白子菜對(duì)2型糖尿病合并急性腎損傷小鼠的保護(hù)效應(yīng)

韋美夢(mèng)，柳俊輝，李耀華，盧澄生，閆理姣，唐冬偉，梁斐琳，雷夢(mèng)穎，韋乃球

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一組因胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足和(或)胰島素利用障礙引起的糖脂代謝紊亂性疾病，病程久可導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織器官的功能減退及衰竭等[1]。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)為最常見的DM類型，占DM病人的90% 以上[2]。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是DM最常見的微血管并發(fā)癥，也是臨床常見病、多發(fā)病[3]。隨著DM和DN發(fā)病率的增加，T2DM合并急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)的患者也有所增加，尤其是老年患者更易發(fā)生[4-5]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是一種重要的致炎因子，其誘導(dǎo)的膿毒癥是AKI的常見誘因[6]。

白子菜Gynuradivaricata(L.)DC.為菊科多年生草本植物，又名白背三七、白仔菜、救命草等[7]；其根味甘、性涼，有清熱涼血、散瘀消腫之功效；而莖葉味咸、性涼，有清熱、舒筋、接骨、止血、祛痰的作用[8]。近年來(lái)，老百姓以白子菜食、藥兩用，廣泛用于治療胃病、高血壓病、高血脂癥及糖尿病等。已有文獻(xiàn)報(bào)道白子菜具有改善胰島素抵抗、降血糖、降血脂、抗氧化、降血壓以及保護(hù)高血壓引起的主要器官損傷等作用[9-22]。但是，白子菜對(duì)(T2DM+AKI)模型小鼠的保護(hù)效應(yīng)尚未有相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立(T2DM+AKI)小鼠模型，探討白子菜對(duì)(T2DM+AKI)的保護(hù)效應(yīng)，并從炎癥反應(yīng)角度探討其初步療效機(jī)制，為開發(fā)白子菜藥用價(jià)值方面提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

實(shí)驗(yàn)藥物采于廣西貴港，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室的郭敏副教授鑒定，為菊科植物白子菜Gynuradivaricata(L.)DC.的全草。

1.2 動(dòng)物

雄性KM小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級(jí)，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為：SCXK(桂)2014-0002。

1.3 試劑

高糖高脂飼料(由普通飼料69.3%、豬油10%、蔗糖20%、食鹽0.5%、膽固醇0.2%組成)，課題組自行配制；鏈脲佐菌素(STZ)(批號(hào)：SO130)，Sigma；鹽酸二甲雙胍(批號(hào)：180906)，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；4%多聚甲醛組織固定液(批號(hào)：1810083)，廣州賽國(guó)生物科技有限公司；TNF-α(批號(hào)：20190123)、IL-6(批號(hào)：20190116)、ICAM-1(批號(hào)：20181220)，bioswamp。備注：血清BUN、Scr采用的是全自動(dòng)生化檢測(cè)，全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)試劑采用配套的一體化檢測(cè)試劑包，沒(méi)有單獨(dú)的試劑批號(hào)。

1.4 儀器

ACCU-CHEK羅氏血糖測(cè)試儀，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；UV-1800紫外可見分光光度儀(日本島津公司)；DNM-9602全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；德國(guó)Eppendorf 5430R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海艾研生物科技有限公司)；AB204型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；吉爾森P型移液器(深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司)；Aeroset-2000全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Instrument laboratory公司)；MDF-U7386S超低溫保存箱(日本 SANYO 公司)；電泳儀(美國(guó) BIO-RAD 公司)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能公司)；電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；BX51T-PHD-J11顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；RM2015切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)。

2 方法

2.1 白子菜提取物的制備

取白子菜干品1 kg，加10倍量的水，浸泡1 h后回流提取1.5 h，趁熱過(guò)濾，藥渣加8倍量水回流提取1.0 h，趁熱過(guò)濾，將兩次濾液混合并搖勻，濃縮藥液，各制成相當(dāng)生藥2 g/mL的浸膏，置4 ℃冰箱備用。

2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥

取 90 只SPF級(jí)KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)取出 10 只作為正常對(duì)照組，其余小鼠隨機(jī)平均分為T2DM組、(T2DM+AKI)組、(白子菜高、低劑量+T2DM)組、(白子菜高、低劑量+T2DM+AKI)組、(二甲雙胍+T2DM)組和(二甲雙胍+T2DM+AKI)組。小鼠喂食高糖高脂飼料結(jié)合一次性腹腔注射 100 mg/kg 的鏈脲佐菌素復(fù)制T2DM模型，T2DM小鼠腹腔注射 LPS(10 mg/kg)復(fù)制(T2DM+AKI)模型。給藥組小鼠腹腔注射 LPS前 7 d 開始，用白子菜水煎液灌胃，1次/d，持續(xù) 15 d。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠全程喂養(yǎng)高脂飼料直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.3 一般情況觀察

觀察各組小鼠飲食及大小便、活動(dòng)狀態(tài)、精神狀況等。

2.4 空腹血糖的測(cè)定

在小鼠第15d末次給藥后，禁食不禁水12 h，尾尖取血，利用羅氏血糖測(cè)試儀測(cè)定血糖值。

2.5 血清BUN、Scr含量檢測(cè)

血液樣品在室溫放置 2 h 后，于4 ℃ 條件3 000 r·min-1離心 10 min，收集血清按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定BUN、Scr的含量。

2.6 ELISA 法檢測(cè)炎癥反應(yīng)相關(guān)因子

取腎組織，放入勻漿管，稱量后加入9倍量預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行勻漿，勻漿后于4 ℃ 條件3 000 r·min-1離心10 min，并提取上清液按ELISA試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-10含量。

2.7 腎組織病理形態(tài)學(xué)的觀察

取腎組織，用預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行清洗并稱量，浸于10%甲醛溶液24 h，脫水石蠟包埋，60 ℃條件下固定1 h，并以二甲苯溶液處理10 min，切片依次以梯度乙醇溶液處理，再以 PBS 洗滌3次，每次5 min。進(jìn)一步以蘇木素染液染色10 min，并用1%鹽酸酒精分化；以促藍(lán)液反藍(lán)5 s后加伊紅染液染色3 min，再依次用 80%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫水，晾干后以中性樹膠封片，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠一般行為學(xué)觀察

正常對(duì)照組小鼠反應(yīng)靈敏，活動(dòng)正常，體毛光澤，飲食飲水正常，大便顆粒狀，尿淡黃色，墊料干燥，體質(zhì)量增加。T2DM 組小鼠反應(yīng)遲鈍，倦怠蜷臥或煩躁易怒，體毛枯燥，飲食飲水增多，常有腹瀉，尿多，墊料潮濕，體質(zhì)量減少，(T2DM+AKI)組小鼠上述異常表現(xiàn)更明顯。與T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜各劑量組小鼠各項(xiàng)表現(xiàn)趨于正常。

3.2 白子菜對(duì)(T2DM+AKI)小鼠空腹血糖的影響

結(jié)果如表 1所示，與正常對(duì)照組比較，T2DM組、(T2DM+AKI)組小鼠空腹血糖含量顯著升高，且(T2DM+AKI)組較T2DM組升高明顯。與T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜各劑量組小鼠空腹血糖含量均顯著降低。

表1 對(duì)小鼠空腹血糖水平的影響

3.3 白子菜對(duì)(T2DM+AKI)小鼠腎功能的影響

結(jié)果如表 2 所示，與正常對(duì)照組比較，T2DM組、(T2DM+AKI)組小鼠血清BUN、Scr 含量均顯著增加，且(T2DM+AKI)組較T2DM組增加明顯。與T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜各劑量組小鼠血清BUN、Scr含量均顯著減少。

表2 對(duì)小鼠BUN、Scr含量的影響

3.4 白子菜對(duì)(T2DM+AKI)小鼠腎組織 TNF-α，IL-6和IL-10含量的影響

結(jié)果如表 3 所示，與正常對(duì)照組比較，T2DM組、(T2DM+AKI)組小鼠腎組織TNF-α、IL-6含量明顯增加，而IL-10含量明顯減少，且(T2DM+AKI)組較T2DM組增加或減少明顯。與T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜各劑量組小鼠腎組織TNF-α、IL-6含量明顯減少，而IL-10含量明顯增加。

表3 對(duì)小鼠腎組織TNF-α，IL-6和IL-10含量的影響

3.5 白子菜對(duì)(T2DM+AKI)小鼠腎組織病理學(xué)的影響

結(jié)果如圖 1 所示，正常對(duì)照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小球數(shù)目較多且大小均勻，形態(tài)正常，未見炎性細(xì)胞。T2DM組、(T2DM+AKI)組小鼠腎小管明顯擴(kuò)張，腎小球萎縮變形，排列不均勻，數(shù)目與正常對(duì)照組比較明顯減少，可見嚴(yán)重的腎臟損傷，且(T2DM+AKI)組較T2DM組嚴(yán)重。同T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜各劑量組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)較清晰，數(shù)目也增多，大小形態(tài)基本恢復(fù)正常，腎小球萎縮現(xiàn)象得到一定程度的緩解。

圖1 各組腎臟病理組織(HE，×200)

4 討論

研究表明，BUN 和 Scr含量增加是AKI的重要標(biāo)志[23]，而DM或 T2DM和高尿酸血癥之間相互影響，即通過(guò)降低血尿酸可改善血糖水平[24-25]。但是，目前對(duì)(T2DM+AKI)動(dòng)物模型的研究甚少，本研究通過(guò)鏈脲佐菌素合并腹腔注射LPS的方法復(fù)制(T2DM+AKI)小鼠模型。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，T2DM組、(T2DM+AKI)組小鼠腎小球萎縮變形，數(shù)目明顯減少，可見嚴(yán)重的腎損傷，且(T2DM+AKI)組較T2DM組嚴(yán)重；空腹血糖、血清BUN和Scr含量均明顯增加，且(T2DM+AKI)組較T2DM組增加更明顯，說(shuō)明(T2DM+AKI)小鼠模型復(fù)制成功，且高尿酸與高血糖對(duì)(T2DM+AKI)有一定的協(xié)同作用。與T2DM組、(T2DM+AKI)組比較，白子菜組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，數(shù)目明顯增多，大小形態(tài)恢復(fù)正常，腎小球萎縮現(xiàn)象得到一定程度的緩解；空腹血糖、血清BUN和Scr含量明顯降低，說(shuō)明白子菜能夠改善(T2DM+AKI)的異常。

還有研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致 AKI 的重要因素，如 AKI 患者血清TNF-α、IL-1β 及 IL-6 均顯著升高[26]。其中，TNF-α介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)、炎癥、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等多方面的效應(yīng)，可作為診斷早期DN的指標(biāo)[27]；IL-6 利用自分泌或旁分泌的方式和位于腎小球系膜細(xì)胞上的受體相結(jié)合，促使細(xì)胞外基質(zhì)的生成及腎小球系膜的增生，引起腎小球硬化癥，進(jìn)而導(dǎo)致DN的發(fā)生、發(fā)展[28]。還有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腎缺血再灌注模型促炎因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等增多，而抗炎因子血紅素氧化酶-1(HO-1)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等減少，導(dǎo)致促炎與抗炎反應(yīng)間的不平衡，從而引發(fā)腎損傷[29]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，(T2DM+AKI)小鼠腎組織促炎因子TNF-α、IL-6含量明顯增加，而抗炎因子IL-10含量明顯減少；給予白子菜干預(yù)后，小鼠腎組織促炎因子 TNF-α、IL-6含量明顯減少，而抗炎因子IL-10含量明顯增加。

綜上所述，白子菜對(duì)(T2DM+AKI)具有保護(hù)作用，表現(xiàn)為同時(shí)降低空腹血糖、血清BUN和Scr含量，而其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。雖然本研究具體機(jī)制尚未清晰，但仍具有一定研究開發(fā)前景，對(duì)未來(lái)進(jìn)一步研究提供思路。