六味地黃湯通過樹突狀細(xì)胞Notch信號通路調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化干預(yù)自身免疫性腦脊髓炎

丁月文，錢庭霖，劉祝賀，汪鴻浩

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院， 廣東 廣州 510515；2. 南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；3. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515)

多發(fā)性硬化是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性脫髓鞘疾病，其臨床病程多見急性復(fù)發(fā)和癥狀緩解交替。目前，臨床常用的激素等藥物對多發(fā)性硬化的療效欠佳，且有一定的不良反應(yīng)。中醫(yī)藥在免疫性疾病的治療上有獨特的優(yōu)勢，研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，補腎類中藥對多發(fā)性硬化的療效顯著，其作用機制可能與調(diào)節(jié)免疫，特別是調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群分化相關(guān)[2]。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型是研究多發(fā)性硬化的經(jīng)典動物模型，以髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白多肽35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG35-55) 誘導(dǎo)免疫C57BL/6小鼠可以模擬多發(fā)性硬化的急性期炎癥反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是體內(nèi)最重要的抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)，其通過細(xì)胞表面分子以及分泌細(xì)胞因子的變化，調(diào)節(jié)抗原特異性T細(xì)胞分化，進而引起不同的免疫應(yīng)答。關(guān)于多發(fā)性硬化發(fā)病機制的“分子模擬假說”認(rèn)為，病原微生物抗原和髓鞘成分的交叉反應(yīng)是多發(fā)性硬化發(fā)病的重要因素[3]。病原微生物入侵人體后，DCs攝取抗原，使其成為具有免疫原性的多肽，與主要組織相容復(fù)合體結(jié)合后，刺激并活化初始CD4+T細(xì)胞，其中，Notch信號通路介導(dǎo)了初始CD4+T細(xì)胞向?qū)е滤枨恃装Y的效應(yīng)性T細(xì)胞分化，引起針對髓鞘特異性蛋白的交叉免疫反應(yīng)損傷[4]。

本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上，從DCs調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫角度，進一步探討多發(fā)性硬化患者CD4+T細(xì)胞免疫活化的調(diào)節(jié)因素，及“補腎生髓”法調(diào)節(jié)DCs干預(yù)多發(fā)性硬化發(fā)病的潛在機制，為臨床運用“補腎生髓”法治療多發(fā)性硬化提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6(C57)雌性小鼠及SPF級雌性Sprague Dawley(SD)大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2016-0041]提供，6～8周齡，2D2小鼠購自美國Jackson實驗室，分籠飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實驗動物中心，室內(nèi)溫度20～25 ℃，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)光照和黑暗節(jié)律為12 h/12 h。

1.2 藥物、試劑和儀器 六味地黃湯(熟地黃24 g，山茱萸、山藥各12 g，澤瀉、牡丹皮、茯苓各9 g)按常規(guī)方法煎煮，委托南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院制劑室進行加工，收集濾液，用文火濃縮，制成2 g/mL的水提物，-20 ℃保存?zhèn)溆?。MOG35-55(氨基酸序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)：上海吉爾生化公司；RPMI 1640、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution，PBS)、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸及雙抗：Gibco公司；重組小鼠粒細(xì)胞-集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，GM-CSF)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4, IL-4)：翹義神州公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、γ分泌酶抑制劑(gamma-secretase inhibitor，GSI)：Sigma公司；可固定活性染料450：Thermo Fisher公司；抗-CD3e(APC-CY7)、抗-CD4(BV510)、抗-CD8a(PerCP-Cy5.5)、抗-IL-17A(PE)、抗-Foxp3(Alexa Fluor 647)抗體：BD公司；CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒：Miltenyi Biotec公司；流式細(xì)胞儀：BD LSRFortessa X-20。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 取200 g雌性SD大鼠，以六味地黃湯(劑量40 g/kg)灌胃，共3 d，每日2次。分別于第3天第2次給藥2 h后采血，離心，分離血清，采用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，制成含有10%血清的RPMI 1640，-20 ℃保存待用。

2.2 小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(bone marrow derived dendritic cells，BMDCs)的分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo) 參考文獻[5]的方法分離、培養(yǎng)BMDCs。取6～8周齡C57小鼠股骨和脛骨，剔除骨周圍肌肉組織，用70%乙醇浸泡后，再用無菌PBS沖洗2次。將骨移入新培養(yǎng)皿中，用剪刀剪去骨兩端，采用一次性注射器針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復(fù)沖洗骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨完全變白。收集骨髓懸液，采用40 μm濾網(wǎng)過濾，獲取單細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心5 min，棄上清，裂解紅細(xì)胞后，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106/mL，接種于12孔板中，每孔1.5 mL，同時加入重組小鼠GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL)，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。第6天收集細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄上清，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并接種于12孔板中，加入重組小鼠GM-CSF(20 ng/mL)、IL-4(10 ng/mL)和LPS(1 μg/mL)。將BMDCs分成對照組、六味地黃湯含藥血清組、GSI(20 μg/mL)組。繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，即可獲得較成熟的BMDCs。

2.3 脾臟和淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞的純化 參考文獻[6]的方法分離脾臟和淋巴結(jié)的CD4+T細(xì)胞。采用MOG35-55免疫2D2小鼠，第7～10天收集小鼠脾臟和淋巴結(jié)，研磨后用40 μm濾網(wǎng)過濾，PBS重懸，制備單細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心5 min，棄上清，裂解紅細(xì)胞。磁珠分選CD4+T細(xì)胞，使用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸鈉、0.1 mmol/L非必需氨基酸、5×10-5mol/L 二甲氧基雌二醇及雙抗)重懸，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至4×106/mL，12孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，加入MOG35-55至終濃度為100 μg/mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞5 d。

2.4 CD4+T細(xì)胞與BMDCs共培養(yǎng) 將上述分離培養(yǎng)后的CD4+T細(xì)胞與BMDCs按照5∶1比例混合，繼續(xù)添加100 μg/mL MOG35-55，培養(yǎng)3 d后收集細(xì)胞。

2.5 被動免疫誘導(dǎo)EAE及病情評分 收集各組培養(yǎng)后的CD4+T細(xì)胞與BMDCs共培養(yǎng)細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×108/mL，通過腹腔注射過繼給雌性C57小鼠，于免疫當(dāng)天和48 h后給予每只小鼠注射200 ng PTX。EAE小鼠的病情評分標(biāo)準(zhǔn)參照Terry等[7]報道的方法。1級：部分尾巴下垂；2級：完全尾巴下垂；3級：完全尾巴下垂和站立行走緩慢；4級：后肢部分癱瘓；5級：后肢完全癱瘓；6級：瀕死狀態(tài)。

2.6 采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞分化情況 收集每組CD4+T細(xì)胞，采用Fixable Viability Dye 450標(biāo)記死細(xì)胞，固定、破膜后分別加入抗CD3e(APC-CY7)、抗CD4(BV510)、抗CD8a(PerCP-Cy5.5)、抗IL-17A(PE)，避光孵育30 min進行染色，破核膜，采用抗Foxp3(Alexa Fluor 647)進行核內(nèi)染色后，采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞分化情況。

2.7 采用Western blot法檢測Notch蛋白表達水平 收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min后，12 000 r/min、4 ℃離心，取上清。測定蛋白質(zhì)濃度，變性，上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，洗膜，二抗室溫下孵育1 h，ECL顯色，采用Image J軟件讀取條帶面積、寬度和灰度值，分析各組Notch1、Jagged1、MAML蛋白表達水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 每組實驗均進行3次獨立重復(fù)實驗，采用Flowjo 10分析流式細(xì)胞儀檢測數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計學(xué)分析及繪圖。多組均數(shù)比較使用單因素方差分析，方差齊時均數(shù)多重比較使用LSD法，方差不齊時均數(shù)多重比較使用DunnettT3法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 六味地黃湯對BMDCs中Notch通路相關(guān)蛋白表達水平的影響 與對照組比較，六味地黃湯和GSI組Notch通路相關(guān)蛋白Notch1、Jagged1、MAML水平均顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2。

注：A.對照組；B.六味地黃湯組；C.GSI組

注：與對照組比較，*P<0.05

3.2 六味地黃湯誘導(dǎo)Th17/Treg細(xì)胞分化 與對照組比較，六味地黃湯組與GSI組CD4+IL-17+T細(xì)胞的比例均顯著降低(P<0.05)，而CD4+FoxP3+T細(xì)胞的比例則顯著增高(P<0.05)。見圖3、圖4。

注：A.對照組；B.六味地黃湯組；C.GSI組

注：與對照組比較，*P<0.05

3.3 六味地黃湯減輕被動免疫EAE小鼠癥狀評分 與對照組比較，六味地黃湯組及GSI組小鼠癥狀評分均呈降低趨勢，其中六味地黃湯組小鼠EAE癥狀評分在被動免疫6～8 d時顯著低于對照組(P<0.05)。見圖5。

注：與對照組比較，*P<0.05

4 討論

多發(fā)性硬化可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痿證”范疇?！端貑枴ゐ粽摗分幸晕迮K論五痿，創(chuàng)立痿躄、脈痿、筋痿、肉痿、骨痿等病名。其中痿躄以四肢痿弱，下肢為重，行立不能為主；骨痿多見腰脊酸軟，骨節(jié)痿弱，難于直立，下肢痿弱無力。二者與多發(fā)性硬化癥狀最為相似。腎藏精，主骨，生髓通腦。補腎為主的方藥可以明顯改善多發(fā)性硬化患者的殘疾程度并減少疾病復(fù)發(fā)率[8-9]，其緩解EAE模型小鼠的作用可能與調(diào)節(jié)外周血CD4+T細(xì)胞分化相關(guān)[2]。但具體的機制尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯可以顯著抑制體外成熟DCs中Notch信號通路的關(guān)鍵蛋白Notch1、Jagged1等，DCs作為固有免疫細(xì)胞，在發(fā)揮抗原提呈作用的同時，也參與獲得性免疫反應(yīng)，DCs攝取外來抗原，將抗原呈遞給初始T淋巴細(xì)胞，并在多種因素協(xié)同下，促進T淋巴細(xì)胞激活及進入病灶。進入病灶的炎癥細(xì)胞進一步產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子、趨化因子等，從而產(chǎn)生一系列級聯(lián)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致髓鞘乃至軸突的損傷[10]。

Notch信號通路參與DCs對CD4+T的調(diào)節(jié)作用，Notch信號通路在進化上高度保守，它由Notch受體、配體及下游分子組成，通過相鄰的細(xì)胞之間受體和配體的相互作用而傳遞生物信號，對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用[11]。研究顯示，在LPS刺激下DCs可刺激T細(xì)胞以增加IL-17的分泌，而抑制Notch通路可以抑制體內(nèi)Th17細(xì)胞活化。Nocth信號的Jagged1配體可以促進Treg細(xì)胞的分化，上調(diào)Jagged1的表達水平，可以明顯增強Treg細(xì)胞的功能，其異常表達可導(dǎo)致自身免疫性疾病[12]。

在主動免疫EAE小鼠CD4+T細(xì)胞與BMDCs共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯及Notch通路抑制劑GSI處理后BMDCs對CD4+T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用顯著改變，Th17減少，Treg細(xì)胞增多，提示六味地黃湯對Notch信號通路的干預(yù)作用可能與抑制BMDCs對CD4+T細(xì)胞的促炎誘導(dǎo)有關(guān)。進一步采用被動免疫EAE模型驗證CD4+T細(xì)胞分化改變后對EAE發(fā)病的影響。實驗結(jié)果提示，隨著CD4+T細(xì)胞促炎分化作用降低，被動免疫小鼠EAE癥狀積分也顯著降低，這也與相關(guān)研究中Th17細(xì)胞活化對髓鞘炎癥損傷的促進作用相一致[13]。

綜上所述，Notch通路對DCs的調(diào)節(jié)作用，可能是“補腎生髓”法代表方六味地黃湯干預(yù)CD4+T細(xì)胞分化及其對多發(fā)性硬化發(fā)揮治療作用的重要途徑。