L-1Ang Ⅱ孵育VSMCs 72 h；③-⑤不同劑量的Rut保護(hù)組：加入的終濃度分別為0.3、1和3 μmol·L-1的Rut孵育VSMCs 10 min后，加入Ang Ⅱ繼續(xù)孵育72 h；⑥ +CAPZ+Rut組：TRPV1受體阻斷劑CAPZ(10 μmol·L-1)預(yù)處理細(xì)胞10 min后，再加入3 μmol·L-1Rut孵育10 min，最后加入Ang Ⅱ繼續(xù)孵育72 h。⑦ +Compound C+Rut組：在加入Rut和Ang Ⅱ前，預(yù)先加入AMPK阻斷劑1 μmol · L-1Compound C孵育VSMC 10 min。

1.4 β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法測(cè)定衰老細(xì)胞數(shù)目細(xì)胞衰老時(shí)會(huì)生成大量的β-半乳糖苷酶，該酶作用于底物X-Gal后，細(xì)胞會(huì)生成一種藍(lán)色物質(zhì)。VSMC用Ang Ⅱ 誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d后，去上清，各孔分別加入1 mL染色固定液15 min。吸棄染色固定液，用PBS洗3次。加入染色工作液封口膜密封，避光37 ℃烘箱過夜。顯微鏡下觀察拍照，ImageJ軟件算出衰老藍(lán)染的細(xì)胞數(shù)。

1.5 熒光探針法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平熒光探針DCFH-DA自身無(wú)熒光，但可自由穿過細(xì)胞膜后轉(zhuǎn)化為DCFH，后者可被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化，生成發(fā)綠色熒光的DCF，從而間接計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)的ROS含量。細(xì)胞處理結(jié)束后，去上清，PBS洗2次。加入1 ∶1 000的DCFH-DA探針，用錫箔紙包裹6孔板，37 ℃避光孵育。0.5 h后用無(wú)菌的PBS洗2次，加入1 mL DMEM，鏡下進(jìn)行觀察拍照，ImageJ算出熒光量。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移細(xì)胞以2×105/孔的密度種于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至100%后，用滅菌的Tips頭進(jìn)行劃線，洗掉被破壞的細(xì)胞，再加入serum-free的培養(yǎng)基和對(duì)應(yīng)藥物，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、12、24 h)觀察同部位劃痕愈合情況。用ImageJ計(jì)算細(xì)胞的平均劃痕寬度，以反映細(xì)胞遷移狀況。細(xì)胞遷移率/%=(0 h劃痕寬度-24 h后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs消化后，含1%血清的培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108L-1，在小室(8 μm)的每孔上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入400 μL 含有1%血清的培養(yǎng)液；將加有細(xì)胞的小室放置于孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄上室的培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min；然后加入1%結(jié)晶紫染色液，37 ℃染色30 min；PBS洗滌2～3次，在顯微鏡下拍照。每組細(xì)胞均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每孔隨機(jī)取 6個(gè)視野進(jìn)行拍照。

1.8 Western blot檢測(cè)VSMCs中SIRT1、p53、p21及p-AMPK蛋白表達(dá)細(xì)胞裂解提蛋白，BCA法蛋白定量。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、8%的脫脂牛奶封閉2 h，結(jié)合一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。洗膜，結(jié)合二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育2 h。洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光于曝光儀下檢測(cè)。使用ImageJ軟件分析條帶灰度，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目的條帶的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸次堿對(duì)Ang Ⅱ 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞衰老和ROS生成的影響SA-β-Gal染色顯示(Fig 1A和C)，1 μmol·L-1Ang Ⅱ處理細(xì)胞72 h可明顯增加衰老陽(yáng)性染色(藍(lán)染)細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)，不同劑量的Rut能劑量依賴性地降低衰老染色細(xì)胞數(shù)量，其中3 μmol·L-1Rut的效果最為明顯(P<0.01)，CAPZ可消除Rut這一作用(P<0.01)。ROS結(jié)果表明(Fig 1B和D)，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ顯著性地升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，不同劑量的Rut呈劑量依賴性地減少ROS產(chǎn)生，且提前加入CAPZ可消除Rut這一作用(P<0.01)。

2.2 吳茱萸次堿對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響Transwell結(jié)果顯示，與Con組相比，1 μmol·L-1Ang Ⅱ可明顯增加遷移到小室對(duì)側(cè)的VSMC細(xì)胞數(shù)目(P<0.01)，Rut可劑量依賴性抑制Ang Ⅱ引起的VSMCs遷移(P<0.01)，預(yù)先加入CAPZ可消除Rut的作用(P<0.01)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，劃痕24 h后Ang Ⅱ組細(xì)胞的劃痕距離明顯減小(P<0.01)，而加入不同劑量的Rut后細(xì)胞劃痕距離依次增寬，CAPZ可消除Rut的效應(yīng)(P<0.01)，見Fig 2。

2.3 Rut對(duì)VSMC中長(zhǎng)壽蛋白SIRT1及下游衰老通路p53/p21的影響Western blot結(jié)果表示，1 μmol·L-1Ang Ⅱ孵育VSMCs 72 h可顯著降低SIRT1的表達(dá)，同時(shí)使p53和p21的表達(dá)升高(P<0.01)。不同劑量的Rut呈劑量依賴性恢復(fù)SIRT1的表達(dá)，并抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的p53和p21表達(dá)上調(diào)，高劑量Rut(3 μmol·L-1)效果最明顯(P<0.01)。提前加入CAPZ可消除或削弱Rut對(duì)這些蛋白的調(diào)節(jié)效應(yīng)，見Fig 3。

Fig 1 Rut inhibited premature senescence of VSMCs and ROS production induced by Ang n=6)**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;++P<0.01 vs Ang Ⅱ+ Rut (3 μmol·L-1)group.

2.4 TRPV1/AMPK通路介導(dǎo)吳茱萸次堿上調(diào)SIRT1表達(dá)的作用如Fig 4A和B所示，提前給予Compound C(AMPK抑制劑)能消除3 μmol·L-1Rut上調(diào)SIRT1的作用(P<0.01)。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)(Fig 4C和D)，與對(duì)照組相比，Ang Ⅱ可明顯減少p-AMPK水平(P<0.01)，Rut劑量依賴性地恢復(fù)p-AMPK的水平，提前加入CAPZ可部分消除Rut的這一作用(P<0.01)。

Fig 2 Effects of Rut on migration of VSMCs induced by Ang n=6)**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;++P<0.01 vs Ang Ⅱ+Rut(3 μmol·L-1)group.

Fig 3 Rut regulated expression of SIRT1,p53 and p21 in VSMCs treated by Ang Ⅱ via activation of **P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;+P<0.05,++P<0.01 vs Ang Ⅱ+Rut (3 μmol·L-1)group.

Fig 4 Involvement of TRPV1/AMPK pathway in regulation effects of Rut on SIRT1 n=6)**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Ang Ⅱ group;++P<0.01 vs Ang Ⅱ +Rut (3 μmol·L-1)group.

3 討論

我國(guó)傳統(tǒng)中藥吳茱萸在臨床用于治療心血管疾病已有近百年歷史，其主要成分Rut不僅能舒張血管產(chǎn)生降壓效應(yīng)[10]，還可抑制VSMC增殖和表型轉(zhuǎn)換，從而抑制血管重構(gòu)。近年來(lái)VSMC衰老在高血壓等疾病相關(guān)的血管老化中的作用日益收到重視，本研究進(jìn)一步在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VSMC衰老模型觀察Rut的保護(hù)作用。SA-β-Gal染色是檢測(cè)細(xì)胞衰老的有效方法，衰老的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)會(huì)生成大量藍(lán)色物質(zhì)。結(jié)果顯示，加入1 μmol·L-1Ang Ⅱ到VSMC72 d可顯著增加藍(lán)染的衰老細(xì)胞數(shù)量，而預(yù)先給予吳茱萸次堿則可明顯減少衰老細(xì)胞。細(xì)胞衰老往往伴隨氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，而產(chǎn)生過多的ROS又可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生衰老。本研究采用DCFH-DA熒光探針法檢測(cè)ROS水平發(fā)現(xiàn)，Rut在抑制Ang Ⅱ引起的VSMC 衰老同時(shí)還明顯抑制ROS生成。Rut的這一抗氧化效應(yīng)在心肌細(xì)胞和單核細(xì)胞也有報(bào)道[11-12]。隨年齡增長(zhǎng)，VSMC的遷移能力也隨之增強(qiáng)，從中膜遷移至內(nèi)膜而導(dǎo)致血管壁重構(gòu)，而Ang Ⅱ是促進(jìn)這種衰老相關(guān)VSMC遷移的重要因素。本研究通過劃痕愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Rut還可明顯抑制Ang Ⅱ引起的VSMC遷移。這些結(jié)果表明，Rut可顯著抑制Ang Ⅱ引起的VSMC衰老和相關(guān)功能改變。

大量證據(jù)表明，SIRT1參與調(diào)節(jié)VSMC功能，被認(rèn)為是藥物抑制VSMC衰老的重要靶點(diǎn)。在Ang Ⅱ引起的高血壓小鼠發(fā)現(xiàn)，SIRT1水平降低，而VSMC高表達(dá)SIRT1可降低血壓，減輕由Ang Ⅱ引起的血管重構(gòu)，抑制ROS生成和血管炎癥。二甲雙胍、白藜蘆醇等SIRT1激活劑則可抑制Ang Ⅱ、高糖和動(dòng)脈粥樣硬化等因素誘導(dǎo)的VSMC衰老和功能紊亂[13]。文獻(xiàn)報(bào)道SIRT1的抗衰老機(jī)制與抑制p53/p21有關(guān)[1]。SIRT1使p53乙?；瘡亩种破滢D(zhuǎn)錄活性。p53是一種重要的衰老調(diào)節(jié)因子，能激活其下游基因p21，促進(jìn)細(xì)胞衰老。p21是細(xì)胞周期依賴性激酶的廣譜阻滯劑，能抑制細(xì)胞周期依賴性激酶(CDKs)，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期和G2/M期。它被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的標(biāo)志。此外，有證據(jù)表明SIRT1水平改變還可影響VSMC的遷移。Ox-LDL引起的VSMC源性的泡沫細(xì)胞遷移，與SIRT1水平降低有關(guān)，過表達(dá)SIRT1則可顯著抑制VSMC的遷移和侵入[14]，而白藜蘆醇和辣椒素等藥物可通過上調(diào)SIRT1水平可抑制VSMC遷移[15]。本研究結(jié)果表明，Ang Ⅱ可抑制SIRT1的表達(dá)，升高p53和p21的表達(dá)，不同劑量的Rut可劑量依賴性地恢復(fù)SIRT1的表達(dá)，同時(shí)抑制其下游p53和p21的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果提示，Rut抗VSMC衰老和遷移作用與上調(diào)長(zhǎng)壽蛋白SIRT1表達(dá)有關(guān)。

許多證據(jù)表明，Rut是TRPV1的激動(dòng)劑[16]，Rut的降壓和抑制血管重構(gòu)效應(yīng)均與激活TRPV1有關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予TRPV1選擇性抑制劑CAPZ可取消Rut上調(diào)SIRT1表達(dá)及抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VSMC衰老效應(yīng)，表明TRPV1介導(dǎo)了Rut上調(diào)SIRT1的抗衰老作用。在Ox-LDL引起的VSMC源性泡沫細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞中，TRPV1激動(dòng)劑辣椒素能上調(diào)SIRT1的表達(dá)[14]，提示TRPV1可能是調(diào)節(jié)SIRT1的重要靶點(diǎn)，但具體機(jī)制尚未闡明。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是維持細(xì)胞能量平衡的關(guān)鍵分子，是SIRT1的上游分子而調(diào)節(jié)其活性。運(yùn)動(dòng)、能量限制、及AMPK激活劑白藜蘆醇等可均通過激活A(yù)MPK升高SIRT1的表達(dá)[17]。有研究報(bào)道，TRPV1引起的一些作用與AMPK途徑有關(guān)[18]，如TRPV1的激動(dòng)劑辣椒素引發(fā)的VSMC自噬和脂肪細(xì)胞的褐化效應(yīng)，與促進(jìn)p-AMPK相關(guān)[9]。激活TRPV1后可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣生成，細(xì)胞內(nèi)鈣通過CaMKII途徑激活A(yù)MPK。本研究發(fā)現(xiàn)，AMPK抑制劑Compound C可消除Rut上調(diào)SIRT1表達(dá)的作用。進(jìn)一步檢測(cè)AMPK的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ可抑制p-AMPK，提前加入Rut能恢復(fù)p-AMPK水平，這一作用可被CAPZ部分取消。結(jié)果提示，Rut通過激活TRPV1促進(jìn)p-AMPK，從而上調(diào)SIRT1表達(dá)。

綜上所述，吳茱萸次堿可使SIRT1表達(dá)上調(diào)，抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VSMCs衰老和遷移，其機(jī)制涉及激活TRPV1/AMPK信號(hào)途徑。