超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜快速分析復(fù)方守宮散化學(xué)成分及血中移行成分

梁風(fēng)塵，周晉華，吳 歡，胡尚影

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研技術(shù)中心，安徽 合肥 230031)

超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight-tandem mass spectrometry,UPLC-QTOF/MS)是中藥單品及復(fù)方入血成分分析鑒定工作的有力手段,具有高分辨率、高靈敏度、分析速度快等特點(diǎn)[1]。UPLC法已成功應(yīng)用于復(fù)方守宮散中皂苷、二苯乙烯苷、蒽醌類成分的含量測(cè)定[2-4]，為復(fù)方守宮散的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一定的依據(jù)，而多級(jí)串聯(lián)功能的高分辨質(zhì)譜與液相色譜聯(lián)用儀可為中藥化學(xué)成分研究提供更有力的鑒別手段[5]。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證并鑒定復(fù)方守宮散的化學(xué)成分以及在大鼠血漿中的移行成分，本研究采用UPLC-QTOF/MS對(duì)復(fù)方守宮散原藥化學(xué)成分和灌胃復(fù)方守宮散后的大鼠血漿中藥物移行成分進(jìn)行研究，以期為復(fù)方守宮散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定及其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

復(fù)方守宮散由守宮、何首烏、梅花、生曬參、三七、沒(méi)藥6味中藥組成，是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科經(jīng)驗(yàn)方。目前，關(guān)于復(fù)方守宮散的研究主要集中于臨床、藥理等方面[6]，對(duì)其化學(xué)成分及血中移行成分的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以UPLC作為復(fù)雜組分的分離工具，以QTOF/MS作為定性鑒別手段，通過(guò)獲取目標(biāo)物中各種成分離子的精確質(zhì)核比，同時(shí)結(jié)合各個(gè)成分的二級(jí)質(zhì)譜信息，再參考UNIFI(沃特世科學(xué)信息平臺(tái))質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和復(fù)方中單味藥材已有定性分析的文獻(xiàn)[7-9]，旨在建立一種快速高效的復(fù)方守宮散化學(xué)成分及其血中移行成分定性分析方法。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備 沃特世超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC)、沃特世高分辨質(zhì)譜儀(Waters Synapt G2-Si QTOF)、ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)：Waters；Vortex-2 Genie型臺(tái)式高速離心機(jī)：Eppendorf；Vortex-2 Genie渦旋混合器：Scientific Industries；WD-9415C超聲波清洗器：北京市六一儀器廠。

1.2 藥品和制劑 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào) J2121165，含量20 mg)、三七皂苷R1標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào) D1828145，含量20 mg)、大黃素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào) H2119124，含量20 mg)、丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào) C2130380，含量20 mg)、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào) D2122129，含量20 mg)、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào) J2127453，含量20 mg)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；復(fù)方守宮散(批號(hào) 20210423，含量75 g)：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供；分析用水是超純水，乙腈、甲醇等為色譜純，其余試劑均是分析純。

1.3 動(dòng)物 雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(200±20)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2017-001]提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批文編號(hào)為AHUCM-rats-2021086。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，直徑1.8 μm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣容積：10 μL；流速：0.25 mL/min；流動(dòng)相：A(去離子水，含0.1%甲酸)和B(乙腈，含0.1%甲酸)，梯度洗脫(0～15 min，0%～20% B；15～50 min，20%～100% B；50～60 min，100% B；60～70 min，100%～0% B)。

2.1.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜系統(tǒng)：Synapt G2-Si；質(zhì)量范圍：50～1 500 Da；掃描時(shí)間：0.1 s；掃描離子模式：MSE，電噴霧離子源負(fù)離子模式(ESI-)和電噴霧離子源正離子模式(ESI+)下分別采集數(shù)據(jù)；參比化合物：亮氨酸-腦啡肽(掃描時(shí)間：0.3 s；間隔時(shí)間：15 s)；毛細(xì)管電壓：3 kV(ESI+)/2.5 kV(ESI-)；錐孔電壓：40 V；碰撞能：10～50 eV；離子源溫度：125 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：800 L/h；分析時(shí)間：70 min。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re、三七皂苷R1、槲皮素、大黃素和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別加入二甲基亞砜溶解為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確稱取丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入乙腈溶解為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，加入1.5 mL EP管中，加入940 μL 80%甲醇水溶液[V(甲醇)∶V(水)=80∶20]，稀釋為各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，裝瓶，待測(cè)。

2.3 復(fù)方守宮散原藥樣品溶液的制備 取復(fù)方守宮散樣品100 mg，置于15 mL離心管內(nèi)，加入10 mL無(wú)水甲醇，超聲30 min，取上清1 mL置于離心管中，14 000 r/min離心5 min，取上清，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，置入進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-QTOF/MS分析。

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.4.1 復(fù)方守宮散給藥樣品溶液制備 于灌胃前精密稱取復(fù)方守宮散適量，加入溫純水適量，用渦旋混合器混合均勻，制成0.1 g/mL復(fù)方守宮散溶液。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)、給藥、取血 將7周齡SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，濕度為50%±10%，12 h人工晝夜交替，自由取食，自由飲水。第7日20:00至第8日8:00禁食12 h，期間自由飲水。禁食結(jié)束后從大鼠眼眶靜脈叢采集血樣1 mL，置于含肝素離心管中，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，即空白血漿。按1.0 g/kg給大鼠灌胃復(fù)方守宮散溶液2 mL，灌胃后0.5、1、2 h，分別從眼眶靜脈叢取血0.3 mL，離心，收集含藥血漿，混合搖勻，置于-80 ℃冰箱貯藏，備用。

2.5 復(fù)方守宮散的血中移行成分定性分析 取含藥血漿樣品100 μL，置于1.5 mL EP管內(nèi)，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋2 min，14 000 r/min離心5 min，取上清液100 μL，置入進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-QTOF/MS分析。采用相同條件處理空白血漿樣品。應(yīng)用UPLC-QTOF/MS對(duì)上述樣品進(jìn)行定性分析，主要根據(jù)所測(cè)得化合物的相對(duì)分子量，應(yīng)用UNIFI軟件在規(guī)定的誤差范圍(±10-5Da)內(nèi)計(jì)算可能的元素組成，結(jié)合各個(gè)成分色譜峰的二級(jí)質(zhì)譜碎片信息等對(duì)色譜峰進(jìn)行定性分析。

3 結(jié)果

在復(fù)方守宮散原藥樣品溶液中共鑒定出77個(gè)化學(xué)物質(zhì)，包括皂苷類25個(gè)(三七皂苷6個(gè)，人參皂苷19個(gè))、黃酮類13個(gè)、醌類12個(gè)(蒽醌類10個(gè)，萘醌類1個(gè)，含醌類1個(gè))、糖類4個(gè)、脂酸類4個(gè)、氨基酸類3個(gè)、兒茶素類2個(gè)、芳香醇類2個(gè)、二萜類2個(gè)、揮發(fā)油類2個(gè)、其他類8個(gè)。再通過(guò)比較復(fù)方守宮散原藥樣品溶液、混合對(duì)照品溶液、空白血漿和含藥血漿的保留時(shí)間及質(zhì)譜信息，剔除在空白血漿樣品中存在以及未在原藥樣品中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)成分，最終在含藥血漿中確定了27個(gè)移行成分，其中皂苷類10個(gè)(三七皂苷1個(gè)，人參皂苷9個(gè))、黃酮類6個(gè)、醌類6個(gè)(蒽醌類5個(gè)，含醌類1個(gè))、揮發(fā)油類2個(gè)、其他類3個(gè)。復(fù)方守宮散的化學(xué)成分及其在大鼠血漿中移行成分見表1。原藥溶液、含藥血漿、空白血漿、對(duì)照品溶液的TIC圖見圖1，典型化合物大黃素的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律見圖2。

注：A.復(fù)方守宮散溶液TIC圖(正離子模式)；B.復(fù)方守宮散溶液TIC圖(負(fù)離子模式)；C.含藥血漿TIC圖(正離子模式)；D.含藥血漿TIC圖(負(fù)離子模式)；E.空白血漿TIC圖(正離子模式)；F.空白血漿TIC圖(負(fù)離子模式)；G.標(biāo)準(zhǔn)品TIC圖(正離子模式)；H.標(biāo)準(zhǔn)品TIC圖(負(fù)離子模式)

圖2 大黃素的二級(jí)質(zhì)譜和質(zhì)譜裂解規(guī)律圖

表1 復(fù)方守宮散的化學(xué)成分及其在大鼠血漿中移行成分

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

如表1所示，在ESI-模式下共鑒定出復(fù)方守宮散化學(xué)成分66個(gè)、大鼠血漿中移行成分24個(gè)，ESI+模式下共鑒定出復(fù)方守宮散化學(xué)成分35個(gè)、大鼠血漿中移行成分5個(gè)，其中在兩種模式下均發(fā)現(xiàn)的有復(fù)方守宮散化學(xué)成分24個(gè)、大鼠血漿中移行成分2個(gè)。

4 討論

復(fù)方守宮散具有補(bǔ)虛解毒、清腫止痛的功效，自1998年開始應(yīng)用于臨床以來(lái)，其療效一直較為肯定，臨床常用于治療伴有體虛、乏力、納差、疼痛的腫瘤患者[10-12]。

中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，口服給藥后，可吸收成分被直接吸收入血，或轉(zhuǎn)化為相應(yīng)代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液。通過(guò)血清藥物化學(xué)研究可以確定中藥復(fù)方中有效成分，以此為標(biāo)準(zhǔn)建立定量和定性方法，可以促進(jìn)中藥復(fù)方及中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。本研究利用中藥血清藥物化學(xué)方法初步研究復(fù)方守宮散的血中移行成分，旨在明確其藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，幫助建立復(fù)方守宮散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)指標(biāo)。經(jīng)過(guò)測(cè)定，在復(fù)方守宮散中鑒定出77個(gè)化學(xué)成分，能夠入血的成分達(dá)到27個(gè)。其中，何首烏的主要成分之一大黃素不僅能夠抗腫瘤，而且可以抗菌、止咳、降血壓[13]。人參有效成分20(S)-人參皂苷Rh2可使白血病患者癌細(xì)胞中HDAC1、HDAC6及HDAC2的表達(dá)水平降低，并減低其活性,最終產(chǎn)生遏制癌細(xì)胞增殖的效果[14]。三七皂苷R1可以通過(guò)抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，改善細(xì)胞縫隙連接功能，提升順鉑的細(xì)胞毒性等，從而發(fā)揮緩解病情的作用[15]。綠原酸是梅花的化學(xué)成分之一，具有抗腫瘤和廣譜的抗菌、抗病毒作用[16]。丁香酚是沒(méi)藥主要成分之一，不但具有明顯的抗氧化作用，而且在一定濃度下對(duì)致病性真菌和金黃色葡萄球菌具有顯著抑制作用[17]。這些化學(xué)成分的藥理作用不僅在一定程度上對(duì)應(yīng)復(fù)方中藥物的功效，而且有助于從潛在的物質(zhì)基礎(chǔ)角度解釋復(fù)方守宮散抗腫瘤等作用的機(jī)制。因此，結(jié)合復(fù)方中各味中藥的藥理學(xué)研究結(jié)果和傳統(tǒng)功效，可以初步推斷，本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的27種血中移行成分可能是復(fù)方守宮散藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要組成部分。

綜上所述，UPLC-QTOF/MS技術(shù)不僅為復(fù)方守宮散的血中移行成分的定性分析提供了一種簡(jiǎn)便有效的分析手段，而且也為該制劑的有效成分研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定參考。但是，復(fù)方守宮散的分析仍存在成分復(fù)雜、分離難度大、作用機(jī)制欠明確等問(wèn)題，方中所含動(dòng)物藥(守宮)的血中移行成分暫時(shí)無(wú)法運(yùn)用UPLC-QTOF/MS技術(shù)進(jìn)行鑒定，從而限制了復(fù)方守宮散的臨床推廣及基礎(chǔ)研究。