LncRNAs在過敏性疾病中的研究進展

王曉鈺，肖 潔，薛 玲

(山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

過敏性疾病是指機體接觸過敏原后，免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂的一系列疾病。該疾病特征為免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介導的2型免疫過強，伴隨輔助性T細胞(helper T cell,Th)-1/Th2失衡，2型細胞因子，如白介素(interleukin，IL)-4、IL-5及IL-13等分泌增加。像過敏性鼻炎、過敏性哮喘、食物過敏以及特應性皮炎等均屬于這類疾病。全球有超過30%的人口受過敏性疾病的影響，并且近年來發(fā)病率不斷上升。過敏性疾病顯著降低了患者的生活質量，其反復發(fā)作的特點使患者壓力增大、抑郁、甚至可能危及生命，從而造成重大的社會經濟負擔[1]。過敏性疾病的發(fā)病機制涉及環(huán)境、免疫和基因等多種因素，目前研究主要集中于Th1和Th2失衡以及屏障功能受損，因此明確過敏性疾病的發(fā)病機理，尋求安全有效的藥物以及治療靶點迫在眉睫。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)參與諸多疾病發(fā)生和發(fā)展，可調控許多生物學過程[2]。尤其在免疫調節(jié)方面的作用越來越受到關注。在先天性或適應性免疫反應中，lncRNAs參與多種細胞的調控，像單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞均存在lncRNA的差異表達[3]。lncRNAs是免疫應答的重要調節(jié)因子，過敏性疾病的發(fā)生、發(fā)展及復發(fā)與lncRNAs密切相關，但lncRNAs在過敏性疾病中的具體作用機制尚不清楚，對其進行深入研究具有重要意義。本文將圍繞幾種常見的過敏性疾病，對lncRNAs在過敏性疾病中的研究進展進行總結。

1 lncRNA的生物學功能和基因表達的調控

絕大多數(shù)的lncRNA的轉錄和加工方式與典型的蛋白質編碼mRNA類似[4]，lncRNA經RNA聚合酶II轉錄后，再拼接，即可多聚腺苷化。但與mRNA不同的是，lncRNA富集組蛋白H3K9三甲基(H3K9me3)啟動子，并且lncRNA包含較少的低效剪接的外顯子[5]。

雖然lncRNAs缺乏開放閱讀框而不能直接編碼蛋白質，但由于lncRNAs能夠結合蛋白質、DNA和其他RNA，因此其分類和功能是多種多樣的。lncRNA又分為5類：反義lncRNA、增強子lncRNA、基因間lncRNA、雙向lncRNA和內含子lncRNA。有些lncRNA位于細胞核內，可以作為染色質修飾酶或轉錄因子的引導或支架，以順式或反式方式調控鄰近基因或整個基因組的基因表達；lncRNA能夠調控轉錄過程，其作用主要通過調控轉錄反應酶、轉錄激活分子等來發(fā)揮；lncRNA還參與了轉錄后調控、mRNA加工、剪接和轉運以及翻譯過程；lncRNA作為內源性非編碼小RNA(microRNA，miRNA)海綿，能夠競爭性結合miRNA進而調控mRNA表達，這種基于lncRNA-miRNA-mRNA的內源競爭RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)網絡調控模式在不同疾病中扮演著重要角色[6]。此外，有些lncRNA作為蛋白質的誘餌，能夠阻礙其功能或加工。例如，lncRNAs可以影響正常的蛋白(去)磷酸化。

2 lncRNA在過敏性哮喘中的作用

過敏性哮喘是一種常見的肺部疾病，患者常表現(xiàn)出氣道炎癥反應、氣道高反應性以及氣道重塑等特征。過敏性哮喘發(fā)病率的持續(xù)增加，已在全球范圍內造成了巨大的經濟負擔，嚴重影響著人們的生活質量。表觀遺傳機制在這些細胞的調節(jié)中有突出的作用，其中l(wèi)ncRNAs參與過敏性哮喘的發(fā)病進程，并作為關鍵分子介導多個信號通路，進而調控氣道炎癥和氣道重塑。

氣道重塑是過敏性哮喘發(fā)病過程中非常重要的環(huán)節(jié)，與氣道中多種結構和功能細胞密切相關，包括成纖維細胞活化、上皮細胞增強和氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)增殖。Austin等[7]對重癥哮喘患者ASMCs中差異表達的lncRNA進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)其中l(wèi)ncRNA-plasmacytoma variant translocation(PVT1)在糖皮質激素不敏感的重度哮喘患者中過表達。進一步研究顯示，沉默lncRNA-PVT1可抑制IL-6基因和蛋白水平的表達。并且PVT1在調節(jié)重癥哮喘患者ASMCs增殖方面具有很大潛力，結果提示lncRNA-PVT1可能作為ASMCs表型的預測分子。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-transcription factor 7(TCF7)通過靶向線粒體內膜結構域轉位酶1(translocase of inner mitochondrial membrane domain containing 1，TIMMDC1)促進人ASMCs的生長和遷移，從而激活蛋白激酶B信號，為哮喘治療提供了新的可能靶點[8]。

LncRNA參與調控Th1和Th2 的平衡。Zhu等[9]對嗜酸性哮喘患者的外周血進行RNA測序，發(fā)現(xiàn)了差異表達的lncRNA。進一步研究顯示，lncRNA-000127在嗜酸性哮喘患者CD4+T細胞中特異性高表達，并通過調控GATA結合蛋白3通路進而促進Th2炎癥，提示lncRNA-000127可作為嗜酸性哮喘的生物標志物，靶向lncRNA-000127可能是治療嗜酸性哮喘Th2炎癥的有效手段。另有研究報道，哮喘患者血液中l(wèi)ncRNA-metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1(MALAT1)表達上調，miR-155表達下調，MALAT1通過海綿作用機制結合抑制CD4+T細胞中miR-155的表達，進而調控Th1/Th2的失衡[10]。

已有報道顯示，Th17/調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)的失衡是參與哮喘發(fā)病的重要機制，像IL-17A、IL-17F、IL-22這些Th17型細胞因子的上調，以及Treg型細胞因子[如IL-10和轉化生長因子(TGF)-β]的下調能夠介導的中性粒細胞募集和氣道炎癥惡化。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA對調節(jié)Th17/Treg的失調有重要作用。體內干擾及過表達實驗結果顯示lncRNA-maternally expressed 3(MEG3)可以上調Th17相關的促炎細胞因子(IL-17、IL-22)和維甲酸相關孤核受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)[11]，其機制為lncRNA-MEG3與miR-17結合，競爭性抑制miR-17與RORγt的結合來阻止RORγt mRNA的降解。提示lncRNA-MEG3/miR-17/RORγt軸可影響哮喘患者Th17/Treg平衡，該研究將為臨床治療提供有力依據(jù)。

另外，有研究者檢測了哮喘患者惡化期、緩解期以及健康志愿者血漿中細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(INK4)位點lncRNA反義非編碼RNA(lncRNA-ANRIL)的表達。結果顯示與緩解期組或對照組相比，哮喘惡化期患者lncRNA-ANRIL表達顯著性升高，并且可以負調控miR-125a，結果提示ANRIL/miR-125a軸在哮喘的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，lncRNA-ANRIL可能成為診斷哮喘惡化和氣道炎癥程度的重要指標[12]。另外，最新研究顯示[13]，lncRNA-nuclear paraspeckle assembly transcript 1(NEAT1)能夠與miR-124的相互作用，增加哮喘加重風險和嚴重程度，并和炎癥因子如腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1β和 IL-17增加呈正相關。結果說明lncRNA-NEAT1可能作為哮喘風險評估以及嚴重程度的新靶標。還有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠沉默lncRNA-AK085865，可通過調節(jié)巨噬細胞極化，抑制M2巨噬細胞進而減少2型先天淋巴細胞(group 2 innate lymphoid cells，ILC2)的數(shù)量，最終抑制哮喘炎癥[14]。除此之外，細胞因子IL-4、IgE等的表達也與lncRNA-brain cytoplasmic RNA 1(BCYRN1)有著明顯的正相關，哮喘患者的病情與lncRNA-BCYRN1的表達水平有著密切的相關性。

由此可見，lncRNAs能夠調控氣道重塑、Th1/Th2平衡以及Th17/Treg平衡等過程，進而影響過敏微環(huán)境，在過敏性哮喘的發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)中發(fā)揮關鍵作用(Tab 1)。并且lncRNAs在過敏性哮喘中的作用機制多集中于和特異性miRNA的結合，從而調控miRNA的靶基因表達水平，這是很多l(xiāng)ncRNAs基于ceRNA調控網絡的共同機制。但其差異在于不同的lncRNAs可能通過調控一個或多個miRNA從而改變靶基因的表達水平，最終影響不同的下游途徑，如ILC2細胞、Th2細胞以及Th17細胞等細胞因子的分泌。這對lncRNAs作用靶點的探尋，以及深入的具體機制探索具有提示意義，這些特異性的lncRNA還可以作為對病情風險預測、評估、預后和監(jiān)測的一項重要指標。

3 lncRNA在過敏性鼻炎中的作用

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是指在變應原刺激下，在鼻黏膜中誘導的炎癥反應。該炎癥反應過程包括IgE介導的肥大細胞脫顆粒，進而募集嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞，進一步促進Th2細胞因子的分泌，如IL-4和IL-5，進一步促進了IgE的合成和嗜酸性粒細胞的增多。AR主要特征為鼻塞、瘙癢、鼻漏以及陣發(fā)性噴嚏，氣流阻塞等，該疾病影響著世界上大約30%的群眾，一般發(fā)生于兒童時期，是兒童最常見的慢性過敏性疾病。lncRNAs在調控Th2反應中的作用研究提示其可能在AR的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

有研究者對AR患者鼻黏膜中的lncRNA進行基因芯片檢測分析，發(fā)現(xiàn)其中有1 033個lncRNAs在鼻黏膜組織中高表達，有1 226個lncRNAs低表達。對lncRNA-mRNA共表達進行分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達的lncRNAs在AR發(fā)育相關的細胞信號通路中富集，例如能夠促進IL-13產生，正向調控免疫球蛋白受體FcεR-1和核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路[15]。另外，對AR患者外周血進行基因芯片分析[16]，發(fā)現(xiàn)有31個lncRNA存在差異表達，通過qRT-PCR驗證，ENST00000445003.1、ENST00000456563.1 和ENST00000609268.1 在AR患者中顯著高于對照組。GO、Pathway和Disease分析表明，這3個lncRNA與炎癥、免疫反應和過敏性疾病方面富集的mRNA：色氨酰tRNA合成酶、調亡相關酪氨酸激酶、葡萄糖苷酶等密切相關。轉錄因子預測結果提示有機陽離子轉運蛋白、轉錄激活因子AP-1及NF-κB在lncRNAs介導的AR發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用。

有研究報道，lncRNA-ANRIL的表達水平與TNF-α、2型細胞因子IL-4和IL-13呈正相關，與IL-10和IFN-γ水平呈負相關[17]，且lncRNA-ANRIL的表達與AR的患病風險、嚴重程度以及炎癥指標的增加呈正相關，提示其可作為AR的診斷指標。還有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷組蛋白去乙?；?HDAC)活性可能成為AR的一種新治療靶點，因為丁酸鈉能夠抑制HDAC，進而使lncRNA-NONMMUT057309表達下調，最終改變免疫球蛋白的表達。提示丁酸鈉可能通過調控lncRNA-NONMMUT057309的表達影響鼻黏膜的過敏反應[18]。研究者在AR患者的鼻組織和IL-13刺激的鼻上皮細胞中發(fā)現(xiàn)lncRNA-00632表達下調。并且lncRNA-00632能夠抑制IL-13誘導粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，嗜酸性粒細胞趨化因子和粘蛋白的產生，其作用機制是lncRNA-00632靶向miR-498進而調控下游炎癥信號[19]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-Forkhead box D3反義RNA1(lncRNA-FOXD3-AS1)在AR患者鼻黏膜中表達下調，抑制細胞中IL-25的分泌，從而減輕AR中Th2型免疫反應[20]。還有研究表明[21]，lncRNA-NEAT1及其靶點miR-21和miR-125a與AR患病風險、嚴重程度和炎癥密切相關。

這些研究顯示了不同的lncRNA在AR中的重要作用(Tab 1)，值得注意的是，lncRNA-ANRIL和lncRNA-NEAT1不僅在AR中過表達，在過敏性哮喘中也表達升高，雖然最終炎癥因子均表現(xiàn)出升高，但其作用機制不同，同一個lncRNA在不同的疾病中可能通過調控不同的靶點miRNA發(fā)揮作用。目前關于lncRNA在AR中的研究主要集中于臨床樣本，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)不論是在鼻黏膜組織，還是在患者的外周血中，均存在lncRNAs的差異表達，這些差異表達明顯的lncRNAs通過調控炎癥因子發(fā)揮作用，其有可能成為AR評估的生物標志物或新靶點。但對于lncRNAs的機制研究尚不深入，仍需大量的動物實驗以及細胞實驗加以證明。

Tab 1 Expression and function of lncRNAs in allergic diseases

4 lncRNA在過敏性皮炎中的作用

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)以Th2細胞介導的異常炎癥反應和血清IgE和嗜酸性粒細胞升高為特征，并伴隨皮膚濕疹性皮膚破損和劇烈的瘙癢，AD患者更容易誘發(fā)其他過敏性疾病，很多患者在兒童時期患有AD，成年后對過敏原敏感性增加，其中有30%～60%患者伴隨過敏性鼻炎和哮喘[22]。因此AD的發(fā)病機制以及診療策略的研究不容忽視。

目前，關于非編碼RNA在AD中的研究，miRNA相對較多，其中l(wèi)ncRNA作為較新的領域，在AD中的作用研究較少，作者前期建立了異硫氰酸熒光素誘導的AD動物模型，利用基因芯片檢測了該模型中l(wèi)ncRNA的表達。在AD復發(fā)后，發(fā)現(xiàn)5 766個lncRNA調控異常。且有419個lncRNA在炎癥消退的緩解期仍然差異表達。進一步驗證發(fā)現(xiàn)lncRNA0016+，uc008thl.1，uc029qxr.1和AK077345表達顯著性上調。uc029ycn.1、ENSMUST00000164311和ENSMUST00000149791表達顯著性下調。并對這幾個具有顯著性差異的lncRNAs進行靶基因的預測分析以及ceRNA分析[23]。這些lncRNAs可能是調節(jié)小鼠特應性皮炎復發(fā)的潛在新靶點(Tab 1)，其具體作用機制值得深入研究。

5 lncRNA是潛在治療靶點

LncRNA在疾病中發(fā)揮著關鍵的作用，提示靶向干預特異性的lncRNA可能是治療疾病的有效手段。lncRNA具有高組織特異性以及對細胞網絡特定面的調節(jié)特點，以及其毒性作用弱等優(yōu)勢。并且lncRNA缺乏翻譯過程，周轉快，較低的劑量即可發(fā)揮快速的效果。因此lncRNA作為潛在的干預靶點在臨床上備受關注。

目前，靶向lncRNA的治療方法主要基于反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)的使用。ASOs本質上是單鏈的DNA寡核苷酸，根據(jù)序列同源性和RNA的可能性，能夠較快完成設計。并且ASO適用于靶向保留在細胞核中的lncRNA，這是因為ASO通過Watson-Crick堿基配對與目標RNA結合，并能在結合位點誘導核糖核酸酶H(RNase-H)介導的共轉錄裂解，導致過早轉錄終止，從而降低lncRNA水平。ASOs在細胞中有很高的療效，但在臨床使用中仍有一定局限性，主要是因為其在體內的毒性以及缺乏合適的傳遞系統(tǒng)，阻礙了足夠劑量的治療性ASOs對組織的靶向作用。為改善其藥理活性，學者們對ASOs進行了一定的化學修飾，如GapmeR ASOs、RNA-DNA-RNA單鏈寡核苷酸鏈。這些修飾可增強與靶RNA的雜交親和性，從而增加對核酸酶降解的抵抗力，并減少了非特異性免疫刺激活性。目前一些靶向mRNA的ASOs已經被FDA和歐洲藥物管理局批準或進入臨床試驗，一些靶向致癌lncRNA的ASOs也在開發(fā)中[24]。

另外，也有一些研究使用小分子靶向lncRNA，進而發(fā)揮作用。但想要獲得具有高親和力和特異性結合lncRNAs的分子，需要識別結構復雜的相關RNA序列[25]。且lncRNA經常折疊成幾個模塊結構域，其可能參與不同的分子相互作用，因此此方法存在一定局限性。針對lncRNAs在疾病中的治療和應用，有研究發(fā)現(xiàn)可以通過阻斷l(xiāng)ncRNA和蛋白質之間的相互作用從而達到治療作用。還可通過采用模仿lncRNA結構和結合特性的合成分子競爭性與蛋白結合，從而干擾其功能。

除此之外，外泌體作為納米微泡，可將核酸、蛋白質運送到受體細胞。結合外泌體沒有腫瘤形成的風險，并且可以通過過濾消毒，很容易在體內循環(huán)并到達損傷部位且長期重復給藥外泌體不會引起毒性等優(yōu)點。利用外泌體攜帶特異性的lncRNA類似物/抑制劑或可與lncRNA結合的分子，進行過敏性疾病的靶向治療可能是一種安全有效的手段，其具體作用和開發(fā)值得深入研究。

6 小結

在過去的幾十年里，由于環(huán)境變化和表觀遺傳修飾等原因，過敏性疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)驚人的增長趨勢。目前臨床上常用的治療方式有糖皮質激素、抗組胺藥、免疫抑制劑等，其主要在于控制癥狀，不僅對過敏性疾病的反復發(fā)作束手無策且其副作用較大。尤其對于很多中度或重度患者，以及對糖皮質激素不敏感患者，目前臨床上缺乏較好的診療方案。因此對于過敏性疾病的防治研究一直是研究者關注的問題。雖然近年來對過敏原引起的免疫反應方面取得了一定進展，像一些生物制劑的開發(fā)使用，如靶向IL-4和IL-13信號的Dupilumab以及靶向胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)的Tezepelumab，均顯現(xiàn)出治療優(yōu)勢，但仍需多次給藥來發(fā)揮療效，且其安全性需要通過長期隨訪研究進一步證實。因此尋找新的替代治療方式和干預措施，為患者選擇最合適的藥物十分重要。

中醫(yī)藥在過敏性疾病的治療中存在明顯優(yōu)勢，不僅副作用小，且對很多過敏性疾病的復發(fā)有抑制作用，像中藥玉屏風散、防風通圣散等均表現(xiàn)出能夠改善過敏微環(huán)境的特點?；谥兴帉Ψ蔷幋aRNA的調控，揭示中藥的有效物質基礎，明確特異性靶點，對中藥的作用機制的明確具有重要意義。因此靶向非編碼RNA，包括miRNA或lncRNA是一種新的治療途徑，在臨床上具有優(yōu)勢特征。因此評估特定lncRNA在過敏性疾病調控中的作用，以及l(fā)ncRNA的靶基因及其參與調控的ceRNA網絡，將有助于識別過敏性疾病的生物標志物，并為lncRNA在過敏性疾病中機制的明確以及臨床新藥的開發(fā)和利用提供依據(jù)。