不同產(chǎn)地苦參中生物堿類含量測(cè)定及指紋圖譜研究

王昊天，葉世蕓*，殷少文，鄭立肯，鑒志剛

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴陽市第三人民醫(yī)院 科教科，貴州 貴陽 550006)

苦參是豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)的干燥根[1]。自古以來，苦參在我國就多有應(yīng)用，如《本草綱目》《滇南本草》《神農(nóng)本草經(jīng)》等對(duì)其功效均有記載。苦參性寒，味苦，歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕、殺蟲利尿之功效，可用于治療陰腫陰癢、濕疹、熱痢便血、皮膚瘙癢及外治滴蟲性陰道炎等病癥，尤宜治療婦科疾病[1-4]?？鄥⒆鳛槌Ｓ弥兴?，在我國分布廣泛，如河南、湖北、河北、內(nèi)蒙古等地均是其產(chǎn)區(qū)[2，5]?？鄥⒑悬S酮、生物堿、木脂素、萜類、微量元素等多種成分[2，4-8]，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗癌、抑菌等藥理活性[5-6]。其中，生物堿類及黃酮類成分在苦參中占比較大且為主要的活性成分[2，4]，是現(xiàn)今研究報(bào)道的重點(diǎn)。苦參中生物堿類成分更是以苦參堿及氧化苦參堿為主，因此自1963年版《中華人民共和國藥典》就將苦參堿及氧化苦參堿作為苦參的指標(biāo)性成分，2005年版《中華人民共和國藥典》加入HPLC測(cè)定含量也是將這兩種生物堿作為指標(biāo)成分，至2020年版《中華人民共和國藥典》未改變。隨著中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及研究的深入，僅以苦參堿及氧化苦參堿作為苦參含量測(cè)定的指標(biāo)已無法滿足對(duì)苦參的質(zhì)量控制(如與山豆根的區(qū)分)。因此，關(guān)于苦參中黃酮類成分、其他生物堿成分及將其作為指標(biāo)成分的研究報(bào)道日漸增多[4，9-11]。關(guān)于苦參中生物堿的含量測(cè)定及指紋圖譜的研究已有報(bào)道，而將兩者結(jié)合同時(shí)考察的研究較為鮮見。因此，本實(shí)驗(yàn)以4種生物堿作為指標(biāo)性成分，建立HPLC的含量測(cè)定方法，測(cè)定不同產(chǎn)地苦參中生物堿類化合物的含量，并建立指紋圖譜，旨在比較不同產(chǎn)地苦參質(zhì)量，為完善苦參質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(型號(hào)：1260 HPLC，廠商：Agilent)；HC-S4高速多功能粉碎機(jī)(永康市天琪盛世貿(mào)有限公司)；YQ-1000A超聲清洗儀(上海易凈超聲波儀器有限公司)；AE240天平(上海梅特勒有限公司)；藥典篩(紹興市上虞張興沙篩廠)；Welch Ultimate XB-NH2色譜柱(規(guī)格：4.6 mm×250 mm，5 μm，廠商：上海Welch公司)。

1.2 試劑與材料

31批苦參產(chǎn)于內(nèi)蒙古、云南、貴州、陜西等地，均為市售藥材，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)的干燥根，產(chǎn)地信息見表1；槐定堿對(duì)照品(170425)、苦參堿對(duì)照品(170512)、槐果堿對(duì)照品(161113)、氧化苦參堿對(duì)照品(170428)均購于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；氨水(分析純)、無水乙醇(分析純)、無水乙醇(色譜純)、乙腈(色譜純)均購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷(分析純，廠商：上海試劑四赫維化工有限公司)；磷酸(分析純，廠商：成都市科龍化工試劑廠)；水(娃哈哈純凈水，廠商：娃哈哈飲料有限公司)。

表1 31批苦參樣品

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Welch Ultimate XB-NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-無水乙醇-3%磷酸(85∶7.5∶7.5)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取對(duì)照品槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿適量，精密稱定，加入乙腈-無水乙醇(85∶15)溶解定容，分別制成含槐定堿3.74 mg/mL、苦參堿3.77 mg/mL、槐果堿3.61 mg/mL、氧化苦參堿3.98 mg/mL的對(duì)照品母溶液。自各對(duì)照品溶液中取2 mL，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈-無水乙醇(85∶15)定容，制成混合對(duì)照品溶液(含槐定堿0.748 mg/mL、苦參堿0.754 mg/mL、槐果堿0.722 mg/mL、氧化苦參堿0.796 mg/mL)，搖勻，備用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，可稀釋成不同濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取苦參粉末約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入氨水1.5 mL和三氯甲烷25 mL，稱定，超聲30 min，冷卻至室溫，補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液5 mL，水浴蒸干，殘?jiān)右译?無水乙醇(85∶15)溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，定容，用0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系考察 配制不同濃度的混合對(duì)照品溶液，測(cè)定，以濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸處理，得到4種生物堿線性方程，見表2、表3、表4、表5。

表2 槐定堿線性方程

表3 苦參堿線性方程

表4 槐果堿線性方程

表5 氧化苦參堿線性方程

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取內(nèi)蒙古3苦參樣品，稱取苦參粉末約0.5 g，制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定。所得4種生物堿峰面積的RSD值為0.88%～2.69%，該儀器和方法精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取內(nèi)蒙古3苦參樣品，稱取苦參粉末約0.5 g，制成供試品溶液，分別于0、1、2、3、5、8 h測(cè)定。測(cè)得4種生物堿峰面積的RSD值為0.47%～1.88%，樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取內(nèi)蒙古2苦參樣品，稱取苦參粉末6份，每份約0.5 g，制成供試品溶液并測(cè)定。測(cè)得4種生物堿峰面積的RSD值為1.09%～2.70%，該方法重復(fù)性好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的苦參藥材(槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿含量分別為0.129%、0.984%、0.151%、2.696%)粉末9份，每份約0.25 g，分別加入對(duì)照品溶液后(每種對(duì)照品溶液的加入量設(shè)定3個(gè)水平，每水平3份)，制成供試品溶液并分別測(cè)定。測(cè)得槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿的回收率分別為95.08%～104.19%、95.46%～101.15%、95.15%～104.80%、97.28%～104.80%，平均回收率分別為98.23%～103.50%、96.68%～99.26%、97.45%～101.49%、99.58%～102.95%，回收率的RSD值分別為0.92%～2.78%、0.81%～2.93%、2.73%～2.99%、1.69%～2.76%，表明該方法回收率良好。

2.4 多批次苦參飲片中生物堿類成分含量測(cè)定

2.4.1 31批苦參樣品4種生物堿含量測(cè)定 取31批苦參樣品，制成供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各產(chǎn)地苦參中4種生物堿的含量，結(jié)果見表6。

表6 不同產(chǎn)地苦參中槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿的含量

2.4.2 31批苦參樣品聚類分析 使用SPSS 26.0軟件對(duì)31批苦參樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，以4種生物堿的含量為變量，以瓦爾德法采用平均歐氏距離(d)測(cè)定相似度，聚類分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)d=15時(shí)，31批苦參樣品可聚為兩類，一類為3、23、5、26、16、7、11、22、30，另一類為20、28、10、29、4、6、12、31、2、19、21、24、27、1、15、8、14、18、9、25、17、13；當(dāng)d=10時(shí)，后一類又可聚為兩類，即20、28、10、29、4、6、12、31、2、19、21、24、27聚為一類，1、15、8、14、18、9、25、17、13聚為另一類；當(dāng)d=5時(shí)，13號(hào)又獨(dú)自聚為一類，即來自貴州2的苦參。

圖1 31批苦參樣品的聚類分析

2.5 苦參HPLC指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取內(nèi)蒙古3苦參樣品，制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3.00%，該儀器和方法精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取內(nèi)蒙古3苦參樣品，制成供試品溶液，分別于0、1、2、3、5、8 h測(cè)定，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3.00%，樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地批次苦參樣品6份，每份約0.5 g，制成供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3.00%，該方法重復(fù)性好。

2.6 31批苦參樣品指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

將31批苦參樣品制成供試品溶液并測(cè)定，記錄色譜圖。根據(jù)31批苦參樣品的測(cè)定結(jié)果，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(國家藥典委員會(huì)，2004A版)，建立31批苦參樣品指紋圖譜，以S1為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正并進(jìn)行匹配，生成對(duì)照指紋圖譜，共有峰5個(gè)，見圖2，與混合對(duì)照品溶液色譜圖的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行比較并指認(rèn)色譜峰。如圖3所示，可知1號(hào)峰為槐果堿，2號(hào)峰為苦參堿，4號(hào)峰為槐定堿，5號(hào)峰為氧化苦參堿。通過軟件對(duì)指紋圖譜的相似度進(jìn)行計(jì)算，可知31批苦參樣品指紋圖譜的相似度在0.73～0.99之間。

圖2 31批苦參樣品指紋圖譜

注：A.混合對(duì)照品溶液；B.空白溶劑；1.槐果堿；2.苦參堿；4.槐定堿；5.氧化苦參堿。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇及對(duì)供試品溶液制備方法考察

在確定色譜條件時(shí)，通過對(duì)全波段掃描，發(fā)現(xiàn)苦參總堿類化合物在220 nm處有最大吸收，所以選用220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在供試品溶液制備中，提取溶劑體積、超聲時(shí)間對(duì)含量影響較大。因此，用單因素考察法分別對(duì)三氯甲烷體積(15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL)、氨水體積(0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL)、超聲時(shí)間(20 min、25 min、30 min、35 min、40 min)進(jìn)行了考察，又用響應(yīng)面優(yōu)化法分別對(duì)三氯甲烷體積(20 mL、25 mL、30 mL)、氨水體積(0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL)、超聲時(shí)間(20 min、25 min、30 min)的選擇進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定三氯甲烷體積25 mL、氨水體積1.5 mL、超聲時(shí)間30 min為最優(yōu)方案。

3.2 結(jié)果分析

31批苦參樣品指紋圖譜的相似度在0.73～0.99之間，引起相似度低于0.8的苦參樣品產(chǎn)自于貴州，其余苦參樣品間的相似度良好。但根據(jù)4種生物堿含量，經(jīng)系統(tǒng)聚類分析，當(dāng)d(平均歐氏距離)=10時(shí)，可將31批苦參樣品聚分為3類，3、23、5、26、16、7、11、22、30為第一類，20、28、10、29、4、6、12、31、2、19、21、24、27為第二類，1、15、8、14、18、9、25、17、13為第三類。這表明不同產(chǎn)地的苦參樣品間雖有著高度一致的化學(xué)成分，但各生物堿的含量各有不同。根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果，31批苦參樣品中苦參堿和氧化苦參堿的總量均大于1.2%，符合2020年版《中華人民共和國藥典》的要求。以苦參堿和氧化苦參堿的總量作為依據(jù)，總體上第一類的苦參樣品最佳，第二類次之，第三類最差。其中，產(chǎn)于貴州2的苦參，不論是苦參堿和氧化苦參堿的總量，還是4種生物堿的總量，均排在最后，質(zhì)量最差。這與系統(tǒng)聚類分析中，當(dāng)d=5時(shí)，來自貴州2的苦參獨(dú)自聚為一類的結(jié)果相符。但來自貴州3苦參中生物堿的含量較高，表明可能貴州省不同批次、不同地區(qū)間苦參的質(zhì)量也存在著差異。產(chǎn)于云南、四川、湖南等地的苦參普遍生物堿含量較高，宜于臨床優(yōu)先選用。

由含量測(cè)定結(jié)果可知，4種生物堿在苦參中的含量趨勢(shì)由高到低依次為氧化苦參堿、苦參堿、槐定堿、槐果堿，且苦參堿和氧化苦參堿的總量在4種生物堿的總量中占比較高，而這4種生物堿均為苦參的藥理活性成分。氧化苦參堿具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等活性[5-6，12-14]?？鄥A具有抗肝損傷、抗心律失常、抗纖維化、鎮(zhèn)靜等諸多活性[5-6，12，15-18]。隨著苦參研究的深入，槐定堿及槐果堿的藥理活性研究也有一定進(jìn)展。除與氧化苦參堿、苦參堿同樣具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等活性，槐果堿還有抗腹瀉、保肺、抗結(jié)腸炎、改善心肌肥厚以及抗柯薩奇病毒的作用[5-6，19-20]。而槐定堿則抗炎作用較強(qiáng)，可應(yīng)對(duì)各種急慢性炎癥，且能抑制細(xì)胞免疫及體液免疫[21]。綜上，不同產(chǎn)地苦參中各生物堿含量的差異可能會(huì)造成臨床療效的差異，應(yīng)將含量和藥理活性綜合考慮，選擇指標(biāo)成分評(píng)價(jià)苦參的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)以4種生物堿作為指標(biāo)成分，相較以往，補(bǔ)充了槐果堿、槐定堿這兩種苦參中的活性成分，使苦參質(zhì)量評(píng)價(jià)更加全面、可靠。經(jīng)方法學(xué)考察，本實(shí)驗(yàn)所用方法方便、可行，可為進(jìn)一步完善苦參質(zhì)量控制提供參考。