饑餓對擬穴青蟹大眼幼體和Ⅰ期仔蟹蛻皮和生長的影響

胡偉勝，馬春艷，馬凌波，張鳳英，劉志強(qiáng)，趙 明，王 偉

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所遺傳育種與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090）

擬穴青蟹（Scyllaparamamosain），簡稱青蟹，隸屬于節(jié)肢動物門，甲殼動物綱，十足目，梭子蟹科，青蟹屬，主要分布于太平洋、印度洋的熱帶、亞熱帶和溫帶沿岸，是我國重要的海水養(yǎng)殖蟹類。2018年，我國青蟹養(yǎng)殖面積突破2.3萬hm2，養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)15萬t［1］。近年來青蟹的養(yǎng)殖產(chǎn)量雖然一直持穩(wěn)定增長的趨勢，但青蟹苗種的來源依舊以海捕苗種為主［2］。導(dǎo)致這一狀況的主要原因是青蟹苗種規(guī)模化培育的相關(guān)技術(shù)尚不成熟。

在自然海域中，饑餓是十足目甲殼動物生長發(fā)育過程中時常遭受的生理脅迫之一。饑餓脅迫下，甲殼動物的消化酶活性［3-4］、組織結(jié)構(gòu)［5-6］和物質(zhì)組成［7-8］都會發(fā)生適應(yīng)性變化。長時間的饑餓極易導(dǎo)致甲殼動物存活率和蛻皮率降低，蛻皮延緩［9-12］。然而，當(dāng)滿足一定的攝食需求后，即使此后處于持續(xù)饑餓的狀態(tài)下，甲殼動物依然可以順利完成蛻皮過程［9-10］。餌料投喂作為青蟹苗種培育過程中的關(guān)鍵技術(shù)之一，過多的投喂雖然可以滿足苗種的營養(yǎng)需求，但極易敗壞水質(zhì)，從而引起苗種的大量死亡［13-14］。此外，輪蟲和鹵蟲作為青蟹苗種階段的主要生物餌料，質(zhì)量小和適口性差的輪蟲和鹵蟲極易導(dǎo)致短時間的饑餓脅迫。

此前，為衡量十足目甲殼動物對饑餓的耐受能力，ANGER等［15］提出以“營養(yǎng)儲存飽和點(diǎn)”（PRS）和“不可恢復(fù)點(diǎn)”（PNR）作為評價饑餓對十足目甲殼動物負(fù)面影響的重要指標(biāo)。PRS是指初始投喂時間閾值，此時間節(jié)點(diǎn)后，十足目甲殼動物即使持續(xù)饑餓也可以蛻皮至下一發(fā)育時期；PNR是指初始饑餓時間閾值，此時間節(jié)點(diǎn)后，十足目甲殼動物即使恢復(fù)投喂也不可能完成蛻皮過程。大眼幼體和Ⅰ期仔蟹作為擬穴青蟹苗種培育的關(guān)鍵時期，本研究確定兩者的PRS50和PNR50值，闡明兩者的攝食需求，以期以此為根據(jù)建立合理的餌料投喂策略，為生產(chǎn)中提高擬穴青蟹苗種產(chǎn)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物的準(zhǔn)備和飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)選用的擬穴青蟹大眼幼體來源于東海水產(chǎn)研究所浙江寧海研究中心，Ⅰ期仔蟹來源于福建省霞浦縣忠盛水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社。相同時期的實(shí)驗(yàn)幼體均來源于同一親本。實(shí)驗(yàn)將即將蛻皮的Ⅴ期溞狀幼體和大眼幼體從育苗池轉(zhuǎn)移至高0.8 m、底面半徑0.5 m的圓柱形桶中培育，待幼體蛻皮后撈取新蛻皮的大眼幼體和Ⅰ期仔蟹用以開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用的大眼幼體［頭胸甲長（2.32±0.05）mm］和Ⅰ期仔蟹［甲長（3.10±0.11）mm、甲寬（3.91±0.12）mm］個體健壯、活力極佳。

實(shí)驗(yàn)使用長方體塑料盒（長×寬×高=0.5 m×0.25 m×0.4 m）養(yǎng)殖大眼幼體，塑料盒內(nèi)置細(xì)網(wǎng)片，養(yǎng)殖水溫27.5～30.0℃，養(yǎng)殖鹽度24～26，pH 8.0～8.4，餌料是當(dāng)天孵化的豐年蟲無節(jié)幼體，餌料密度是6～8個·mL-1。Ⅰ期仔蟹使用1 L的燒杯養(yǎng)殖，燒杯底部鋪細(xì)沙，養(yǎng)殖水溫28.0～30.5℃，養(yǎng)殖鹽度33，pH 8.0～8.4，餌料是體長6～8 mm的冰鮮仔蝦和仔魚。實(shí)驗(yàn)用水均經(jīng)砂濾和消毒處理。實(shí)驗(yàn)期間，每天8∶00和15∶00各投喂一次餌料，每天11∶00和18∶00各換水一次，每次換水1／3。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1.2.1 大眼幼體的PRS和PNR實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用投喂-饑餓和饑餓-投喂的處理方式分別開展PRS和PNR實(shí)驗(yàn)。PRS實(shí)驗(yàn)共設(shè)3個處理組和2個對照組，處理組分別是投喂2 d-饑餓組（F2S）、投喂4 d-饑餓組（F4S）和投喂6 d-饑餓組（F6S），對照組分別是連續(xù)饑餓組（S）和連續(xù)投喂組（F）（圖1-a）；PNR實(shí)驗(yàn)同樣共設(shè)3個處理組和2個對照組，處理組分別是饑餓2 d-投喂組（S2F）、饑餓4d-投喂組（S4F）和饑餓6 d-投喂組（S6F），對照組同樣是連續(xù)饑餓組（S）和連續(xù)投喂組（F）（圖1-b）。各組均設(shè)3個平行，每個平行25個大眼幼體。每次飼喂結(jié)束2 h后觀察大眼幼體的攝食情況，確保攝食的正常。大眼幼體的實(shí)驗(yàn)周期是16 d。每天詳細(xì)記錄各組大眼幼體的死亡和蛻皮情況，測量記錄大眼幼體蛻皮后Ⅰ期仔蟹的甲長、甲寬和體質(zhì)量。

圖1 大眼幼體的PRS（a）和PNR（b）實(shí)驗(yàn)設(shè)計Fig.1 PRS（a）and PNR（b）experimental design of megalopae

1.2.2 Ⅰ期仔蟹的PRS和PNR實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)同樣采用投喂-饑餓和饑餓-投喂的處理方式分別開展PRS和PNR實(shí)驗(yàn)。PRS實(shí)驗(yàn)共設(shè)3個處理組和2個對照組，處理組分別是投喂1 d-饑餓組（F1S）、投喂2 d-饑餓組（F2S）和投喂3 d-饑餓組（F3S），對照組分別是連續(xù)饑餓組（S）和連續(xù)投喂組（F）（圖2-a）；PNR實(shí)驗(yàn)同樣共設(shè)3個處理組和2個對照組，處理組分別是饑餓1 d-投喂組（S1F）、饑餓2 d-投喂組（S2F）和饑餓3 d-投喂組（S3F）。對照組同樣是連續(xù)饑餓組（S）和連續(xù)投喂組（F）（圖2-b）。各組均設(shè)3個平行，每個平行16個Ⅰ期仔蟹。每次投喂結(jié)束2 h后觀察Ⅰ期仔蟹的攝食情況，確保攝食的正常。Ⅰ期仔蟹的實(shí)驗(yàn)周期是8 d。每天詳細(xì)記錄各組Ⅰ期仔蟹的死亡和蛻皮情況，測量記錄Ⅰ期仔蟹蛻皮后Ⅱ期仔蟹的甲長、甲寬和體質(zhì)量。

圖2 Ⅰ期仔蟹的PRS（a）和PNR（b）實(shí)驗(yàn)設(shè)計Fig.2 PRS（a）and PNR（b）experimental design of first juvenile

1.3 數(shù)據(jù)分析

各指標(biāo)計算公式如下：

式中，N0為實(shí)驗(yàn)開始時大眼幼體或Ⅰ期仔蟹的個體數(shù)，Nt為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時大眼幼體或Ⅰ期仔蟹順利蛻皮的個體數(shù)；W0為大眼幼體或Ⅰ期仔蟹的初始平均體質(zhì)量，Wt為大眼幼體或Ⅰ期仔蟹蛻皮后Ⅰ期仔蟹或Ⅱ期仔蟹的平均體質(zhì)量。

甲長甲寬的測量方式參照林琪等［16］的測量標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)的蛻皮率數(shù)據(jù)根據(jù)方程y=a／［1+e（b-x）／c］（Boltzmann模型）計算，使用繪圖軟件origin擬合S型曲線用以確定PRS50和PNR50值［17］。Boltzmann模型中y為大眼幼體或Ⅰ期仔蟹的蛻皮率，x為投喂或饑餓時間，a為大眼幼體或Ⅰ期仔蟹的最高蛻皮率，b為PRS50和PNR50的預(yù)估值，c為曲線的斜率。PRS50指“投喂-饑餓”處理，50%大眼幼體或Ⅰ期仔蟹順利蛻皮的時間點(diǎn)；PNR50是指“饑餓-投喂”處理，50%大眼幼體或Ⅰ期仔蟹順利蛻皮的時間點(diǎn)。

營養(yǎng)脆弱性指數(shù)（NVI）=PRS50／PNR50

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，利用SPSS 26.0軟件采用單因素方差分析（one-way ANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大眼幼體的PRS實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大眼幼體PRS的擬合曲線方程是y=95.16／［1+e（3.55-x）／0.20］（R2=0.998），PRS50值是3.57 d（圖3）。如圖4-A所示，S組和F2S組大眼幼體的蛻皮率均為0，而F4S組、F6S組和F組3組大眼幼體的蛻皮率無顯著性差異。F4S組大眼幼體蛻皮后Ⅰ期仔蟹的增重率顯著低于F6S組和F組（P＜0.05）（圖4-B）。F4S組大眼幼體蛻皮后Ⅰ期仔蟹的甲長、甲寬顯著低于F6S組和F組（P＜0.05）（圖4-C，D）。F4S組、F6S組和F組3組大眼幼體的發(fā)育時間無顯著性差異（表1）。

表1 投喂-饑餓處理對大眼幼體發(fā)育時間的影響Tab.1 Effects of feeding-starvation treatment on development time of megalopae

圖3 大眼幼體的PRS擬合曲線Fig.3 PRS fitting curve of megalopae

圖4 投喂-饑餓處理對大眼幼體的蛻皮率和新蛻皮的Ⅰ期仔蟹增重率、個體大小的影響Fig.4 Effects of feeding-starvation treatment on molting rate of megalopae and weight gain rate and body size of newly molted first juvenile

2.2 大眼幼體的PNR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

初步統(tǒng)計，饑餓1 d時大眼幼體的存活率為（68.33±5.00）%；饑餓2 d時大眼幼體的存活率僅為（30.00±13.23）%。實(shí)驗(yàn)觀察到大眼幼體初始饑餓狀態(tài)下，相殘行為十分嚴(yán)重，很大一部分大眼幼體攝食了同類。因此，本文未對大眼幼體的PNR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做更深入地統(tǒng)計分析。

2.3 Ⅰ期仔蟹的PRS實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Ⅰ期仔蟹PRS的擬合曲線方程是y=100／［1+e（0.90-x）／0.18］（R2=0.999），PRS50值是0.90 d（圖5）。如圖6-A所示，S組Ⅰ期仔蟹的蛻皮率為0，F(xiàn)2S組、F3S組和F組3組Ⅰ期仔蟹的蛻皮率均顯著性差異。投喂時間越長，Ⅰ期仔蟹蛻皮后Ⅱ期仔蟹的增重率越高（圖6-B）。F1S組和F2S組Ⅰ期仔蟹蛻皮后Ⅱ期仔蟹的甲長、甲寬顯著低于F3S組和F組（P＜0.05）（圖6-C，D）。此外，F(xiàn)1S組Ⅰ期仔蟹的發(fā)育時間相比于其他處理組顯著延長（P＜0.05）（表2）。

表2 投喂-饑餓處理對Ⅰ期仔蟹發(fā)育時間的影響Tab.2 Effects of feeding-starvation treatment on development time of first juvenile

圖5 Ⅰ期仔蟹的PRS擬合曲線Fig.5 PRS fitting curve of first juvenile

圖6 投喂-饑餓處理對Ⅰ期仔蟹的蛻皮率和新蛻皮的Ⅱ期仔蟹的增重率、個體大小的影響Fig.6 Effects of feeding-starvation treatment on molting rate of first juvenile and weight gain rate and body size of newly molted second juvenile

2.4 Ⅰ期仔蟹的PNR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Ⅰ期仔蟹PNR的擬合曲線方程是y=97.92／［1+e（2.02-x）／-0.32］（R2=0.999），PNR50值是2.01 d（圖7）。如圖8-A所示，S2F組和S3F組Ⅰ期仔蟹的蛻皮率顯著低于S1F組和F組（P＜0.05）。Ⅰ期仔蟹蛻皮后Ⅱ期仔蟹的增重率隨饑餓時間的延長逐步降低（圖8-B）。Ⅰ期仔蟹蛻皮后Ⅱ期仔蟹的甲長、甲寬顯著高于其他處理組（P＜0.05）（圖8-C，D）。隨著饑餓時間的增加，Ⅰ期仔蟹的發(fā)育時間逐漸延長，各饑餓-投喂組Ⅰ期仔蟹的發(fā)育時間差異顯著（P＜0.05）（表3）。

表3 饑餓-投喂處理對Ⅰ期仔蟹發(fā)育時間的影響Tab.3 Effects of starvation-feeding treatment on development time of first juvenile

圖7 Ⅰ期仔蟹的PNR擬合曲線Fig.7 PNR fitting curve of first juvenile

圖8 饑餓-投喂處理對Ⅰ期仔蟹的蛻皮率和新蛻皮的Ⅱ期仔蟹的增重率、個體大小的影響Fig.8 Effects of starvation-feeding treatment on molting rate of first juvenile and weight gain rate and body size of newly molted second juvenile

2.5 Ⅰ期仔蟹的NVI值

Ⅰ期仔蟹的PRS50和PNR50的值分別是0.90 d和2.01 d，NVI=0.45。

3 討論

3.1 饑餓對擬穴青蟹大眼幼體和Ⅰ期仔蟹蛻皮的影響

蛻皮過程作為十足目甲殼動物最重要的生理過程，其順利與否直接關(guān)乎十足目甲殼動物的生死存亡。本研究結(jié)果表明，長時間的饑餓明顯降低擬穴青蟹大眼幼體和Ⅰ期仔蟹的蛻皮率，但短時間的饑餓對Ⅰ期仔蟹的蛻皮率基本無影響。相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣見于相手蟹（Sesarma rectum）［17］和紅樹林蟹［9］的大眼幼體以及中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）［18］和 火 焰蝦（Lysmata debelius）［19］的Ⅰ期溞狀幼體。但同樣的規(guī)律并不適用于鞭藻蝦（Lysmataboggessi）［19］的Ⅰ期溞狀幼體以及巖蝦（Palaemonelegans）［20］和長臂蝦（Palaemonserratus）［20］的 十 足 幼 體。據(jù) 報道［19-20］，鞭藻蝦Ⅰ期溞狀幼體以及巖蝦和長臂蝦十足幼體的蛻皮率并不因饑餓時間的長短而發(fā)生變化，它們的蛻皮率均為100%。此外，即使是同一物種，不同的發(fā)育時期，饑餓對蛻皮率的影響也是迥然不同。研究表明［19］，鞭藻蝦Ⅱ期溞狀幼體的變態(tài)率與饑餓時間呈負(fù)相關(guān)，這與Ⅰ期溞狀幼體的結(jié)果截然不同。相似的現(xiàn)象同樣見于巖蝦和長臂蝦［20］。顯然，饑餓對甲殼動物蛻皮率的影響是與物種和發(fā)育時期密切相關(guān)的。

擬穴青蟹苗種培育過程中苗種的發(fā)育時間是判斷苗種是否處于健康狀態(tài)的重要指標(biāo)。擬穴青蟹大眼幼體的PRS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，投喂時間≥4 d時，大眼幼體的發(fā)育時間無顯著性變化，但長時間饑餓明顯延遲Ⅰ期仔蟹的發(fā)育時間。研究表明［12，17，19］，饑餓是否對發(fā)育時間產(chǎn)生顯著性影響主要取決于物種和物種所處的發(fā)育時期以及饑餓處理方式。據(jù)報道，相手蟹（Sesarma curacaoense）大眼幼體的PRS實(shí)驗(yàn)中饑餓顯著縮短大眼幼體的發(fā)育時間，而PNR實(shí)驗(yàn)中各組大眼幼體的發(fā)育時間卻無顯著性差異［17］。與相手蟹大眼幼體截然不同的是豆蟹（Fabiasubquadrata）大眼幼體的PRS實(shí)驗(yàn)中各組大眼幼體的發(fā)育時間無顯著性差異，但PNR實(shí)驗(yàn)中饑餓顯著延長大眼幼體的發(fā)育時間［12］。顯然，物種的不同和處理方式的差異是造成相手蟹和豆蟹實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的主要原因。但是，即使是同一物種、同一種饑餓處理方式，發(fā)育時期不同，饑餓對發(fā)育時間的影響也是大相徑庭的。以鞭藻蝦為例，饑餓-投喂處理，Ⅰ期溞狀幼體的發(fā)育時間無顯著性變化，但Ⅱ期溞狀幼體的發(fā)育時間卻明顯延長［19］。同樣發(fā)育時期的不同很可能也是本文大眼幼體發(fā)育時間的變化趨勢與Ⅰ期仔蟹不同的主要原因。

3.2 饑餓對擬穴青蟹大眼幼體和Ⅰ期仔蟹蛻皮后生長的影響

饑餓迫使甲殼動物必須利用自身儲存的能量物質(zhì)以維持自身的生理代謝。據(jù)報道，三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）［21］和鋸緣青蟹［22］Ⅰ期溞狀幼體處于饑餓狀態(tài)下時，體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂類的含量持續(xù)下降。十足目甲殼動物能量物質(zhì)的減少直接導(dǎo)致體質(zhì)量的降低。本文研究結(jié)果表明，饑餓明顯降低擬穴青蟹大眼幼體和Ⅰ期仔蟹蛻皮后Ⅰ期仔蟹和Ⅱ期仔蟹的體質(zhì)量。據(jù)報道，遠(yuǎn)海梭子蟹［23］Ⅰ期溞狀幼體和凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）［24］仔蝦的干重隨饑餓時間的延長逐步降低。此外，黑爪蟹大眼幼體的PRS實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)組大眼幼體蛻皮后Ⅰ期仔蟹的干重顯著高于S組、F3S組和F6S組，但與F9S組和F12S組卻無顯著性差異［12］，本文擬穴青蟹大眼幼體變化趨勢與其一致。形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)表明，饑餓導(dǎo)致擬穴青蟹大眼幼體和Ⅰ期仔蟹蛻皮后Ⅰ期仔蟹和Ⅱ期仔蟹的甲長、甲寬明顯縮短。相應(yīng)的，三疣梭子蟹Ⅰ期溞狀幼體蛻皮后Ⅱ期溞狀幼體的頭胸甲長與饑餓時間呈負(fù)相關(guān)［25］，而寶石蟹大眼幼體蛻皮后Ⅰ期仔蟹的甲長、甲寬也隨饑餓時間的延長而逐步縮?。?1］。顯然，饑餓與十足目甲殼動物的形態(tài)學(xué)變化緊密相關(guān)。

3.3 擬穴青蟹大眼幼體和Ⅰ期仔蟹的耐饑餓能力

擬穴青蟹大眼幼體的PRS50值是3.57 d，而心型仿招潮蟹和紅樹林招潮蟹大眼幼體的PRS50值分別是2.09 d和2.4 d［9-10］。三者比較而言，擬穴青蟹大眼幼體的耐饑餓能力相對較低。此外，初始饑餓2 d時，擬穴青蟹大眼幼體的存活率僅為（30.00±13.23）%，這提示對于新蛻殼的擬穴青蟹大眼幼體必須給予充足的餌料以確保高的存活率，此措施對于提高苗種產(chǎn)量至關(guān)重要。

營養(yǎng)脆弱性指數(shù)（NVI）是衡量甲殼動物饑餓耐受性的重要指標(biāo)，NVI≤0.5時表示甲殼動物對外源食物依賴性低；0.5＜NVI＜1.0時表示甲殼動物對外源食物中度依賴；NVI≥1.0時表示甲殼動物對外源食物高度依賴［9-10，17，26］。十足目甲殼動物的NVI值與個體大小和發(fā)育時期密切相關(guān)。據(jù)報道，蜘蛛蟹（Stenorhynchusseticornis）Ⅰ期溞狀幼 體 的NVI值 為2.2［26］。兩 種 相 手 蟹（Sesarmacuracaoense、Sesarmarectum）［17］和心型仿招潮蟹［10］大眼幼體的NVI值分別是0.2、0.13和0.33。本研究中擬穴青蟹Ⅰ期仔蟹的NVI值為0.45（＜0.5），這表明擬穴青蟹Ⅰ期仔蟹對外源食物依賴性低。

本文分析了不同饑餓處理對擬穴青蟹大眼幼體和Ⅰ期仔蟹蛻皮率、蛻皮后的個體大小以及發(fā)育時間的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，新蛻皮的擬穴青蟹大眼幼體必須給予充足的餌料才可確保高的存活率，大眼幼體投喂的第6天可以適當(dāng)減少餌料的投喂量。Ⅰ期仔蟹的耐饑餓能力明顯強(qiáng)于大眼幼體。此外，Ⅰ期仔蟹作為擬穴青蟹苗種出售的主要階段，運(yùn)輸途中短時間的饑餓不可避免，而本文證實(shí)短時間的饑餓對Ⅰ期仔蟹的蛻殼和生長影響相對較小，這為生產(chǎn)上以Ⅰ期仔蟹、而非以大眼幼體作為主要出售階段提供了理論依據(jù)。