酶解輔助超聲法提取花生紅衣原花青素的工藝研究

胡江波，王海鳳，許夢婷，唐賽賽

山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校 (煙臺 264199)

花生是我國主要油料作物之一，年產(chǎn)量居世界第一?；ㄉt衣是花生加工的副產(chǎn)物，是傳統(tǒng)的中藥成分，具有止血散瘀、消腫之功效，且兼有補腎養(yǎng)胃、潤肺止咳、補中益氣、清腸排毒的療效[1-3]?；ㄉt衣中含有多種活性物質(zhì)，如黃酮、白藜蘆醇、原花青素等。其中原花青素是自然界廣泛存在的一類多酚類化合物，由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素縮合而成，具有良好的抗氧化性和清除自由基能力[4-5]。目前原花青素作為營養(yǎng)強化劑、天然抗氧化劑、天然防腐劑等，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域[6]。在花生加工業(yè)中，花生紅衣一直沒有得到充分的綜合利用，因此更加合理有效地利用花生紅衣資源，提取其中的天然活性成分，具有重要的社會與經(jīng)濟效益。

目前，國內(nèi)外提取原花青素的主要方法為溶劑提取法，但為了縮短提取時間、提升提取的效率，更好的應(yīng)用于生產(chǎn)，多種輔助提取的方法逐漸應(yīng)用其中，例如可產(chǎn)生機械效應(yīng)與熱效應(yīng)的微波及超聲波輔助提取法、可產(chǎn)生空化效應(yīng)的超臨界流體提取法和打破植物細(xì)胞壁而促進(jìn)提取物加快溶出的酶解法等[7]。纖維素酶是一種較為理想的植物細(xì)胞壁溶解酶，能夠有效破壞植物細(xì)胞壁，加速活性物質(zhì)的釋出，從而提高原花青素得率[8]。本試驗以花生紅衣為原料，利用纖維素酶輔助超聲波法提取原花青素，并對原花青素的抗氧化性進(jìn)行分析，為花生紅衣的深加工和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生紅衣、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；纖維素酶(酶活性15 000 U/g)，青島蔚藍(lán)生物股份有限公司；DPPH，上海北諾生物科技有限公司；香草醛、濃鹽酸、乙醇等，均為分析純。

UV-2450分光光度計，日本島津公司；AL204電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；小型中藥粉碎機，永康市云達(dá)機械設(shè)備廠；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取標(biāo)品10.0 mg，用少量乙醇溶解，用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，混勻，配置0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL標(biāo)液。分別吸取標(biāo)液0.5 mL放入25 mL試管，以蒸餾水做空白對照，加入3 mL 4%香草醛-甲醇液和1.5 mL濃鹽酸，立即混勻，室溫避光顯色15 min，在500 nm下測吸光值。以標(biāo)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以樣品的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2原花青素得率的測定

將花生紅衣在 60 ℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，粉碎，過40目篩，得到花生紅衣粉。稱取20 g花生紅衣粉，加入一定量纖維素酶和50%乙醇水溶液，放入超聲儀中進(jìn)行酶解、超聲提取，將提取液離心，上清液按一定比例稀釋，以蒸餾水為空白，分別加入 1.5 mL 的濃鹽酸溶液和3.0 mL香草醛溶液，混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，測定吸光值。吸光值帶入回歸方程可得到樣品的質(zhì)量濃度，乘以稀釋倍數(shù)即可得出提取液中樣品的質(zhì)量濃度，根據(jù)以下公示可計算得出原花青素的得率。

原花青素得率=C×n×V/m×100%

式中：C為提取液中原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；n為提取液的稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；m為花生紅衣質(zhì)量，mg。

1.2.3單因素試驗

準(zhǔn)確稱取5份干燥粉碎后的花生紅衣樣品20 g， 加入一定量50%乙醇水溶液，分別以料液比(m/v)、纖維素酶添加量、提取溫度及超聲提取時間四因素中的三個因素為固定因素，余下一個因素水平為變量進(jìn)行單因素試驗，之后逐一更換變量因素，直至每個因素都輪換到。每個因素作為固定因素時確定條件分別為料液比(m/v)1∶16、纖維素酶添加量0.2%、提取溫度50 ℃、超聲提取時間40 min。提取液經(jīng)離心、過濾后定容，測其吸光度A500并計算原花青素的得率，根據(jù)單因素試驗確定料液比、纖維素酶添加量、提取溫度、提取時間這4個因素對原花青素得率的影響，并確定較優(yōu)的提取條件。

1.2.4正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對4個因素分別取3個水平，以得率作為考察指標(biāo)，按照 L9(34)正交表進(jìn)行優(yōu)化組合試驗。正交試驗因素與水平設(shè)計見表 1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.5花生紅衣原花青素抗氧化性的分析

取 2 mL 濃度為 0.004% 的 DPPH-甲醇溶液，分別加入0.1 mL不同濃度的原花青素樣品液，振蕩混合均勻后，室溫避光靜置反應(yīng) 30 min，以甲醇為空白，測定 525 nm波長下的吸光值。以抗壞血酸作為陽性對照，進(jìn)行3組平行試驗，計算花生紅衣原花青素和抗壞血酸對 DPPH 自由基的清除率。

清除率=1-[(A-B)/A0]×100%

式中：A0為加甲醇的DPPH溶液的吸光值；A為樣品與DPPH反應(yīng)后的吸光值；B為樣品空白(0.1 mL樣品+2 mL甲醇)。

2 結(jié)果與討論

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1.028 6X+0.048 1，R2=0.999。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 原花青素提取工藝的單因素試驗結(jié)果

2.2.1提取溫度對得率的影響

在料液比(m/v)1∶16，纖維素酶添加量0.2%，超聲提取時間40 min的條件下，調(diào)整提取溫度分別為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃，提取花生紅衣原花青素，計算原花青素的得率，實驗結(jié)果見圖 2。如圖所示，提取溫度在40 ℃～55 ℃之間時，原花青素的得率隨溫度的升高而提高。原因可能是纖維素酶的活力隨著溫度升高而增大，，加強了對花生紅衣纖維的酶解，使得相應(yīng)提高。當(dāng)溫度超過55 ℃時得率降低，這可能是由于溫度超過了纖維素酶的最適溫度，降低了酶活力，削弱了酶解能力，導(dǎo)致得率降低。因此選擇提取溫度為 55 ℃最為合適。

圖2 提取溫度對原花青素得率的影響

2.2.2提取時間對得率的影響

在料液比(m/v)1∶16，纖維素酶添加量0.2%，提取溫度50 ℃的條件下，提取時間依次調(diào)整為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，提取花生紅衣原花青素并計算得率，實驗結(jié)果見圖3。由圖可知，提取時間在20～40 min之間，原花青素的得率隨時間延長而提高，40 min以后得率基本維持不變。原因可能是反應(yīng)初期底物濃度較高，纖維素酶與底物接觸的更完全，隨著反應(yīng)時間延長，原花青素得率逐漸升高。40 min以后，底物消耗殆盡，酶解作用結(jié)束，得率基本穩(wěn)定。

圖3 提取時間對原花青素得率的影響

2.2.3纖維素酶添加量對得率的影響

在料液比(m/v)1∶16，提取溫度50 ℃，超聲提取時間40 min的條件下，纖維素酶添加量依次調(diào)整為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，提取花生紅衣原花青素并計算得率，實驗結(jié)果見圖4。纖維素是細(xì)胞壁的主要組成成分，纖維素酶能水解花生紅衣細(xì)胞壁中的纖維素，破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，加速原花青素的溶出[9-10]。 由圖4可知，隨著纖維素酶添加量增大花生紅衣原花青素得率逐漸升高，當(dāng)添加量超過0.3%時，得率基本不變。從成本考慮，選擇纖維素酶添加量為0.3%。

圖4 纖維素酶添加量對原花青素得率的影響

2.2.4料液比對得率的影響

在纖維素酶添加量0.2%，提取溫度50 ℃，超聲提取時間40 min的條件下，料液比(m/v)依次調(diào)整為1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20，提取花生紅衣原花青素并計算得率，實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，原花青素的得率隨料液比的增加而增大，在 1∶18時達(dá)到最大值。選擇料液比1∶18較為合適。

圖5 料液比對原花青素得率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果與分析

正交試驗結(jié)果見表2。由表2可知，4個因素對花生紅衣原花青素得率的影響主次順序為B>A>C>D，即提取時間影響最大，其次是提取溫度和纖維素酶添加量，料液比影響最小。從K值來看，最佳工藝條件為A3B2C2D1，即提取溫度55 ℃，提取時間40 min，纖維素酶添加量0.3%，料液比(m/v)1∶20。

按照正交試驗確定的最佳提取工藝進(jìn)行驗證試驗，花生紅衣原花青素的得率為10.97%。在提取溫度55 ℃，超聲提取時間40 min及料液比(m/v)1∶20的條件下，不添加纖維素酶，花生紅衣原花青素的得率僅為9.32%。因此正交試驗確定的最佳提取工藝優(yōu)于所有試驗中的得率。

表2 正交試驗結(jié)果表

2.4 原花青素的抗氧化能力

花生紅衣原花青素對 DPPH 自由基的清除能力見圖6。由圖可知，花生紅衣原花青素提取液具有抗氧化活性，隨著原花青素濃度的增加，DPPH自由基清除率相應(yīng)增加，當(dāng)原花青素濃度達(dá)到0.28 mg/mL以上時，清除率不再明顯升高，可能是由于DPPH減少到一定程度后，與原花青素芳香環(huán)上的羥基可結(jié)合的概率降低，導(dǎo)致原花青素芳香環(huán)上的羥基直接與PheO結(jié)合，在自由基的清除能力上表現(xiàn)為趨于平衡[11]。同時從圖上可以看出，與相同濃度的抗壞血酸相比，花生紅衣原花青素提取物對DPPH自由基的清除能力略低。

3 結(jié)論

采用纖維素酶輔助超聲提取法對花生紅衣原花青素提取工藝進(jìn)行研究，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過4因素3水平正交試驗得出最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度55 ℃、提取時間40 min、纖維素酶添加量0.3%、料液比(m/v)1∶20，此條件下測得原花青素的得率為10.97%，而相同實驗參數(shù)下不添加纖維素酶測得原花青素得率為9.32%。通過對花生紅衣原花青素提取物進(jìn)行體外抗氧化性分析，得出花生紅衣原花青素對DPPH具有較強的清除能力，但與抗壞血酸相比，其對自由基的清除率略低。本研究具有得率高、提取時間短、提取物抗氧化能力強等優(yōu)點，為花生紅衣的深加工和綜合利用提供了理論依據(jù)。

圖6 花生紅衣原花青素對 DPPH 自由基的清除能力