健脾通里中藥芪黃煎劑對(duì)胃切除大鼠腸黏膜生物屏障損傷的影響

周富海，于慶生，沈 毅，張 琦，劉舉達(dá)，王 振，經(jīng)文善

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外一科，安徽 合肥 230031；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)外科研究所，安徽 合肥 230031)

腸道是人體內(nèi)最大的貯菌場所和內(nèi)毒素庫。正常情況下，細(xì)菌與內(nèi)毒素比例協(xié)調(diào)、功能正常，腸道發(fā)揮其生物屏障作用。當(dāng)機(jī)體遭受手術(shù)、感染、創(chuàng)傷后，腸腔內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素發(fā)生移位，引起膿毒血癥和腸源性全身性感染，觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征，影響疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。

因此，臨床上為了防治細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，除了保護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障和免疫屏障，目前還有研究[1]通過調(diào)節(jié)腸腔內(nèi)或者附著于腸壁上的微生物，維持腸道微生態(tài)平衡，發(fā)揮其對(duì)腸黏膜生物屏障的修復(fù)作用，抑制細(xì)菌和內(nèi)毒素移位。而中醫(yī)中藥對(duì)腸黏膜生物屏障的修復(fù)也起到重要作用[2]。課題組前期研究[3-4]表明，芪黃煎劑對(duì)大鼠胃切除后腸黏膜免疫屏障和機(jī)械屏障具有調(diào)節(jié)作用，但芪黃煎劑調(diào)節(jié)兩種屏障的機(jī)制之間是否存在聯(lián)系，尚不清楚。

本研究采用胃切除法復(fù)制大鼠腸黏膜上皮損傷模型，探討健脾通里中藥芪黃煎劑保護(hù)腸黏膜生物屏障的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD大鼠，共90只，體質(zhì)量300～330 g，7周齡。購自安徽省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2020-001]。

1.2 藥物 按照既往研究方法[5]，芪黃煎劑(由黃芪、黨參、白術(shù)、大黃、厚樸、枳實(shí)、黃芩、丹參組成，質(zhì)量比為20∶20∶10∶10∶10∶12∶15∶15，總質(zhì)量234 g)：飲片均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑中心提供，經(jīng)過煎煮、過濾、濃縮，制成1.0 g/mL的生藥煎劑，放入4 ℃冰箱內(nèi)保存，給藥前復(fù)溫至30 ℃。腸內(nèi)營養(yǎng)制劑能全素(整蛋白型粉劑)：荷蘭紐迪希亞出口有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為H20200172。

1.3 主要試劑與儀器 TPY瓊脂培養(yǎng)基(HB0397)、伊紅美藍(lán)瓊脂平板(HBPM007)、腸球菌瓊脂(HB0133)、乳酸桿菌選擇性瓊脂(HB0392)：均購于青島海博生物；BCA蛋白定量檢測試劑盒(P0009)：上海碧云天生物科技公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(G8200)：杭州科研云生物；Trizol試劑：上海翊圣生物科技公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(SA00001-2)：武漢三鷹生物科技公司；RT-PCR引物：由美國Invitrogen公司合成；熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(12K Flex)：美國ABI Quant StudioTM；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、胃切除模型復(fù)制及給藥方法 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成空白對(duì)照組，假手術(shù)組，腸內(nèi)營養(yǎng)組，芪黃煎劑低、中、高劑量組，每組15只。參照既往動(dòng)物模型復(fù)制方法[5]，采用10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)腹部正中切口，行胃體部大小彎之間的前壁部分切除。同時(shí)，在距Treitz韌帶15 cm處空腸前壁，用針頭戳孔，將直徑1.0 mm硅膠導(dǎo)管置入空腸內(nèi)，進(jìn)行雙層荷包縫合固定，導(dǎo)管尾端經(jīng)腹壁戳口通過皮下隧道潛行由頸背部雙側(cè)肩胛區(qū)皮膚引出，外套彈簧保護(hù)裝置固定，用作手術(shù)后腸內(nèi)滴注中藥和營養(yǎng)液。假手術(shù)組僅行腹部正中切口，不進(jìn)行胃切除術(shù)，手術(shù)后自由飲水進(jìn)食，不給予腸內(nèi)營養(yǎng)和中藥。腸內(nèi)營養(yǎng)組僅給予能全素腸內(nèi)營養(yǎng)，即手術(shù)當(dāng)天禁食、禁水，術(shù)后第1天開始給藥，通過硅膠管用10 mL注射器通過微量注射泵緩慢、勻速、持續(xù)注入小腸內(nèi)。每日能全素腸內(nèi)營養(yǎng)量為4.3 mL[(120 kJ/kg×0.3 kg)/8.3 kJ/mL]。每只大鼠按300 g計(jì)算。每日滴注2次，速度控制為2 mL/h，連續(xù)應(yīng)用1周。滴注完成后以2 mL生理鹽水封管，防止硅膠管堵塞。芪黃煎劑低、中、高劑量組每日通過微量注射泵分別按照5、10、15 g/kg劑量單純滴注中藥芪黃煎劑，滴注方法、療程均與腸內(nèi)營養(yǎng)組相同。

2.2 標(biāo)本制作與指標(biāo)檢測方法 對(duì)所有大鼠干預(yù)1周后，用10%水合氯醛麻醉取材，嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。

2.2.1 大鼠體內(nèi)內(nèi)毒素濃度檢測 從腸系膜根部找出門靜脈，用4-0絲線結(jié)扎門靜脈近心端，待門靜脈充盈后用1 mL無菌注射器自門靜脈采集0.3 mL血液，用于血清中內(nèi)毒素濃度檢測。分別留取盲腸內(nèi)容物，稱質(zhì)量后加入滅菌注射用水混勻并離心，上清液以滅菌注射用水連續(xù)10倍稀釋后，用于檢測腸道內(nèi)毒素濃度。剪取大鼠小腸系膜淋巴結(jié)，研碎，加稀釋液2 mL勻漿，取勻漿液100 μL用于腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)毒素濃度檢測。

2.2.2 大鼠腸道菌群變化檢測 結(jié)扎盲腸制備無氧環(huán)境，用注射器抽取1 mL盲腸內(nèi)容物，加0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行10倍稀釋，在振蕩器上震碎、混勻，此為10-1比例，之后依次配成10-2、10-4、10-6、10-8稀釋倍數(shù)，編號(hào)依次為2、4、6、8管，在此4管內(nèi)各取0.01 mL菌液接種在4種培養(yǎng)基上。TPY瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)雙歧桿菌，伊紅美藍(lán)瓊脂平板培養(yǎng)大腸桿菌，腸球菌瓊脂培養(yǎng)腸球菌，乳酸桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)乳酸桿菌。將乳酸桿菌和雙歧桿菌置于厭氧罐，并于37 ℃孵箱培養(yǎng)72 h，將腸球菌和腸桿菌置于37 ℃孵箱培養(yǎng)48 h。

2.2.3 大鼠腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)的變化 參照課題組前期研究方法[6-7]，取距回盲部2 cm以上的小腸組織約3 cm，固定后，標(biāo)本采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色法染色，石蠟切片，光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜上皮形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。取空腸標(biāo)本時(shí)注意避免人為損傷。用Chiu氏6級(jí)評(píng)分法[8]評(píng)價(jià)腸黏膜損傷程度。

2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測小腸組織中緊密連接蛋白(zonula occluding-1，ZO-1)、封閉蛋白(claudin)、咬合蛋白(occludin)的mRNA表達(dá)水平 取上述準(zhǔn)備好的標(biāo)本100 mg，液氮中研成粉末，收集入Eppendorf管，Trizol試劑提取腸黏膜上皮細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測吸光度(optical density，OD)值，計(jì)算RNA濃度和含量。采用逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量方法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析，自動(dòng)得出熒光曲線及CT值。采用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體內(nèi)內(nèi)毒素水平比較 與假手術(shù)組比較，腸內(nèi)營養(yǎng)組和芪黃煎劑低、中、高劑量組大鼠的腸道、門靜脈血和腸系膜淋巴結(jié)中內(nèi)毒素水平均顯著升高(P<0.05)；與腸內(nèi)營養(yǎng)組比較，芪黃煎劑低、中、高劑量組內(nèi)毒素水平顯著降低(P<0.05)，芪黃煎劑的效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠體內(nèi)內(nèi)毒素水平比較

3.2 各組大鼠腸道菌群數(shù)量比較 胃切除手術(shù)創(chuàng)傷后，大鼠腸道菌群數(shù)量有明顯降低趨勢；腸內(nèi)滴注藥物干預(yù)后，菌群數(shù)量均明顯升高；與腸內(nèi)營養(yǎng)組比較，芪黃煎劑低、中、高劑量組菌群數(shù)量明顯增加(P<0.05)；其中芪黃煎劑高劑量組腸道菌群數(shù)量顯著大于芪黃煎劑中、低劑量組(P<0.05)。見圖1、表2。

表2 各組大鼠腸道菌群數(shù)量比較

注：A.腸桿菌；B.乳酸桿菌；C.雙歧桿菌；D.腸球菌

3.3 各組大鼠腸上皮黏膜形態(tài)及Chiu氏病理評(píng)分比較 大鼠遭受手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激后，腸道出現(xiàn)缺血再灌注損傷，腸道黏膜上皮出現(xiàn)不同程度受損?？瞻讓?duì)照組大鼠小腸絨毛正常完整；假手術(shù)組大鼠小腸頂端絨毛上皮下間隙增大，伴少量瘀血；腸內(nèi)營養(yǎng)組大鼠部分腸絨毛上皮下間隙擴(kuò)張，部分絨毛上皮頂端與固有層分離，部分腸絨毛有充血水腫，有大量的黏液滲出；芪黃煎劑低劑量組大鼠絨毛破損伴隨固有層毛細(xì)血管暴露，固有層中性粒細(xì)胞增多，有出血；芪黃煎劑中劑量組大鼠上皮下間隙擴(kuò)張，伴黏膜上皮層與固有層中度分離和淋巴細(xì)胞浸潤；芪黃煎劑高劑量組大鼠腸絨毛上皮受損較輕，絨毛上皮頂端固有層分離，部分腸絨毛有疤痕形成。見圖2。與假手術(shù)組比較，腸內(nèi)營養(yǎng)組，芪黃煎劑低、中、高劑量組腸黏膜Chiu氏病理評(píng)分明顯升高(P<0.05)，芪黃煎劑降低Chiu氏病理評(píng)分的效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。見表3。

表3 各組大鼠小腸黏膜Chiu氏病理評(píng)分比較

注：A.空白對(duì)照組；B.假手術(shù)組；C.腸內(nèi)營養(yǎng)組；D.芪黃煎劑低劑量組；E.芪黃煎劑中劑量組；F.芪黃煎劑高劑量組

3.4 各組大鼠小腸組織中ZO-1、claudin、occludin mRNA表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，腸內(nèi)營養(yǎng)組和芪黃煎劑低、中、高劑量組大鼠小腸組織中ZO-1、claudin、occludin mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)；與腸內(nèi)營養(yǎng)組比較，芪黃煎劑低、中、高劑量組ZO-1、claudin、occludin mRNA表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05)或呈上升趨勢(P>0.05)；芪黃煎劑升高ZO-1、claudin、occludinmRNA的效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。見表4。

表4 各組大鼠小腸組織中ZO-1、claudin、occludin的mRNA表達(dá)水平比較

3.5 各組大鼠小腸組織中ZO-1、claudin、occludin蛋白的表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，腸內(nèi)營養(yǎng)組、芪黃煎劑低劑量組小腸組織ZO-1、claudin、occludin蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與腸內(nèi)營養(yǎng)組比較，芪黃煎劑低、中、高劑量組小腸組織ZO-1、claudin、occludin蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、圖4。

注：A.空白對(duì)照組；B.假手術(shù)組；C.腸內(nèi)營養(yǎng)組；D.芪黃煎劑低劑量組；E.芪黃煎劑中劑量組；F.芪黃煎劑高劑量組

注：A.空白對(duì)照組；B.假手術(shù)組；C.腸內(nèi)營養(yǎng)組；D.芪黃煎劑低劑量組；E.芪黃煎劑中劑量組；F.芪黃煎劑高劑量組；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與腸內(nèi)營養(yǎng)組比較，△P<0.05；與芪黃煎劑低劑量組比較，◇P<0.05；與芪黃煎劑中劑量組比較，□P<0.05

4 討論

人體腸道是細(xì)菌的良好培養(yǎng)基，腸道細(xì)菌中多數(shù)為厭氧菌，還有少數(shù)的需氧菌與兼性厭氧菌。這些菌群之間構(gòu)成良好的比例，與人體形成相互依賴、相互作用的微生態(tài)系統(tǒng)。厭氧菌粘附于腸黏膜上，共同形成腸黏膜的細(xì)菌生物膜，削弱其他腸腔菌群附著或定植于腸上皮的能力，發(fā)揮著腸黏膜生物屏障的保護(hù)作用。一方面，腸黏膜生物屏障通過抑制或者減少致病菌數(shù)量，分泌短鏈脂肪酸來降低腸道的pH值以及抑菌肽，如Spinler等[9]研究表明，羅氏菌素有明顯抑制腸道致病菌的作用。另一方面，腸黏膜生物屏障通過增加專屬厭氧菌，形成穩(wěn)定的細(xì)菌生物膜以減輕致病菌的定植拮抗作用，如Jones等[10]研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌及乳酸桿菌均能在腸黏膜表面形成生物膜，乳酸桿菌形成的生物膜具有抗菌和調(diào)節(jié)腸道免疫的作用。而腸上皮細(xì)胞間的緊密連接是腸黏膜機(jī)械屏障重要組成部分，是抵抗各類病原體及抗原的第一道屏障。腸上皮緊密連接由跨膜蛋白咬合蛋白、封閉蛋白和ZO蛋白家族構(gòu)成。Lindfors等[11]研究顯示，雙歧桿菌可減少小麥醇溶蛋白對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接的保護(hù)作用，調(diào)節(jié)腸上皮機(jī)械屏障ZO-1緊密蛋白表達(dá)，也可有效修復(fù)腸黏膜生物屏障的損傷。

健脾通里中藥對(duì)腸黏膜生物屏障損傷的修復(fù)發(fā)揮重要作用，張仁嶺等[12]發(fā)現(xiàn)，四君子湯能夠促進(jìn)術(shù)后早期恢復(fù)，電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)小腸內(nèi)絨毛長度及密度顯著升高，小腸黏膜通透性降低，保護(hù)腸黏膜生物屏障。陳海龍等[13]發(fā)現(xiàn)，通里攻下方大承氣湯能顯著減少腸道內(nèi)革蘭氏陰性桿菌的數(shù)量，顯著提高雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣也證實(shí)胃切除術(shù)后創(chuàng)傷使腸道的細(xì)菌和內(nèi)毒素發(fā)生移位，芪黃煎劑高劑量組可修復(fù)小腸黏膜病理損傷，明顯抑制大鼠體內(nèi)的內(nèi)毒素濃度，調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群失衡。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾主運(yùn)化，為“氣血生化之源”，胃為“水谷之?！?。本課題組經(jīng)過長期的實(shí)驗(yàn)與臨床實(shí)踐觀察發(fā)現(xiàn)，胃切除手術(shù)創(chuàng)傷后，脾胃功能受損，出現(xiàn)氣短、乏力、舌淡、苔白、脈細(xì)弱癥狀，術(shù)后又因麻醉創(chuàng)傷影響，脾胃的運(yùn)化功能尚未恢復(fù)，又有腑實(shí)氣滯表現(xiàn)，如進(jìn)食后腹脹、肛門停止排氣排便。其屬于氣血虛弱與腑實(shí)氣滯并存的證候。健脾通里方“芪黃煎劑”依據(jù)《脾胃論》補(bǔ)中益氣湯和《傷寒論》大承氣湯組方而成，主要有健脾中藥黃芪、黨參、白術(shù)和通里攻下中藥大黃、枳實(shí)、厚樸等。手術(shù)、創(chuàng)傷后腸黏膜結(jié)構(gòu)受損、血流減少、屏障減弱為“虛證”，手術(shù)麻醉后的胃腸麻痹、細(xì)菌感染引起內(nèi)毒素淤積在腸道為“實(shí)證”，故在治則治法上健脾通里。

脾主運(yùn)化功能與腸道菌群關(guān)系密切，二者在機(jī)體消化吸收、生長發(fā)育、抗御外邪等方面起重要作用。脾運(yùn)失健可引起腸道菌群失衡，出現(xiàn)消化吸收功能紊亂、免疫力減弱等癥狀，健脾益氣中藥可修復(fù)腸道生物屏障的損傷，調(diào)整腸道的酸堿度以及生成的抑菌肽，抑制腸道厭氧菌和外來菌的定植和生長，扶植有益菌生長，抑制炎癥因子，保護(hù)腸道黏膜生物屏障[14]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究[15]也發(fā)現(xiàn)，黃芪主要活性成分黃芪多糖具有明顯扶植腸道內(nèi)益生菌中雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，對(duì)致病菌中的腸桿菌與腸球菌具有一定的抑制作用，但是復(fù)方具有雙重效應(yīng)，對(duì)腸黏膜生物屏障的保護(hù)作用取決于復(fù)方制劑主要成分的藥物活性，其作用機(jī)制可能為抑制腸黏膜的炎癥因子，促進(jìn)腸內(nèi)的有益菌定植，平衡腸道微生態(tài)。朱珊[16]研究發(fā)現(xiàn)，健脾止瀉顆粒(以黃芪、太子參、山藥為主藥)中黃芪有效成分能修復(fù)小腸黏膜及其上皮細(xì)微絨毛，減輕小腸上皮的炎癥反應(yīng)，有健脾止瀉功效。黨參補(bǔ)脾養(yǎng)胃，健運(yùn)中氣，具有抗菌、抗病毒作用，對(duì)大腸埃希菌、傷寒沙門氏菌具有顯著抑制作用。通里中藥促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)，減少這類菌群在腸道的停留時(shí)間，抑制致病菌生長，抑制需氧菌的過度繁殖，調(diào)節(jié)其種類、數(shù)量、比例、定位來糾正紊亂的菌群結(jié)構(gòu)，改善腸黏膜生物屏障?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[17]證實(shí)，大黃有效成分大黃素可減少內(nèi)、外源性內(nèi)毒素吸收，降解和滅活血液循環(huán)和消化道中的細(xì)菌和內(nèi)毒素含量，減輕腸黏膜屏障損傷及破壞，防止腸道菌群移位。

本研究證實(shí)，手術(shù)創(chuàng)傷可以引起腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂、數(shù)量失衡，腸道上皮黏膜結(jié)構(gòu)破壞，腸黏膜機(jī)械屏障和生物屏障受損，出現(xiàn)細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，兩者之間相輔相成。芪黃煎劑對(duì)腸黏膜生物屏障的修復(fù)機(jī)制包括兩方面：一方面，芪黃煎劑通過自身藥物活性成分對(duì)腸道菌群和游離菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)；另一方面，芪黃煎劑通過對(duì)腸黏膜機(jī)械屏障的上皮細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過調(diào)節(jié)ZO-1、claudin、occludin的表達(dá)，抑制ZO-1的磷酸化水平，恢復(fù)腸黏膜上皮緊密連接的連續(xù)性和完整性。