紅景天破壁飲片對小鼠急性肝腎毒性研究

黃 穎，馬子力，張麗艷，田興中，謝 宇，馬四補，龔華乾，柴藝匯*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州廣濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，貴州 貴陽 550014；3.張家口市第五醫(yī)院，河北 張家口 075000)

紅景天為景天科植物大花紅景天(Rhodiolacrenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba)的干燥根和根莖，味甘、苦，性平，歸肺、心經(jīng)，具有益氣活血、通脈平喘、補腎之功，主治周身乏力，胸悶等癥[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅景天在保護(hù)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等方面均有治療作用[3-5]。目前，開發(fā)了多種紅景天藥用及保健產(chǎn)品，如紅景天酥油丸、紅景天藥酒等，可用于老年性心衰、糖尿病、高血壓、陽痿、心臟缺血、神經(jīng)官能癥、肝臟等疾病的保健[6]。歷代醫(yī)書古籍與現(xiàn)代臨床應(yīng)用中均未見紅景天有毒性報道。中藥破壁飲片是為改善常規(guī)傳統(tǒng)飲片的使用方式，采用先進(jìn)超微粉碎技術(shù)制成的新型中藥飲片，可在保留傳統(tǒng)飲片的物質(zhì)基礎(chǔ)上，實現(xiàn)中藥品質(zhì)的均一性及確保安全性，中藥材破壁粉碎加工后，原傳統(tǒng)飲片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被粉碎破壞，使細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的溶出量大大提高，有利于提高有效成分的利用率[7]，同時藥材中其他成分的加速釋放則可能放大潛在的不良反應(yīng)和毒副作用。本實驗觀察不同劑量的紅景天破壁飲片對小鼠日常行為、肝腎等臟器的影響，評價紅景天破壁飲片的安全性，為紅景天破壁飲片安全、有效應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

清潔級昆明小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，動物合格證號：SCXK(湘)2019-0004，由湖南斯萊克景達(dá)試驗動物有限公司提供。

1.2 主要試劑

PBS(批號：RP050025)，購于莫納生物科技有限公司；水合氯醛(批號：F529BA0007)、多聚甲醛(批號：E918BA1001)，購于生工生物工程股份有限公司；蘇木素染色液(批號：1113A18)，均購于北京雷根生物技術(shù)有限公司；中性樹脂(批號：20171009)，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器

高壓蒸汽消毒滅菌鍋(浙江紹興醫(yī)療器械總廠，型號：LMQ C-50EP)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，型號：Mini-Sub Cell GT)；切片機(jī)(德國徠卡儀器公司，型號：RM2235)；烤片機(jī)(德國徠卡儀器公司，型號：HI1220)；倒置光學(xué)顯微鏡(廣州明美光電技術(shù)有限公司，型號：MF53)。

1.4 藥物

紅景天破壁飲片，由貴州廣濟(jì)堂藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法

2.1 小鼠分組與給藥

將40只昆明小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半，紅景天破壁飲片加入蒸餾水?dāng)嚢柚瞥赡芡ㄟ^12號灌胃針的最大濃度為341.15 mg/mL、給予最大體積 0.04 mL/g，按0.85倍遞減給小鼠灌胃[8]，分別配制紅景天破壁飲片高劑量組濃度341.15 mg/mL、中劑量組濃度289.98 mg/mL、低劑量組濃度246.48 mg/mL，空白組灌胃相同體積的蒸餾水。給藥前小鼠禁食不禁水12 h，一日內(nèi)灌胃3次，各組小鼠一日給藥量如表1所示，給藥后小鼠自由進(jìn)食飲水，連續(xù)灌胃14 d。

表1 各組給藥量

2.2 觀察動物一般體征及體重變化

給藥后開始觀察動物整體情況，給藥當(dāng)天連續(xù)觀察8 h，記錄3次。觀察動物的活動毛發(fā)、分泌物、大小便等一般體征，每日2次，連續(xù)觀察14 d。若有動物死亡，記錄死亡數(shù)目和死亡時間。詳細(xì)記錄動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)的癥狀開始和消失的時間。并記錄動物灌胃給藥后第1天、第5天、第10天、第15天的體質(zhì)量變化。

2.3 動物臟器指數(shù)檢測

實驗結(jié)束，斷頭取血，解剖，觀察各組小鼠臟器的變化情況，對心臟、肝臟和腎臟稱重，并用以下公式計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

2.4 血清生化指標(biāo)檢測

小鼠血液以3 000 r/min×15 min離心，取上清液至-20 ℃保存待測。檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血糖(Glu)、總膽固醇(TC)及甘油三酯(TG)的含量。

2.5 小鼠肝臟和腎臟病理檢測

用 PBS清洗各組小鼠肝臟、腎臟，用4%多聚甲醛固定后保存。用不同濃度的乙醇溶液各浸泡2 h梯度脫水。將組織浸泡在二甲苯中進(jìn)行透明，將透明處理過的組織浸泡于融化的石蠟中3 h進(jìn)行組織包埋。用切片機(jī)將石蠟塊中的組織切成5μm厚的薄片，平鋪于防脫玻片上，切片脫蠟后復(fù)水，染色，脫水封片，采集圖像，觀察具體形態(tài)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 紅景天破壁飲片對小鼠一般體征及體質(zhì)量的影響

實驗期間動物行為活動、呼吸、口鼻分泌物未見明顯異常，無動物死亡。與空白對照組(Control)比較，紅景天破壁飲片低(RR-L)、中(RR-M)、高(RR-H)劑量組小鼠體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)。見表2。

表2 紅景天破壁飲片對小鼠體質(zhì)量的影響

3.2 紅景天破壁飲片對小鼠內(nèi)臟指數(shù)變化的影響

與空白對照組(Control)比較，紅景天破壁飲片低(RR-L)、中(RR-M)、高(RR-H)劑量組小鼠肝臟指數(shù)、心臟指數(shù)(CI)及左、右腎臟指數(shù)均差異均不顯著(P>0.05)。見表3、表4、表5、表6。

表3 紅景天破壁飲片對小鼠肝臟指數(shù)的影響

表4 紅景天破壁飲片對小鼠心臟指數(shù)的影響

表5 紅景天破壁飲片對小鼠左腎腎臟指數(shù)的影響

表6 紅景天破壁飲片對小鼠右腎腎臟指數(shù)的影響

3.3 紅景天破壁飲片對小鼠血清各項指標(biāo)的影響

與空白對照組(Control)比較，紅景天破壁飲片低(RR-L)、中(RR-M)、高(RR-H)劑量組小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血糖(Glu)、總膽固醇(TC)及甘油三酯(TG)含量差異均不顯著(P>0.05)。見表7。

表7 紅景天破壁飲片對小鼠血清AST、ALP、ALB、BUN、Ccr、Glu、TC及TG含量的影響

3.4 紅景天破壁飲片對小鼠肝組織病理變化的影響

研究結(jié)果顯示，空白對照組肝臟被膜完整，肝細(xì)胞分葉不明顯，肝索排列紊亂，肝竇內(nèi)未見明顯的炎細(xì)胞浸潤；門管區(qū)結(jié)構(gòu)較為完整，未見明顯的纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤；其他亦未見明顯病理變化。紅景天破壁飲片低、中、高劑量組小鼠肝臟組織鏡下所見與正常組比較無明顯差異。見圖1。

圖1 紅景天破壁飲片各劑量組小鼠肝組織病理檢測結(jié)果比較(HE，×400)

3.5 紅景天破壁飲片對小鼠腎組織病理變化的影響

研究結(jié)果顯示，空白對照組腎臟組織被膜完整，皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清晰，腎小球結(jié)構(gòu)完整清晰，未見毛細(xì)血管基底增厚及炎性滲出；間質(zhì)內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生；其他亦未見明顯病理變化。紅景天破壁飲片低、中、高劑量組小鼠腎臟組織鏡下所見與正常組比較無明顯差異。見圖2。

圖2 紅景天破壁飲片各劑量組與曲美他嗪組小鼠腎組織病理檢測結(jié)果比較(HE，×400)

4 討論

植物類中藥的細(xì)胞壁中存在著發(fā)揮藥效的主要成分，然而在常用的傳統(tǒng)中藥飲片中其細(xì)胞破壁率不足3%，大大影響了中藥的利用率[9]。隨著中藥現(xiàn)代化及新型飲片的不斷深入研究，改變中藥物理狀態(tài)是有助于提高其藥效和利用率的有效途徑，中藥破壁飲片是運用超微粉碎技術(shù)將中藥傳統(tǒng)飲片進(jìn)行細(xì)胞級微粉碎的新型中藥飲片。中藥破壁飲片很大程度彌補了傳統(tǒng)飲片用量大、攜帶不便的特點，是一類可直接內(nèi)服新型飲片。運用超微粉碎技術(shù)將符合標(biāo)準(zhǔn)的中藥材粉碎，使其細(xì)胞破壁率達(dá)到95%，有效成分利用率達(dá)到90%以上，使細(xì)胞內(nèi)各種有效成分充分溶出，促進(jìn)和提高中藥材多種有效成分的溶解及釋放[10]。在增大有效成分溶出的同時其他成分的加速釋放則可能放大潛在的不良反應(yīng)和毒副作用。目前，對中藥破壁飲片安全性的研究相對較薄弱，中藥破壁前后藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與毒理學(xué)反應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本實驗通過觀察不同劑量的紅景天破壁飲片對小鼠日常活動、小鼠腎臟器指數(shù)、血清中AST、ALP、ALB、BUN、Glu、TC、TG含量以及HE染色觀察小鼠肝腎組織的病理改變，探索紅景天破壁飲片的急性肝腎毒性作用。結(jié)果顯示，與空白組比較，紅景天破壁飲片各劑量組小鼠活動、呼吸、口鼻分泌物未見明顯異常，無動物死亡，體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)；血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血糖(Glu)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量及各臟器指數(shù)與病例切片等均無顯著性差異(P>0.05)，表明紅景天破壁飲片對小鼠肝腎等臟器均無顯著毒副反應(yīng)，安全性較強。本研究探討了紅景天破壁飲片對小鼠急性肝腎毒性的影響，為紅景天破壁飲片的安全應(yīng)用及臨床推廣提供一定實驗依據(jù)。