斷根與打頂對番茄嫁接愈合的抑制作用

崔青青，孟憲敏，段韞丹，莊團(tuán)結(jié)，董春娟，高麗紅，尚慶茂?

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京 100081；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/設(shè)施蔬菜生長發(fā)育調(diào)控北京市重點實驗室，北京 100193

0 引言

【研究意義】嫁接能夠增強(qiáng)植株對生物和非生物脅迫抗性、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)，普遍應(yīng)用于番茄生產(chǎn)實踐[1-2]。近年來，番茄雙斷根嫁接和雙頭嫁接因具有便于機(jī)械化操作、嫁接苗產(chǎn)量高、長勢整齊等優(yōu)勢而日益廣泛應(yīng)用于設(shè)施番茄栽培中[3-4]，雖然嫁接相關(guān)研究日漸深入[5-6]，但關(guān)于斷根與打頂對番茄嫁接愈合的作用機(jī)制卻知之甚少。嫁接成功的重要標(biāo)志是接穗和砧木維管束連通[7-8]。木質(zhì)部從根部向地上組織運(yùn)輸和儲存水分、營養(yǎng)物質(zhì)和激素，韌皮部將光合作用的產(chǎn)物以及蛋白質(zhì)、mRNA和生長素、細(xì)胞分裂素等激素從源組織（進(jìn)行光合作用的葉片和幼芽）分配到庫組織[9]。嫁接切削則阻隔了木質(zhì)部和韌皮部在地上部和地下部間的物質(zhì)運(yùn)輸，造成嫁接接合部物質(zhì)積累[10]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】擬南芥莖切割后1—3 d，伴隨生長素的積累，基因ANAC071（Arabidopsis NAC domain containing protein 71）在切口上方表達(dá)上調(diào)；在切口下方，較低的生長素促使RAP2.6L（RELATED TO AP2.6 L）表達(dá)上調(diào)，并且RAP2.6L或ANAC071功能缺失都會干擾組織愈合[11]。進(jìn)一步研究表明，生長素由ARF6和ARF8介導(dǎo)促進(jìn)ANAC071表達(dá)而抑制 RAP2.6L表達(dá)[12]。接穗中形成的生長素可經(jīng)質(zhì)外體運(yùn)輸穿過嫁接接合部，接合部下方通過生長素受體（TIR/AFBs）和AXR1（auxin-resistant 1）對生長素做出響應(yīng)，同時激活 Aux/IAA-ARF，并可能與IAA18和生長素響應(yīng)蛋白ALF4（Aberrant lateral root formation 4）一起參與韌皮部的重連[13]。細(xì)胞分裂素促進(jìn)形成層的分裂和增殖，并對其發(fā)育具有重要的調(diào)控作用[14]。通過細(xì)胞分裂素響應(yīng)啟動子 ARR5（Arabidopsis response regulator 5）和 TCS（two component signaling sensor）驗證其在嫁接中的作用，發(fā)現(xiàn)嫁接會激活維管形成層和中柱鞘處細(xì)胞分裂素的響應(yīng)，然后由嫁接接合部下方起始并隨之傳遞至接穗[13]。有研究結(jié)果顯示生長素和細(xì)胞分裂素通過相互作用來調(diào)節(jié)維管發(fā)育模式[15-17]，并同時調(diào)控嫁接接合部維管束的再生，是嫁接接合部愈合的限制因素[18]。前期研究也表明生長素和細(xì)胞分裂素分別在嫁接接合部上方和下方響應(yīng)，并促進(jìn)番茄嫁接苗木質(zhì)部和韌皮部的形成[19-20]。LU 等[18]利用試管苗離體莖段自體嫁接系統(tǒng)，通過向培養(yǎng)基中施加IAA和ZT研究其對維管組織分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源IAA和ZT是砧穗維管束橋分化的必要條件。將葡萄砧木和接穗的切削面浸蘸于NAA（1-naphthaleneacetic acid）、IBA（Indole-3-butryic acid）、BA（Benzyladenine）、Ki（Kinetin）溶液后進(jìn)行嫁接，發(fā)現(xiàn)Ki和BA刺激接穗和砧木之間愈傷組織的快速增殖，而NAA和IBA則促進(jìn)嫁接插條基部的根形成[21]。在仙人掌微嫁接過程中外源施用IBA以觀察生長素能否促進(jìn)嫁接愈合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)IBA濃度為100 mg·L-1時有利于維管組織分化和嫁接愈合[22]。在擬南芥砧木根系中施用IAA促進(jìn)砧穗維管束重新連接，而NPA（N-1-naphthylphthalamic acid）則起到抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)PIN（PINFORMED 1）家族基因的表達(dá)會調(diào)控生長素的流動進(jìn)而影響嫁接接合部的發(fā)育[23]。將山核桃接穗和砧木浸蘸 IAA和NPA溶液，發(fā)現(xiàn)接穗和砧木外源施用生長素提高了山核桃的嫁接成功率，而生長素抑制劑NPA則會抑制嫁接愈合[24]?！颈狙芯壳腥朦c】幼嫩的芽、葉及發(fā)育中的種子是生長素合成的主要部位。細(xì)胞分裂素合成的主要部位是根尖，普遍存在于旺盛生長的、正在進(jìn)行分裂的組織或器官。雙斷根嫁接中斷根以及雙頭嫁接中打頂可能會影響嫁接接合部積累的生長素和細(xì)胞分裂素含量進(jìn)而影響嫁接愈合進(jìn)程?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗以番茄為材料，研究接穗斷根和打頂對嫁接愈合進(jìn)程的影響，進(jìn)而探索生長素和細(xì)胞分裂素對番茄嫁接愈合的調(diào)控，以期為番茄嫁接生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于 2020—2021年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。

1.1 試驗材料

番茄接穗品種‘硬粉8號’，砧木品種‘砧愛1號’。挑選適量、飽滿度均一的番茄種子，室溫下浸種6 h，5% NaClO水溶液種子表面消毒15 min，沖淋4—5遍，28/23℃催芽3 d。選取出芽整齊一致的種子，播于填裝有混合基質(zhì)（草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1（v/v））的72孔穴盤，播種深度1.5 cm，覆蓋蛭石，每盤灌水約 0.7 L，放置在玻璃溫室自然溫光環(huán)境培養(yǎng)。幼苗子葉平展時，灌溉1/2 Hoagland營養(yǎng)液，第一片真葉展開后灌溉Hoagland全營養(yǎng)液，灌溉方式為底部灌溉。

1.2 試驗設(shè)計

4種嫁接處理：（1）接穗與砧木正常嫁接（對照）；（2）嫁接時接穗打頂，砧木正常；（3）嫁接時接穗正常，砧木斷根；（4）嫁接時接穗打頂且砧木斷根。

待幼苗長至上胚軸直徑2.0 mm左右時，采用套管嫁接方式進(jìn)行嫁接，嫁接前剔除幼苗中帶病幼苗及弱苗，將生長健壯、株高一致的幼苗集中在一起，并在嫁接前1 d澆足水（每穴盤1 L）。嫁接時在番茄幼苗上胚軸部位以45°角切割，然后將接穗與砧木在切口處相互貼合，并用套管固定，對于斷根和打頂處理在用套管固定后馬上進(jìn)行砧木斷根或接穗打頂操作。

為了證實生長素和細(xì)胞分裂素對嫁接愈合的影響，在打頂和斷根的基礎(chǔ)上外源施加一定濃度的IAA和6-BA。打頂后在嫁接切口上下表面分別涂抹1 μL的10和100 mmol·L-1IAA，以及在葉面噴施10 mmol·L-1IAA；斷根后嫁接切口上下表面分別涂抹1 μL 1和10 mmol·L-16-BA，以及將下胚軸于 0.1 mmol·L-16-BA 中浸蘸30 min。

嫁接后立即將幼苗移入人工氣候箱，晝溫26℃（10 h），夜溫20℃（14 h）。嫁接后光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1，空氣相對濕度第 1—3 天保持 90%，第 4、5、6和7天空氣相對濕度分別為80%、75%、70%、65%。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 愈合進(jìn)程的組織切片觀察 嫁接后 144 h取樣，取嫁接苗接合處5 mm長莖段，進(jìn)行FAA固定液（福爾馬林、70%乙醇、冰醋酸混合液）固定，梯度乙醇脫水，乙醇和二甲苯混合液透明，石蠟包埋，切片厚度10 μm，5%明膠粘片，脫蠟、復(fù)水、番紅-固綠染色、阿拉伯樹膠封片，顯微鏡（奧林巴斯 BX53）觀測并拍照。每處理3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 成活率及萎蔫率測定 嫁接14 d后統(tǒng)計成活率，成活率=（嫁接成活的株數(shù)/嫁接總株數(shù)）×100%。嫁接后6、7和8 d統(tǒng)計嫁接苗置于60%濕度下12 h的萎蔫情況，萎蔫率=（萎蔫的株數(shù)/嫁接總株數(shù)）×100%。

1.3.3 品紅法測定木質(zhì)部連通性 嫁接后72 h取樣，在嫁接接合部下方3 cm處莖基部橫切斷后插入1%品紅溶液，吸收40 min后（光照100%，濕度60%，溫度28℃），在嫁接接合部對莖進(jìn)行縱切，并在嫁接接合部上方 2 cm對莖進(jìn)行橫切，于體式鏡（奧林巴斯BX53）下觀察染色情況。

參照趙淵淵等[25]的方法并做相應(yīng)修改。嫁接后120 h，取同一處理幼苗，用刀片橫切莖基部，垂直放置于盛有10 mL 1%酸性品紅水溶液的50 mL燒杯內(nèi)，4 h后剪取嫁接接合部上方幼苗并稱重，放入研缽加入5 mL蒸餾水研磨成勻漿，12 000 r/min離心6 min，取上清液再次離心 3 min，使用分光光度計測定二次離心后的上清液吸光度值A(chǔ)545，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取品紅含量。

品紅含量（mg·g-1）=C×V/W

式中，C：標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的品紅含量（mg），V：研磨所用蒸餾水體積（mL），W：所取樣品質(zhì)量（g）。

1.3.4 激素含量測定 嫁接后12和72 h取切口處1 cm（切口上、下各5 mm）莖段用于生長素和細(xì)胞分裂素含量測定。測定方法為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）。標(biāo)準(zhǔn)品（BioBioPha/Sigma-Aldrich）用乙腈（Merck）或甲醇（Merck）作為溶劑溶解后，-20℃保存，質(zhì)譜分析前用乙腈稀釋成不同梯度濃度。所用試劑都為色譜純。

激素定量是利用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）分析完成。利用軟件Analyst 1.6.1處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。每個色譜峰的峰面積（peak area）代表對應(yīng)激素的相對含量。將檢測到的所有樣本激素的積分峰面積比值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計算，進(jìn)一步代入計算公式計算后，最 終得到實際樣本中激素的絕對含量數(shù)據(jù)。

樣本中激素的含量（ng·g-1）=B×C/1000/D

式中，B：樣本中激素積分峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度值（ng·mL-1），C：復(fù)溶時所用溶液的體積（μL），D：稱取的樣本質(zhì)量（g）。

1.3.5 RNA提取與Real-time PCR分析 對于處理植株，在嫁接后1、3、12、24、48和72 h，采集嫁接接合部即切口處上方（接穗）和下方（砧木）5 mm 莖段。采用 RNAprep pure Plant Kit（天根，北京）提取莖段總 RNA。使用 TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（全式金，中國）合成第一鏈 cDNA。Real-time PCR使用試劑盒TransStart Top Green qPCR SuperMix（全式金），儀器為LightCycler? 96實時熒光定量PCR儀（Roche，瑞典）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果采用 3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。利用軟件 SAS 9.1.3（SAS Inc.，Cary，NC）的ANOVA程序進(jìn)行方差分析，運(yùn)用最小顯著差異法進(jìn)行差異顯著性比較分析（P＜0.05）。

表1 Real-time PCR所用引物Table 1 Primer sequences for the Real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 嫁接愈合進(jìn)程

如圖1所示，在嫁接后14 d，去除頂梢（P和PC）后，第一葉和第二葉腋芽處均產(chǎn)生新的生長點，但斷根使PC處理腋芽長勢相對較慢。同時，嫁接后14 d，斷根的兩處理（C和PC）在下胚軸基部均已形成較多不定根。對嫁接后幼苗干、鮮重測定發(fā)現(xiàn)，打頂和斷根使地上部干、鮮重在嫁接后7和14 d顯著降低，在嫁接后14 d斷根處理的根系干、鮮重與對照已無顯著差異，但打頂斷根處理的根系干、鮮重仍顯著低于對照（圖2）。如表2所示，各嫁接處理間成活率無顯著差異，但從幼苗萎蔫情況來看斷根后嫁接苗愈合較慢，基本在嫁接后8 d愈合；而打頂和對照在嫁接后6 d萎蔫率就較低，即在嫁接后6—7 d愈合。通過石蠟切片觀察嫁接 144 h接合部的愈合情況，發(fā)現(xiàn)對照（CK）砧穗間粘連緊密，而打頂和斷根處理的砧穗之間存在一定的間隙，并且接合部的木質(zhì)部導(dǎo)管沒有完全連通（圖3）。圖4也表明，嫁接后72和120 h打頂和斷根抑制了品紅由砧木到接穗運(yùn)輸，即抑制了木質(zhì)部的連通性，但處理C與PC之間差異不顯著。上述結(jié)果表明，番茄嫁接時打頂和斷根均不利于番茄嫁接愈合。

表2 斷根和打頂對番茄嫁接苗成活率和萎蔫率的影響Table 2 Effects of root-cutting and top-pinching on survival rate and wilting rate of tomato grafting seedlings

圖1 斷根和打頂后嫁接苗形態(tài)觀察Fig.1 Morphological observation of grafting seedlings after root-cutting and top-pinching

圖2 斷根和打頂對番茄嫁接苗干、鮮重的影響Fig.2 Effects of root-cutting and top-pinching on dry and fresh weight of tomato grafting seedlings

圖3 斷根和打頂后番茄嫁接愈合進(jìn)程Fig.3 Healing process of tomato grafting after root-cutting and top-pinching

在打頂和斷根的基礎(chǔ)上外源施加一定濃度的IAA和6-BA，均能在一定程度上促進(jìn)嫁接愈合。如圖4-B所示，打頂后在嫁接接合部涂抹 10 mmol·L-1IAA 顯著提高了嫁接苗木質(zhì)部輸導(dǎo)能力，斷根后在嫁接接合部涂抹 10 mmol·L-16-BA 同樣顯著提高了嫁接苗木質(zhì)部輸導(dǎo)能力。這些結(jié)果進(jìn)一步證實了生長素和細(xì)胞分裂素在嫁接愈合中的作用。

圖4 外源施用IAA、6-BA對番茄斷根和打頂嫁接后木質(zhì)部重構(gòu)的改善作用Fig.4 Improved effects of exogenous application of IAA and 6-BA on xylem remodeling in tomato grafting after root-cutting and top-pinching

2.2 嫁接接合部生長素和細(xì)胞分裂素含量

斷根和打頂均會影響嫁接接合部生長素和細(xì)胞分裂素含量變化。由圖5所示，在嫁接后12 h，斷根顯著降低了嫁接接合部吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-乙酸甲酯（ME-IAA）和吲哚-3-甲醛（ICAld）含量；打頂使嫁接接合部IAA和ME-IAA含量顯著低于對照和斷根處理；斷根打頂同樣使嫁接接合部 IAA和ME-IAA含量顯著低于斷根處理，但與打頂處理差異不顯著。這說明斷根和打頂均會減少嫁接接合部生長素的積累，但相比于斷根，打頂?shù)挠绊懶Ч@著。隨著嫁接愈合，在嫁接后 72 h，PC處理的 ME-IAA含量顯著低于對照，各處理IAA和ICAld含量則與對照差異不顯著。不同的是，在嫁接后12 h，打頂或斷根并沒有引起L-色氨酸（TRP）含量顯著變化，但C和PC處理顯著提高了TRP在嫁接后72 h的含量，說明斷根使嫁接后72 h接合部的生長素合成增多。

圖5 斷根和打頂后嫁接接合部生長素含量的變化Fig.5 Changes of auxin content in graft union after root-cutting and top-pinching

斷根和打頂對嫁接接合部細(xì)胞分裂素的影響不同于生長素。由圖6所示，嫁接后12 h，打頂沒有引起嫁接接合部細(xì)胞分裂素含量顯著變化，但斷根以及同時斷根和打頂都顯著降低了玉米素核苷（tZR）、反 式玉米素（tZ）和異戊烯腺嘌呤核苷（IPR）的含量。各處理反式-玉米素-9-Β-葡萄糖苷（tZOG）含量與對照相比在嫁接后12 h無顯著差異。嫁接后72 h，打頂提高了tZR、tZ、雙氫玉米素-7-糖苷（DHZ7G）、IPR、tZOG的含量；但斷根以及同時斷根和打頂都使tZR、tZ、DHZ7G和tZOG含量顯著降低。以上結(jié)果表明，斷根會降低嫁接接合部細(xì)胞分裂素含量，而打頂不會引起嫁接接合部細(xì)胞分裂素含量降低。

圖6 斷根和打頂后嫁接接合部細(xì)胞分裂素含量的變化Fig.6 Changes of cytokinin content in graft union after root-cutting and top-pinching

隨著嫁接愈合，生長素響應(yīng)基因SlIAA1表達(dá)量呈降低趨勢，生長素運(yùn)輸基因SlPIN1表達(dá)量隨嫁接愈合先升高后降低，兩者在嫁接接合部上方表達(dá)量均高于下方（圖7）。從嫁接后3 h開始，打頂使嫁接接合部上方SlIAA1和SlPIN1表達(dá)量顯著降低，嫁接接合部下方變化與上方基本一致。C和PC處理嫁接接合部上方SlIAA1和SlPIN1表達(dá)量從嫁接后1 h開始顯著低于對照，但C處理的兩基因表達(dá)量在嫁接后12 h顯著高于對照。隨著嫁接愈合，在接合部上方各處理細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因SlHP1表達(dá)量逐漸升高，但斷根使其表達(dá)量升高較慢；在嫁接后12、24和48 h，斷根與打頂斷根處理顯著降低了接合部上方細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因SlHP1的表達(dá)量；斷根或打頂嫁接后3 h顯著下調(diào)了接合部下方SlHP1的表達(dá)量。無論在嫁接接合部上方還是下方，斷根顯著下調(diào)了細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因SlRR8的表達(dá)，而打頂卻使嫁接后12—72 h SlRR8表達(dá)量顯著上調(diào)。上述結(jié)果進(jìn)一步證實打頂和斷根會影響嫁接接合部生長素和細(xì)胞分裂素的積累，進(jìn)而影響相關(guān)基因的表達(dá)。

圖7 斷根和打頂后嫁接接合部生長素和細(xì)胞分裂素應(yīng)答基因的表達(dá)Fig.7 Expression of auxin and cytokinin response genes in graft union after root-cutting and top-pinching

2.3 愈合相關(guān)基因表達(dá)

Histone H4和SlcycB1-4為細(xì)胞分裂相關(guān)基因，如圖8所示，嫁接后3—48 h，打頂或斷根均使嫁接接 合部上方兩者的相對表達(dá)量降低。在嫁接接合部下方，斷根顯著降低了嫁接后1和3 h兩基因的表達(dá)水平，打頂也降低了嫁接后3和12 h的兩基因表達(dá)量，而從嫁接后12 h斷根處理的兩基因表達(dá)量均高于對照。在嫁接接合部上方，嫁接后3 h，打頂或斷根使形成層細(xì)胞增殖基因PXY的表達(dá)水平顯著提高，但嫁接后12、24和72 h斷根顯著降低了PXY的表達(dá)水平，去除接穗生長點，則顯著降低了PXY在嫁接后24和48 h的表達(dá)水平，斷根打頂處理PXY表達(dá)水平在嫁接后24、48和72 h顯著下調(diào)。在嫁接接合部下方，打頂顯著降低了PXY在嫁接后3、12和24 h的相對表達(dá)量，同時斷根和打頂則使嫁接后12、24和48 h的PXY相對表達(dá)量顯著降低，斷根處理則與對照基本無顯著差異。木質(zhì)部分化相關(guān)基因VND7在嫁接接合部上方和下方趨勢一致，表達(dá)水平均隨嫁接愈合先升高后降低。從嫁接后 1 h開始，打頂顯著降低了嫁接接合部上方VND7的相對表達(dá)量，斷根及同時斷根和打頂則使其表達(dá)水平在嫁接后12和24 h顯著降低，而在嫁接后48 h顯著升高。在嫁接接合部下方，打頂或斷根使嫁接后3和12 h的表達(dá)水平顯著低于對照。對于韌皮部分化相關(guān)基因NEN4，無論在嫁接接合部上方或下方，嫁接后3和12 h打頂均降低了其表達(dá)水平，而到嫁接后48和72 h斷根則使其表達(dá)水平顯著升高。以上結(jié)果表明打頂和斷根會不同程度的使嫁接初期愈合相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響嫁接接合部形成層的形成和細(xì)胞分裂，以及木質(zhì)部、韌皮部分化。

圖8 斷根和打頂后嫁接愈合相關(guān)基因的表達(dá)Fig.8 Expression of genes related to grafting healing after root-cutting and top-pinching

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，接穗頂梢和砧木根系在番茄嫁接愈合中起著重要作用，斷根和打頂均不利于番茄嫁接愈合。但由于打頂雙干或多干嫁接苗接穗會長成兩條或多條主干，同時番茄雙斷根嫁接可促進(jìn)根系發(fā)育、提高壯苗指數(shù)和再生根根系活力[26]，顯著提高產(chǎn)量[27]，因此，斷根嫁接苗和打頂雙干嫁接苗日益廣泛地用于番茄栽培。

3.1 斷根和打頂對嫁接接合部生長素的影響

IAA是多數(shù)植物中生長素存在的主要形式。嫁接后12 h，打頂使嫁接接合部IAA和ME-IAA含量顯著低于對照和斷根處理，但TRP含量在各處理間差異不顯著。通常IAA由TRP經(jīng)過兩步反應(yīng)生成[28]。打頂以及同時斷根和打頂都使嫁接接合部IAA和ME-IAA含量顯著低于對照和斷根處理，這說明打頂使運(yùn)輸?shù)郊藿咏雍喜康纳L素減少，從而使嫁接接合部積累的生長素含量顯著降低，而不是由于嫁接接合部生長素合成減少引起。嫁接后72 h，斷根以及同時打頂和斷根處理顯著提高了TRP含量，這可能是因為斷根與打頂斷根處理愈合較慢，嫁接后期需要合成較多生長素。與對生長素含量的影響相一致，從嫁接后3 h，打頂使嫁接接合部上方SlIAA1和SlPIN1表達(dá)量顯著降低，且打頂造成的降低程度明顯高于斷根，說明打頂對嫁接接合部生長素響應(yīng)及運(yùn)輸?shù)挠绊懘笥跀喔Ｍ瑫r打頂后生長素含量顯著低于斷根，這也說明嫁接接合部生長素含量降低受打頂影響更大。由于嫁接切削阻斷了生長素運(yùn)輸，嫁接接合部下方生長素逐漸消耗而減少，因此，嫁接接合部上方SlIAA1和SlPIN1表達(dá)量均高于下方。擬南芥嫁接后，生長素響應(yīng)基因 IAA1在嫁接接合部上方表達(dá)水平高于下方，嫁接后24 h，接合部上方和下方的表達(dá)水平相近；隨嫁接愈合，PIN1在嫁接接合部上方的表達(dá)水平也高于下方[29]，這與本研究結(jié)果一致。

3.2 斷根和打頂對嫁接接合部細(xì)胞分裂素的影響

嫁接后12 h，嫁接接合部tZ、tZR和IPR的含量在斷根以及同時打頂和斷根后顯著降低，但打頂沒有引起嫁接接合部細(xì)胞分裂素含量顯著變化。嫁接后72 h，斷根以及同時打頂和斷根都使 tZR、tZ、DHZ7G和tZOG含量顯著降低。細(xì)胞分裂素合成的主要部位是根尖，因此相對于打頂，斷根對嫁接接合部細(xì)胞分裂素含量影響較大。iP（異戊烯基腺嘌呤）、tZ、cZ和DZ（二氫玉米素）4種類異戊二烯細(xì)胞分裂素中的iP和tZ相對活躍，其衍生物種類在植物中最豐富，而且對細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶敏感[30]。各處理tZOG、DHZ7G和cZR含量與對照相比在嫁接后12 h無顯著差異，可能與這幾種細(xì)胞分裂素活性較弱有關(guān)。與細(xì)胞分裂素的變化一致，斷根下調(diào)了細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因 SlHP1和 SlRR8的表達(dá)水平。但打頂卻使嫁接后12—72 h的SlRR8表達(dá)量顯著上調(diào)，這與打頂上調(diào)了嫁接后12和72 h接合部tZR、tZ和IPR的含量一致，推測是由于高濃度生長素促進(jìn)細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子AHP6的轉(zhuǎn)錄[15]，而打頂使嫁接接合部生長素含量降低，因此打頂后反而促進(jìn)細(xì)胞分裂素的響應(yīng)。生長素在嫁接后72 h基本無差異，但細(xì)胞分裂素還有差異，這可能是因為打頂后，還保留兩片真葉，并且腋芽開始萌發(fā)成為新的生長點并開始產(chǎn)生生長素。

3.3 斷根和打頂對嫁接愈合的影響

研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)部形成標(biāo)志基因VND7和BFN1在擬南芥嫁接早期接合部上方被激活[29]，本研究也發(fā)現(xiàn)VND7表達(dá)水平隨著嫁接愈合先升高后降低，且嫁接接合部上方表達(dá)量高于下方。本研究中，打頂和斷根顯著降低了VND7、Histone H4和SlcycB1的表達(dá)水平，也在一定程度上降低了NEN4和PXY的表達(dá)量。說明打頂和斷根引起嫁接愈合基因表達(dá)下調(diào)進(jìn)而影響嫁接愈合。前人研究表明生長素可以通過RAP2.6L和ANAC071調(diào)控組織愈合[11]。嫁接會激活維管形成層和中柱鞘處細(xì)胞分裂素的響應(yīng)[13]，細(xì)胞分裂素促進(jìn)形成層的分裂和增殖，并對其發(fā)育具有重要的調(diào)控作用[14]。這進(jìn)一步表明打頂和斷根對嫁接愈合的影響與嫁接接合部生長素及細(xì)胞分裂素的積累量減少密不可分。

本研究中斷根和打頂抑制了木質(zhì)部重構(gòu)，延緩了番茄嫁接愈合進(jìn)程；但斷根和打頂后分別在嫁接接合部施用 10 mmol·L-16-BA 和 10 mmol·L-1IAA均顯著提高了嫁接苗木質(zhì)部輸導(dǎo)能力。以往的研究也發(fā)現(xiàn)砧木和接穗的切削面浸蘸Ki和BA可以刺激接穗和砧木之間愈傷組織的快速增殖，而NAA和IBA則促進(jìn)嫁接插條基部的根形成[21]。擬南芥[23]和山核桃[24]嫁接時外源施用 IAA促進(jìn)了砧穗維管束的重新連接，提高嫁接成功率。筆者課題組之前外源施加一定濃度的IAA和6-BA促進(jìn)了番茄嫁接愈合過程中木質(zhì)部和韌皮部重連[19]。因此，生產(chǎn)番茄斷根嫁接苗和打頂雙干或多干嫁接苗時施用外源激素可在一定程度上促進(jìn)嫁接愈合。

4 結(jié)論

斷根和打頂抑制番茄嫁接愈合。斷根降低了嫁接接合部細(xì)胞分裂素和生長素的含量，打頂則主要降低了嫁接接合部生長素含量；二者下調(diào)了細(xì)胞分裂相關(guān)基因、維管束分化相關(guān)基因的表達(dá)，抑制了愈傷組織形成和木質(zhì)部重構(gòu)。外源施用生長素或細(xì)胞分裂素可促進(jìn)斷根和打頂后嫁接接合部木質(zhì)部重構(gòu)。