響應面優(yōu)化百香果果皮黃酮提取工藝

任美燕

山西工商學院 (太原 030006)

百香果俗稱“巴西果”和“雞蛋果”，其營養(yǎng)價值豐富，其用途主要生產(chǎn)果汁，可發(fā)酵果酒，對果皮的利用率低[1-2]。目前對百香果果皮的研究集中在制成果皮粉及果膠、色素、多糖、多酚等活性物質(zhì)的提取利用[3-6]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其黃酮含量豐富，其活性成分具有控制血糖、抗氧化、降血脂等作用[7-8]。百香果果皮中的黃酮作為保健品，具有豐富的營養(yǎng)價值以及廣泛的應用前景[9]。

通過比較不同的提取方法發(fā)現(xiàn)，其中以超聲提取總黃酮的提取率更高，該方法使原料與提取劑之間始終保持較大的有效成分濃度差，減少了濾渣中溶質(zhì)殘留，有效提高提取過程的效率[10-14]。因此本文采用超聲提取百香果果皮中黃酮，并且以黃酮得率為指標，采用響應面法，確定最佳提取工藝條件，為百香果果皮黃酮的純化利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫百香果，廣西省玉林市；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、蘆丁標準品，分析純，北京華威銳科化工有限公司。

1.2 儀器與設備

F80型高速粉碎機，上海標本模型廠；恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；755B型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；TGL-16GB型離心機，金壇市大地自動化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1原料處理

百香果外表完好無破損，去瓤取果皮。切塊放入恒溫干燥箱80 ℃烘干至恒重，用粉碎機碾壓成粉末，60目過篩，密封收于冰箱冷藏保存。

1.3.2蘆丁的標準曲線繪制[15]

配制0.1 mg/mL 的蘆丁標準液，取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 至 10 mL 具塞比色管中，用50%乙醇定容至5 mL，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后，加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后，加入4%的NaOH溶液4.0 mL，用50%的乙醇定容至10 mL，搖勻后靜置15 min后，在510 nm處測定吸光度，以吸光度Y對蘆丁濃度X(mg/mL)進行線性回歸：

y=0.113 1x-0.000 8，R2=0.999 5

1.3.3單因素實驗

1.3.3.1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

稱取1 g百香果果皮粉末，設定料液比(g/mL)為1∶20、提取溫度50 ℃、提取時間30 min、提取功率250 W，設定乙醇濃度20%、40%、60%、80%、100%進行超聲提取，測定黃酮得率。

1.3.3.2 提取溫度對黃酮得率的影響

稱取1 g百香果果皮粉末，設定料液比(g/mL)1∶20、乙醇濃度60%、提取時間30 min 、提取功率250 w，提取溫度設定30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃進行超聲提取，測定黃酮提取率。

1.3.3.3 料液比對黃酮得率的影響

稱取1 g百香果果皮粉末，設定乙醇濃度60%、提取時間30 min、提取溫度50 ℃、提取功率250 W、料液比(g/mL)設定1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70進行超聲提取，測定黃酮得率。

1.3.3.4 提取時間對黃酮得率的影響

稱取1 g百香果果皮粉末，設定乙醇濃度60%、料液比(g/mL)1∶20、提取溫度50 ℃、提取功率250 W、提取時間設定10 min、20 min、30 min、40 min、50 min進行超聲提取，測定黃酮得率。

1.3.3.5 超聲功率對黃酮得率的影響

稱取1 g百香果果皮粉末，設定乙醇濃度60%、料液比(g/mL)1∶20、提取溫度50 ℃、提取時間30 min，提取功率設定200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W進行超聲提取，測定黃酮得率。

1.3.4響應面實驗設計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，對提取黃酮實驗中乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)3個因素3個水平，運用Design-Expert8實驗設計軟件，完成三因素三水平響應面試驗設計。實驗因素編碼及水平如表1。

表1 響應面分析因素與水平

1.4 黃酮得率的計算

黃酮含量的測定[20]：分別吸取不同工藝參數(shù)的提取液1 mL，依次加入4 mL 60%的乙醇，分別加入0.3 mL 5%的NaNO2，搖勻，靜置6 min；再依次加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3，搖勻，靜置6 min，再分別加入 4 mL 1 mol/L的NaOH，用60%乙醇定容至50mL，搖勻，靜置20 min，然后于510 nm測吸光度，計算黃酮得率：

黃酮得率(mg/g)=(0.113 1A-0.000 8)×v/m

式中：A為黃酮的吸光度；v為黃酮提取液總體積，mL；w為百香果果皮干粉質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1乙醇濃度對黃酮得率的影響

圖1 乙醇濃度對黃酮得率的影響

如圖1所示，黃酮得率隨著乙醇濃度的增加而增加，但乙醇濃度超過60%后提取率開始下降，這是因為一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性成分的溶出量增大，故乙醇的最適提取濃度為60%。

2.1.2提取溫度對黃酮得率的影響

圖2 提取溫度對黃酮得率的影響

如圖2所示，百香果皮當中的黃酮得率隨著提取溫度的升高而發(fā)生變化，并且在提取溫度為50 ℃的時候，提取率最高，之后黃酮得率下降。這是因為隨著溫度升高，乙醇揮發(fā)，百香果果皮中果膠等一些物質(zhì)的溶出量也會相應增加，不利于黃酮的提取。因此50 ℃是提取百香果果皮當中黃酮的最適提取溫度。

2.1.3料液比對黃酮得率的影響

如圖3所示，黃酮得率隨著料液比的增加而增大，當料液比(g/mL)達到1∶50時黃酮得率最高，之后料液比再增大，黃酮得率呈下降趨勢。這是因為隨著提取溶劑用量的增加，使百香果果皮當中，黃酮物質(zhì)提取率的濃度差大大增加，從而提高了傳質(zhì)速度，使百香果果皮當中黃酮提取率上升。當溶劑增加到一定程度后，黃酮已經(jīng)被大部分提取出來，此時料液比對黃酮得率的影響降低。百香果果皮中的黃酮提取的最適料液比(g/mL)為1∶50。

圖3 料液比對黃酮得率的影響

2.1.4提取時間對黃酮得率的影響

圖4 提取時間對黃酮得率的影響

如圖4所示，百香果皮當中黃酮得率隨著時間的增加而大幅度上升。但當提取時間為40 min時，黃酮得率最高，之后得率有所下降。因此，選用40 min是黃酮的最適提取時間。

2.1.5超聲功率對黃酮得率的影響

圖5 超聲功率對黃酮得率的影響

如圖5所示，在超聲功率較小時，黃酮得率隨著超聲功率的增加而響應地提高，當超聲功率為250 W時，達到黃酮得率的最高值。隨著超聲功率的不斷增大，百香果果皮中的其他物質(zhì)被提出，影響黃酮的溶出。因此，超聲功率250 W是最適提取條件。

2.2 響應面法實驗結(jié)果

2.2.1響應面法實驗方案及結(jié)果分析

根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，固定料液比(g/mL)在1∶50、超聲功率250 W，考察乙醇濃度、提取時間、提取溫度3個因素對百香果果皮黃酮提取率的影響，用響應面法進行優(yōu)化，以百香果黃酮得率作為響應值。根據(jù)響應面法中Box-Behnken實驗原理運用Design-Expert 8進行設計，實驗設計及結(jié)果見表2。

表2 響應面實驗因素水平設計與結(jié)果

利用Design-Expert8軟件對表2中實驗數(shù)據(jù)進行二次多項逐步回歸擬合，得回歸模型方程為：Y=19.18+0.1125A+0.3375B+0.45C-0.725AB-0.7AC-0.6BC-2.2775A2-0.3275B2-1.2025C2

2.2.2模型的顯著性檢驗

對確定回歸模型進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，P<0.05，對百香果果皮黃酮提取建立的二次多項模型具有顯著性，失擬項不顯著。該模型擬合度較好，實驗誤差小，能夠用來分析和與預測百香果果皮中總黃酮的提取。其中一次項B項、C項顯著，A項不顯著。交互項AC、AB、BC顯著，二次項B2不顯著，A2、C2項顯著。根據(jù)表3中F值的大小判斷各因素的影響程度次序為提取溫度>提取時間>乙醇濃度，其中提取溫度和提取時間對百香果果皮的黃酮提取率的影響達到顯著水平。乙醇濃度、提取時間、提取溫度的之間的相互作用見圖6～圖8。

通過模型預測百香果果皮黃酮提取的最適條件是：乙醇濃度59.30%、提取時間42.62 min、提取溫度50.38 ℃，黃酮得率理論值為19.281 6 mg/g。為檢驗響應曲面法預測結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化的提取條件進行百香果果皮提取，考慮實際操作的方便性，將提取工藝參數(shù)修正為乙醇濃度60%、提取時間40 min、提取溫度50 ℃，測得黃酮得率為19.212 4 mg/g，與理論預測基本吻合，說明基于響應面法優(yōu)化的提取工藝參數(shù)準確可靠，有實用價值。

表3 二次響應面回歸模型方差分析表

圖6 乙醇濃度和提取時間對黃酮得率的影響

圖7 乙醇濃度和提取溫度對黃酮得率的影響

圖8 提取時間和提取溫度對黃酮得率的影響

3 結(jié)論

本試驗以黃酮的提取率為考查指標，采用超聲提取法使百香果果皮與提取劑之間始終保持較大的有效成分濃度差，減少了濾渣中溶質(zhì)殘留，可有效提高提取過程的效率。通過響應面法優(yōu)化百香果果皮中黃酮的提取工藝，結(jié)果表明最佳工藝條件為：乙醇濃度60%、提取時間40 min、提取溫度50 ℃，測得黃酮得率為19.212 4 mg/g。重復性試驗和驗證試驗結(jié)果表明，超聲波提取工藝重復性好、工藝方案穩(wěn)定可行。