基于線(xiàn)粒體全基因組結(jié)構(gòu)的鯧屬魚(yú)類(lèi)分子分類(lèi)研究

閆永斌，程起群

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306）

鯧屬（Pampus）魚(yú)類(lèi)隸屬于硬骨魚(yú)綱（Osteichthyes），鱸 形 目（Perciformes），鯧 科（Stromateidae），是世界上，特別是印度太平洋海域 的 重 要 海 洋 經(jīng) 濟(jì) 魚(yú) 類(lèi)［1］。1758年，LINNAEUS［2］建立鯧屬（原屬名Stromateus），將鯧魚(yú)定名為Stromateusfiatola，于是在最初階段，是以Stromateus作為鯧屬的屬名；后經(jīng)FOWLER［3］更正，將鯧屬改名為Pampus，此后，Pampus作為鯧屬屬名一直被沿用至今［3-4］

自鯧屬建立以來(lái)，其分類(lèi)問(wèn)題一直存在不同的觀點(diǎn)，至今尚未統(tǒng)一。研究初期主要依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行分類(lèi)，依次經(jīng)歷了“兩種說(shuō)”、“三種說(shuō)”、“五種說(shuō)”、“六種說(shuō)”和“八種說(shuō)”。例如REGAN［5］依據(jù)尾鰭形態(tài)特征將鯧屬分為兩個(gè)種：即尾鰭為截形或淺叉形的中國(guó)鯧（P.chinensis）和尾鰭深叉形、下葉延長(zhǎng)的灰鯧（P.cinereus）。HAEDRICH［6］根據(jù)鰭的形態(tài)、鰭條鰭棘數(shù)目、脊椎骨數(shù)目、鰓耙數(shù)目等特征，將鯧屬分為3個(gè)種，即：中國(guó)鯧、銀鯧（P.argenteus）和高麗鯧（P.echinogaster），并視灰鯧為銀鯧的同物異名。成慶泰和鄭葆珊［7］根據(jù)鰭和吻的形態(tài)特征，將中國(guó)沿海鯧屬魚(yú)類(lèi)分為3個(gè)種：燕尾鯧（P.nozawae）、銀鯧和中國(guó)鯧；鄧思明等［8］依據(jù)側(cè)線(xiàn)管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、耳石結(jié)構(gòu)及食道側(cè)囊特征，朱元鼎［9］基于鰭的形態(tài)和顏色、頭部后上方側(cè)線(xiàn)管的形態(tài)特征以及脊椎骨數(shù)目，也都將鯧屬分為3種，即銀鯧、灰鯧和中國(guó)鯧。后LIU和LI［10］根據(jù)最大體長(zhǎng)、鰭的形狀、耳石和脊椎骨數(shù)等形態(tài)特征發(fā)表了鯧屬魚(yú)類(lèi)一新種——珍鯧（P.minor），并根據(jù)鰓耙、幽門(mén)盲囊、耳石、側(cè)線(xiàn)管、頭顱、脊椎骨等形態(tài)特征，進(jìn)一步將中國(guó)沿海鯧屬魚(yú)類(lèi)分為5個(gè)種，即銀鯧、翎鯧（P.punctatissimus）、灰鯧、中國(guó)鯧和珍鯧［4］。2013年，LIU和LI［11］又報(bào)道了分布于中國(guó)東南沿海鯧科鯧屬的一新種——?jiǎng)⑹霄K（P.liuorum），該魚(yú)從吻的形狀、鰓耙的數(shù)量和形狀、脊椎骨數(shù)、胸鰭比例和眼徑大小等方面與其他鯧魚(yú)區(qū)別開(kāi)來(lái)，認(rèn)為這是鯧屬的第6個(gè)種，但其有效性存疑［12-13］。而JAWAD和JIG［1］通過(guò)研究鯧屬魚(yú)類(lèi)軸向骨架的7個(gè)骨骼特征，將鯧屬分為8個(gè)種：銀鯧、鐮鯧、翎鯧、灰鯧、中國(guó)鯧、珍鯧、劉氏鯧和燕尾鯧。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記也被用于物種鑒別，CUI等［14］利用線(xiàn)粒體16S rRNA和COI基因的部分序列，將鯧屬分為5個(gè)物種：中國(guó)鯧、灰鯧、珍鯧、翎鯧和未定名新種（Pampussp.）。YIN等［12］根據(jù)核基因標(biāo)記將鯧屬分為中國(guó)鯧、灰鯧、銀鯧、翎鯧和珍鯧。李淵［15］基于形態(tài)和DNA條形碼的綜合分析，認(rèn)為鯧屬魚(yú)類(lèi)有6種，即銀鯧、鐮鯧、翎鯧、灰鯧、中國(guó)鯧和珍鯧；并認(rèn)為前人所研究的分布于黃海、東海和渤海的“銀鯧”實(shí)際上是鐮鯧，而真正的銀鯧分布于臺(tái)灣海峽以南。

總體而言，鯧屬魚(yú)類(lèi)分類(lèi)存在以下問(wèn)題：1）鯧屬魚(yú)類(lèi)存在幾個(gè)有效物種？2）銀鯧與鐮鯧的分類(lèi)關(guān)系如何？3）灰鯧和翎鯧是否為同一物種？4）缺乏有效的鯧屬魚(yú)類(lèi)種間的分子鑒別標(biāo)記。

線(xiàn)粒體基因組目前已被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育及物種間鑒別研究，因?yàn)樗群薉NA進(jìn)化速率快，導(dǎo)致其在近緣種間的差異較大，易于識(shí)別［16］。線(xiàn)粒體基因組的大小通常在15～20 kb，一般包含2個(gè)核糖體RNA基因（ribosomal RNAs，rRNAs），13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（protein-coding genes，PCGs），22個(gè)轉(zhuǎn)移RNA基因（transfer RNAs，tRNAs）和非編碼控制區(qū)（control region，CR或D-loop）［17］。其中，RNA基因進(jìn)化速率最慢，D-loop區(qū)最快，而細(xì)胞色素b（cytochrome b，Cytb）和NADH脫氫酶亞基（NADH dehydrogenase subunit，ND）基因進(jìn)化速率適中［18-20］，16S核糖體RNA基因（16S rRNA）和細(xì)胞色素C氧化酶第一亞基（cytochrome c oxidase subunit I，COI）基因標(biāo)記常被用作DNA條形碼，用于鑒定形態(tài)相似的近緣種。DNA條形碼（DNA barcoding）是一段短的、標(biāo)準(zhǔn)化的DNA序列，于2003年被HEBERT首次提出，由于其既具有穩(wěn)定的種內(nèi)保守性，又包含足夠的種間遺傳變異而被用于物種的分子鑒定［21］。

本研究測(cè)定了鯧屬魚(yú)類(lèi)5個(gè)物種的線(xiàn)粒體全基因組序列，并結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的鯧屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體全基因組序列，進(jìn)行綜合分析，以期為解決鯧屬魚(yú)類(lèi)分類(lèi)學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)及種間鑒別上的問(wèn)題提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及組織DNA提取

采集5種鯧屬魚(yú)類(lèi)樣本（銀鯧、灰鯧、翎鯧、中國(guó)鯧和珍鯧），樣本信息見(jiàn)表1。所有樣本均按照形態(tài)和解剖學(xué)特征進(jìn)行分類(lèi)［4，7，22］。每個(gè)樣本分別取其肌肉組織，采用常規(guī)的苯酚-氯仿法提取基因組DNA，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)所用的樣本信息Tab.1 Information of samples used in this study

1.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增、測(cè)序

依據(jù)NCBI已公布的鯧屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體全基因組序列（序列登錄號(hào)見(jiàn)表2），應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，所有特異性引物均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

除珍鯧的ZC06和ZC08引物外，其余所有引物的PCR擴(kuò)增體系為：12.5μL 2×PCRTaqPCR Master Mix，10μmol·L-1的引物各1μL，20 ng·μL-1的DNA模板1μL，最后加雙蒸水至混合液總體積為25μL。反應(yīng)條件：在94℃時(shí)預(yù)變性5 min；然后循環(huán)35次，每一個(gè)循環(huán)包含94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸60 s；最后在72℃下延伸8 min。

珍鯧的引物ZC06和ZC08由于其擴(kuò)增產(chǎn)物片段過(guò)長(zhǎng)（分別為5 641 bp和3 292 bp），采用長(zhǎng)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為2.5μL 10×Long PCR buffer with 15mM MgCl2，2.5 mmol·L-1的dNTP Mix 2μL，5 U·μL-1的Long PCR Enzyme Mix 0.25μL，10μmol·L-1的引物各1μL，20 ng·μL-1的DNA模板1μL，最后加雙蒸水直至混合液的總體積為25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋涸?4℃時(shí)預(yù)變性2 min；然后循環(huán)35次，每一個(gè)循環(huán)包含94℃變性45 s，60℃退火50 s，68℃延伸4～8 min；最后在68℃下延伸10 min。

在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，并在復(fù)日FR980凝膠電泳成像系統(tǒng)中拍照來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，送上海桑尼生物技術(shù)有限公司雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DNASTAR、CHROMAS、MEGA等軟件，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接、注釋?zhuān)@得鯧屬魚(yú)類(lèi)完整的線(xiàn)粒體全基因組序列，并提交至GenBank（序列登錄號(hào)見(jiàn)表2）；確定線(xiàn)粒體基因組上13個(gè)PCG、2個(gè)rRNA基因以及D-loop區(qū)的相應(yīng)位置［23-24］，通過(guò)tRNAscan-SE 1.21［25］確定大部分tRNA基因，其他不能確定的tRNA基因通過(guò)相關(guān)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖及反密碼子來(lái)確定［26-27］。

表2 鯧屬魚(yú)類(lèi)引物設(shè)計(jì)模板序列及所測(cè)序列NCBI登錄號(hào)Tab.2 Accession numbers of templates and sequencing sequences

1.4 序列分析

1.4.1 線(xiàn)粒體全基因組特征

目前NCBI網(wǎng)站中只有6種鯧屬魚(yú)類(lèi)的線(xiàn)粒體全基因組序列，即銀鯧、灰鯧、翎鯧、中國(guó)鯧、珍鯧和鐮鯧，本研究測(cè)定了除鐮鯧外其余5種鯧魚(yú)的線(xiàn)粒體全基因組序列，因此下載鐮鯧線(xiàn)粒體全基因組序列（GenBank登錄號(hào)NC_023258），用于綜合分析鯧屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體全基因組序列特征及差異。

利用MEGA［28］軟件分析每個(gè)物種線(xiàn)粒體基因組全序列的長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)和基因排布；以及每個(gè)基因位點(diǎn)的變異率、遺傳距離和堿基含量等信息。

1.4.2 控制區(qū)結(jié)構(gòu)及特征分析

對(duì)于6種鯧魚(yú)的控制區(qū)（D-loop）序列，參考前人的方法，尋找控制區(qū)序列特有結(jié)構(gòu)并進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述［29］和串聯(lián)重復(fù)篩選［30］。

1.4.3 置信度分析

從NCBI網(wǎng)站下載所有已命名的鯧屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體全基因組序列，分別提取其PCG序列進(jìn)行置信度分析。利用MEGA中的鄰接法（neighborjoining，NJ），以Kimura 2-parameter（K-2-P）模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（bootstrap=1 000），評(píng)估PCG標(biāo)記對(duì)鯧屬魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)進(jìn)化分析的適用性［31］。該方法主要依據(jù)構(gòu)建NJ樹(shù)的過(guò)程中bootstrap獲取的置信度高低判斷系統(tǒng)樹(shù)的可靠性，計(jì)算得到單一序列構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的置信度和以及堿基信息量（置信度和／序列長(zhǎng)度），比較分析基因組的不同區(qū)域在系統(tǒng)進(jìn)化分析中的適用性。

1.4.4 DNA條形碼分析

根據(jù)置信度以及線(xiàn)粒體每個(gè)基因位點(diǎn)變異率的結(jié)果，選取適合的基因標(biāo)記進(jìn)行DNA微型條形碼（mini-barcodes）分析［32］。在NCBI網(wǎng)站下載鯧屬魚(yú)類(lèi)相應(yīng)基因的剩余序列，增加分析結(jié)果的可靠性，共獲得18條序列（表3）。將所有序列進(jìn)行比對(duì)，篩選合適的同源序列片段進(jìn)行DNA條形碼分析，并將該片段從5′端到3′端平均分成3或6個(gè)小片段，即總共9塊區(qū)域，進(jìn)行微型條形碼分析。微型條形碼的篩選參考RASMUSSEN等［32］的標(biāo)準(zhǔn)：1）原始條形碼序列長(zhǎng)度必須大于500 bp；2）微型條形碼序列中不能有間斷點(diǎn)。

表3 鯧屬魚(yú)類(lèi)DNA條形碼分析序列Tab.3 Sequences of Pampus fishes used for DNA barcode analysis

利用DAMBE軟件［33］對(duì)DNA條形碼進(jìn)行替換飽和性檢驗(yàn)，使用MEGA軟件［28］進(jìn)行以下分析：對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)；計(jì)算條形碼的堿基組成、保守位點(diǎn)數(shù)、變異位點(diǎn)數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、轉(zhuǎn)換（transition）和顛換（transversion）頻率的比值；基于各候選條形碼，計(jì)算鯧屬魚(yú)類(lèi)各物種種間和種內(nèi)遺傳距離，比較種間和種內(nèi)遺傳距離，篩選出可用于區(qū)分鯧屬魚(yú)類(lèi)的最適DNA條形碼。

1.4.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA軟件［28］，選擇刺鯧屬魚(yú)類(lèi)刺鯧（Psenopsisanomala）作為外群，利用線(xiàn)粒體全基因組以及所篩選的DNA條形碼對(duì)鯧屬魚(yú)類(lèi)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線(xiàn)粒體全基因組基本特征

6種鯧屬魚(yú)類(lèi)的線(xiàn)粒體全基因組全長(zhǎng)在16 551 bp到18 062 bp之間，都含有2個(gè)rRNA基因（16SrRNA和12SrRNA）和13個(gè)PCGs?；姻K、翎鯧和中國(guó)鯧分別含有22個(gè)tRNA基因，而銀鯧、鐮鯧和珍鯧分別含有23個(gè)tRNA基因（銀鯧和鐮鯧多了1個(gè)tRNAMet，珍鯧多了1個(gè)tRNAPro）。同時(shí)，在線(xiàn)粒體全基因組組成上，珍鯧有2個(gè)D-loop區(qū)，而其余5種魚(yú)分別只有1個(gè)Dloop區(qū)。銀鯧、鐮鯧、灰鯧、翎鯧和中國(guó)鯧的線(xiàn)粒體基因組結(jié)構(gòu)和分布特征大體是一致的，基本符合硬骨魚(yú)線(xiàn)粒體基因組結(jié)構(gòu)和分布特征，而珍鯧在16SrRNA-tRNAIle區(qū)域發(fā)生了ND1的重排，并且出現(xiàn)了額外的tRNAPro和D-loop區(qū)。

由表4可以看出，6條線(xiàn)粒體全基因組序列（不含D-loop區(qū)）經(jīng)比對(duì)獲得一致序列長(zhǎng)度為11 901 bp，其中變異位點(diǎn)3 950個(gè)，占所有位點(diǎn)數(shù)的33.2%，發(fā)生轉(zhuǎn)換1 311次，顛換602次，轉(zhuǎn)換顛換比為2.2。

鯧屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因組序列、PCGs序列以及tRNA拼接序列的G含量均比其他堿基低，表現(xiàn)出明顯的堿基偏好性，但是rRNA序列中T的含量小于或等于G的含量。13個(gè)PCGs中，ATP8的變異程度和遺傳距離最大（分別為43.5%、0.305），其次是ATP6（43.1%、0.303），變異程度和遺傳距離最小的是ND4L（21.2%、0.119）。rRNA和tRNA均表現(xiàn)出較小的變異程度和遺傳距離，尤其是tRNA拼接序列，變異程度（12.9%）和遺傳距離（0.067）在所有基因中最低（表4）。

表4 鯧屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因組及不同區(qū)域的保守序列長(zhǎng)度、變異位點(diǎn)數(shù)（比例）、遺傳距離和堿基組成Tab.4 Length of consensus sequences，number of variable sites，genetic distances and base composition of mitochondrial genomes of different regions of 6 Pampus fishes

2.2 控制區(qū)結(jié)構(gòu)及特征

鯧屬魚(yú)類(lèi)的D-loop區(qū)位于tRNAPro和tRNAPhe基因序列之間（本研究珍鯧有一重復(fù)D-loop區(qū)序列在tRNAPro和tRNALeu之間），確定長(zhǎng)度為831～1 928 bp。銀鯧、鐮鯧含有1個(gè)終止序列區(qū)（TAS），而中國(guó)鯧與珍鯧有2個(gè)終止序列區(qū)（TAS），翎鯧和灰鯧有3個(gè)終止序列區(qū)（TAS）。6種鯧魚(yú)都含有1個(gè)中央保守結(jié)構(gòu)域（CSB-D，E，F(xiàn)），除珍鯧外都具有3個(gè)保守序列塊CSB1、CSB2、CSB3。

銀鯧D-loop區(qū)包括5個(gè)含有CSB3和啟動(dòng)子的串聯(lián)重復(fù)序列（715～1 328），而鐮鯧D-loop區(qū)包括10個(gè)含有CSB3的串聯(lián)重復(fù)序列（719～1 924），灰鯧與翎鯧D-loop區(qū)的串聯(lián)重復(fù)片段完全一致，都具有兩種片段，分別在位點(diǎn)19～59、37～78之間，重復(fù)片段的前兩段完全一致，最后一段由于核苷酸的缺失而不完整。中國(guó)鯧D-loop區(qū)包含一種重復(fù)序列，在位點(diǎn)17～60之間。珍鯧D-loop區(qū)無(wú)重復(fù)序列。

2.3 置信度分析

在13個(gè)PCGs中，由于ND6基因的堿基組成與其他基因存在明顯差異且在系統(tǒng)發(fā)育建樹(shù)分析中的效果較差［34］，因此暫不考慮，其余基因結(jié)果見(jiàn)表5，由表5可知，對(duì)于COXII、ATP8、ATP 6、ND4L等基因，雖然單堿基的信息量較高，但置信度和較低，無(wú)法形成可靠的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，所以也暫不考慮。除這些基因外，置信度和最高的是COXI基因（N=985），隨后是ND1、ND3、COX III、ND2基因，單堿基信息量最大的是ND3基因（N／L=2.7192），隨后4個(gè)是COXIII、ND1、ND2、COXI基因。綜合考慮，對(duì)于鯧屬魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)進(jìn)化分析，線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)編碼基因的適用情況為：最好的是ND3和COXIII，其次是ND1和ND2，較差的是COXII、ATP8、ATP6、ND4L、ND5，其他基因表現(xiàn)一般。

表5 鯧屬線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)編碼基因組構(gòu)建的NJ樹(shù)的置信度分析Tab.5 Bootstrap values analysis of NJ trees built based on different regions in mitochondrial genomes of Pampus fishes

2.4 DNA條形碼分析

根據(jù)基因標(biāo)記變異率和置信度分析結(jié)果，綜合考慮，選取ND2基因作為DNA條形碼對(duì)鯧屬魚(yú)類(lèi)進(jìn)行分析鑒定。將18條基因序列通過(guò)Clustal W［23］方法進(jìn)行多重序列比對(duì)，最終選取了一段長(zhǎng)為633 bp的同源序列作為完整條形碼進(jìn)行分析，如表6所示，這段序列中，腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鳥(niǎo)嘌呤（G）的平均含量分別為30.6%、27.5%、29.1%、12.7%，A+T明顯大于C+G，這符合后生動(dòng)物線(xiàn)粒體基因堿基組成偏移性的特點(diǎn)［16］。3個(gè)密碼子中A+T的含量差別較大，其中第三位點(diǎn)的A+T含量最高，達(dá)到66.1%，第一、第二位點(diǎn)的A+T含量分別為51.1%、57.2%。

表6 鯧屬魚(yú)類(lèi)ND2序列堿基分布頻率Tab.6 Nucleotide frequencies of ND2 sequences in Pampus fishes

條形碼序列的核苷酸變異分析見(jiàn)表7，如表7所示，這633個(gè)位點(diǎn)中分別有416個(gè)保守位點(diǎn)（conserved sites）、217個(gè)變異位點(diǎn)（variable sites）和211個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（parsimony informative sites）。變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)主要集中在序列的第三位點(diǎn)上，分別占兩者總和的65.9%和65.4%，而第一和第二位點(diǎn)較保守。

表7 鯧屬魚(yú)類(lèi)ND2序列核苷酸變異情況Tab.7 Sequence variation of ND2 gene in Pampus fishes

DAMBE軟件［33］對(duì)DNA條形碼序列進(jìn)行替換飽和性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，序列未飽和，可進(jìn)行建樹(shù)分析。建樹(shù)分析結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1可知，鯧屬魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的聚類(lèi)十分混亂，可能是由于NCBI網(wǎng)站上的序列被錯(cuò)誤的鑒別導(dǎo)致，并且灰鯧沒(méi)有形成明顯的分支，因此本實(shí)驗(yàn)將混亂的序列進(jìn)行重新分類(lèi)，暫將其假設(shè)為其他物種，以便進(jìn)行后續(xù)分析，假設(shè)的序列見(jiàn)表8。

表8 假設(shè)序列Tab.8 Hypothetical sequence

圖1 基于ND2基因片段采用NJ法構(gòu)建的鯧屬系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic relationship tree of Pampus fishes built based on partial sequences of ND2 gene by using neighbor-joining method

將完整條形碼5′端到3′端平均分成3或6個(gè)小片段，每個(gè)片段長(zhǎng)為211 bp或105 bp，總共9個(gè)微型條形碼區(qū)域。通過(guò)MEGA軟件，采用K-2-P模型計(jì)算各條形碼對(duì)應(yīng)的平均種內(nèi)遺傳距離和平均種間遺傳距離。由表9可知，微型條形碼變異位點(diǎn)占所有位點(diǎn)比為27.62%～39.05%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)占比為26.67%～39.05%。除微型條形碼105-2和105-4外，其他微型條形碼序列的變異情況與完整條形碼相差不大。HEBERT等［21］通過(guò)COXI條形碼序列對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行鑒定，結(jié)合其他動(dòng)物類(lèi)群的相關(guān)研究，提出“10×”的閾值規(guī)則，即種間平均遺傳距離大于種內(nèi)平均遺傳距離的10倍的標(biāo)準(zhǔn)用于區(qū)分物種。本研究中的10個(gè)條形碼的平均種間距離是種內(nèi)遺傳距離的18～40倍，說(shuō)明每個(gè)條形碼都具有鑒定鯧屬魚(yú)類(lèi)的潛力。

表9 鯧屬魚(yú)類(lèi)完整條形碼與微型條形碼比較Tab.9 A comparison of full-length barcode and mini-barcodes of Pampus fishes

當(dāng)物種間的種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離，即可判定該物種存在條形碼間隙（barcode gap）。條形碼間隙是否存在決定了該條形碼能否有效鑒別物種。研究通過(guò)MEGA軟件，采用K-2-P模型計(jì)算了6個(gè)鯧屬魚(yú)類(lèi)的種內(nèi)遺傳距離及它們與其他所有個(gè)體兩兩間的遺傳距離。圖2中直線(xiàn)表示1∶1比例線(xiàn)，當(dāng)數(shù)據(jù)點(diǎn)高于比例線(xiàn)時(shí)，說(shuō)明種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離，即存在條形碼間隙；反之，說(shuō)明此條形碼不能用于區(qū)分該物種與其他物種。

由圖2得知，所有條形碼的數(shù)據(jù)點(diǎn)均在1∶1比例線(xiàn)之上，存在條形碼間隙，說(shuō)明所有微型條形碼均可以有效區(qū)分不同的物種。優(yōu)質(zhì)的條形碼還應(yīng)使各物種的種內(nèi)遺傳距離盡可能小，并使物種間的遺傳距離盡可能大，以保證鑒定結(jié)果的可信度。比較得知，長(zhǎng)度為211 bp的微型條形碼中，211-2區(qū)分效果最佳；長(zhǎng)度為105 bp的微型條形碼中，105-3最佳。

圖2 鯧屬魚(yú)類(lèi)ND2序列條形碼間隙Fig.2 Barcode gaps of ND2 sequences in Pampus fishes

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

線(xiàn)粒體全基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖3可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的序列中，銀鯧與NCBI網(wǎng)站的鐮鯧聚為一組，灰鯧與翎鯧聚為一組；在全部鯧屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因序列中，灰鯧的兩條基因組序列一條與翎鯧分為一組，一條與銀鯧聚為一組，剩余鯧屬魚(yú)類(lèi)形成了較為可信的分支。

圖3 基于線(xiàn)粒體全基因組采用ML法構(gòu)建的鯧屬系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic relationship tree of Pampus fishes built based on whole mitochondrial genome sequences by using maximum likelihood method

DNA條形碼建樹(shù)結(jié)果如圖4，完整條形碼以刺鯧為外群進(jìn)行建樹(shù)分析。由圖4可知，鯧屬魚(yú)類(lèi)DNA條形碼的聚類(lèi)結(jié)果與全基因組聚類(lèi)分化結(jié)果大致相同，不同點(diǎn)在于全基因組發(fā)育樹(shù)中珍鯧與鐮鯧聚為一支，而在完整條形碼發(fā)育樹(shù)中，鐮鯧最先分化出來(lái)。

圖4 基于ND2條形碼采用ML法構(gòu)建的鯧屬系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic relationship tree of Pampus fishes built based on ND2 DNA barcode sequences by using maximum likelihood method

3 討論

鯧屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因組結(jié)構(gòu)與硬骨魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因組結(jié)構(gòu)相似，通常情況下，包含13個(gè)PCGs、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因和一個(gè)Dloop區(qū)。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的銀鯧線(xiàn)粒體基因組出現(xiàn)了一個(gè)重復(fù)的tRNAMet結(jié)構(gòu)，而NCBI網(wǎng)站的基因數(shù)據(jù)庫(kù)中鐮鯧（KF373560）的線(xiàn)粒體基因組同樣包含一個(gè)tRNAMet結(jié)構(gòu)，CUI等［35］在Pampussp.的線(xiàn)粒體基因組中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)構(gòu)，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的聚類(lèi)結(jié)果，這3條序列可能屬于同一物種。另外，珍鯧在16S rRNA-tRNAIle區(qū)域發(fā)生了ND1的重排，而且出現(xiàn)了額外的tRNAPro和Dloop區(qū)，其他鯧屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體基因組中沒(méi)有這種現(xiàn)象，并且NCBI網(wǎng)站的基因數(shù)據(jù)庫(kù)中珍鯧（MH037007）的基因組也沒(méi)有這種結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生這種情況的原因還需進(jìn)一步研究。

3.1 銀鯧與鐮鯧的關(guān)系

銀鯧在1788年首次被EUPHRSSEN提出并進(jìn)行了描述［36］，由于僅有一尾樣品，導(dǎo)致很多特征描述的并不詳實(shí)，很難進(jìn)行準(zhǔn)確的物種鑒別。近年來(lái)，有許多研究從形態(tài)特征對(duì)銀鯧進(jìn)行了分類(lèi)描述，可以將其與其他鯧屬魚(yú)類(lèi)區(qū)分開(kāi)來(lái)，然而根據(jù)這些特征無(wú)法將其與鐮鯧區(qū)分開(kāi)來(lái)，李淵［15］認(rèn)為前人所研究的銀鯧實(shí)際為鐮鯧，而真正的銀鯧分布于臺(tái)灣海峽以南；DIVYA等［37］認(rèn)為銀鯧與鐮鯧在分子鑒定中沒(méi)有達(dá)到種間標(biāo)準(zhǔn)，屬于同一物種；YIN等［12］通過(guò)COXI基因標(biāo)記研究也認(rèn)為分布于中國(guó)東海的銀鯧與鐮鯧為同一物種。在本研究的結(jié)果中，所測(cè)銀鯧序列與已有的鐮鯧序列具有相同的重復(fù)結(jié)構(gòu)，兩條序列在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚為一支，且采集地點(diǎn)均為東海，而其他銀鯧的序列聚為另一支，采集地點(diǎn)為南海，這說(shuō)明李淵［15］與YIN等［12］的觀點(diǎn)可能是正確的。即分布于東海的銀鯧與鐮鯧為同一物種，真正的銀鯧分布于臺(tái)灣海峽以南。

3.2 灰鯧與翎鯧的關(guān)系

1795年，BLOCH首次對(duì)灰鯧進(jìn)行描述，但沒(méi)有進(jìn)行詳細(xì)的分類(lèi)特征描述，對(duì)灰鯧標(biāo)本的采樣地點(diǎn)也并未記錄，因此對(duì)原始標(biāo)本的具體描述并不能詳盡的給出［38］。翎鯧于1845年首次被TEMMINCK和SCHLEGEL描述，采集于日本長(zhǎng)崎，但是所有描述是基于2尾鰭有損壞的樣本，且僅對(duì)鰭式、鱗片、吻部特征和頭部橫枕管等進(jìn)行簡(jiǎn)單描述，遺漏了很多重要的特征如鰓耙、脊椎骨數(shù)等，之后一直被學(xué)者認(rèn)為是銀鯧的同物異名［15］。1998年，LIU和LI［10］將翎鯧列為鯧屬魚(yú)類(lèi)的一種。而在本實(shí)驗(yàn)中，所測(cè)得的灰鯧與翎鯧的線(xiàn)粒體基因組序列十分相似，DNA條形碼結(jié)果表示其種間距離基本為0，可判斷屬于同一物種。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果，兩條灰鯧基因組序列一條與翎鯧聚為一支，一條與銀鯧聚為一支，沒(méi)有形成獨(dú)立的分支，因此灰鯧的物種有效性有待商榷，其可能與翎鯧為同一物種，還需結(jié)合形態(tài)

特征進(jìn)行綜合分析判斷。

3.3 鯧屬的物種數(shù)及鑒定方法

鯧屬的種類(lèi)劃分問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者說(shuō)法不一，且經(jīng)歷了多個(gè)時(shí)期［4］，目前，在世界魚(yú)類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)（FishBase）中有5種鯧屬魚(yú)類(lèi)［39］：銀鯧、中國(guó)鯧、鐮鯧、翎鯧和珍鯧。但是在魚(yú)類(lèi)目錄中有8種鯧魚(yú)［40］，除上述5種外，新增了燕尾鯧、劉氏鯧和灰鯧。燕尾鯧在一些研究中被認(rèn)為是灰鯧的同物異名［41］，但JAWAD和JIG［1］根據(jù)對(duì)軸向骨7個(gè)骨骼特征的研究，認(rèn)為燕尾鯧是一個(gè)獨(dú)立的物種。劉氏鯧作為一新種，其研究較少，JAWAD和JIG［1］認(rèn)為其為有效種，而YIN等［12］通過(guò)對(duì)其線(xiàn)粒體及核基因的研究，認(rèn)為其為無(wú)效種，因此還需進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，灰鯧可能為翎鯧的同物異名。因此，目前鯧屬魚(yú)類(lèi)可確定的物種僅有5種，即銀鯧、中國(guó)鯧、鐮鯧、翎鯧和珍鯧，而其余鯧魚(yú)的有效性存在爭(zhēng)議。鯧屬魚(yú)類(lèi)的鑒定由于其形態(tài)上的相似性，導(dǎo)致根據(jù)外觀很難鑒別，因此較為準(zhǔn)確的方法是通過(guò)比較基因序列進(jìn)行鑒定，CUI等［14］通過(guò)對(duì)鯧屬魚(yú)類(lèi)的16S rRNA和COXI基因標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增分析，結(jié)合GenBank同源序列，對(duì)鯧屬魚(yú)類(lèi)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，將鯧屬魚(yú)類(lèi)分為了5個(gè)物種：中國(guó)鯧、灰鯧、珍鯧、翎鯧和Pampussp.。李淵［15］通過(guò)對(duì)6種鯧屬魚(yú)類(lèi)DNA條形碼進(jìn)行擴(kuò)增，提出了標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼，并對(duì)GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行糾正。本研究以ND2基因標(biāo)記作為DNA條形碼對(duì)鯧屬魚(yú)類(lèi)進(jìn)行了分子鑒別分析，結(jié)果表明，無(wú)論是完整的條形碼還是微型條形碼，均可以將不同種的鯧屬魚(yú)類(lèi)分辨開(kāi)來(lái)。

然而，DNA條形碼鑒定中閾值法的判定規(guī)則存在爭(zhēng)議，閾值法是在物種間能夠形成DNA條形碼間隙的前提下，設(shè)定一個(gè)經(jīng)驗(yàn)遺傳距離作為閾值，當(dāng)個(gè)體間遺傳距離大于閾值時(shí)，可以鑒定為不同物種［42］。閾值法在DNA條形碼物種鑒定中發(fā)揮著重要作用。然而，隨著DNA條形碼的深入研究，發(fā)現(xiàn)不同物種及不同DNA條形碼區(qū)段的閾值難以統(tǒng)一定量［43］。因此CUI等［35］認(rèn)為可通過(guò)線(xiàn)粒體序列中的重復(fù)片段來(lái)鑒別不同的鯧魚(yú)，本研究中，所測(cè)東海區(qū)銀鯧序列中存在重復(fù)tRNAMet結(jié)構(gòu)，珍鯧存在重復(fù)D-loop結(jié)構(gòu)，且在5種鯧屬魚(yú)類(lèi)的控制區(qū)序列中，除珍鯧外均有重復(fù)串聯(lián)序列，這些序列特征可為鯧屬魚(yú)類(lèi)的鑒別提供參考。

另外研究發(fā)現(xiàn)，NCBI網(wǎng)站基因數(shù)據(jù)庫(kù)中一些序列存在錯(cuò)配情況，例如序列號(hào)為FJ434351的翎鯧序列，其存在與本研究中東海區(qū)銀鯧和鐮鯧相同的重復(fù)tRNAMet結(jié)構(gòu)，而其他翎鯧序列無(wú)此結(jié)構(gòu)，所以此序列明顯為鐮鯧或東海區(qū)銀鯧。其余序列也出現(xiàn)了類(lèi)似的情況，因此本研究對(duì)一些序列進(jìn)行了校正。

3.4 鯧屬的系統(tǒng)發(fā)育分析

關(guān)于鯧屬魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)發(fā)育分析，已有許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了研究，且結(jié)果不盡相同。劉靜等［44］根據(jù)分支系統(tǒng)學(xué)原理和方法，利用形態(tài)特征以刺鯧為外群對(duì)中國(guó)沿海鯧屬魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了分析，認(rèn)為珍鯧是最原始、最早分化出來(lái)的種；銀鯧也是較原始、分化較早的種；中國(guó)鯧是較特化的種；翎鯧和灰鯧是一對(duì)姐妹種。李淵［15］通過(guò)分子學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鯧屬魚(yú)類(lèi)的進(jìn)化屬于單系發(fā)生類(lèi)群，珍鯧和鐮鯧屬于較為原始的種類(lèi)，而剩余的4種鯧屬親緣關(guān)系較近，應(yīng)屬于晚分化的物種，翎鯧與中國(guó)鯧聚為一支，銀鯧和灰鯧處于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的頂端，代表著最新演化的種類(lèi)。YIN等［12］和CUI等［14］的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果一致，即分布于中國(guó)東海和黃海的銀鯧或鐮鯧為同一物種，與珍鯧聚為一支，為最先分化出的物種；翎鯧先與中國(guó)鯧聚為一支，之后再與灰鯧聚為一支，然后所有鯧屬魚(yú)類(lèi)聚為一支。本研究結(jié)果顯示，中國(guó)東海的銀鯧與鐮鯧為同一物種，與珍鯧聚為一支，為首先分化出的物種；翎鯧與中國(guó)鯧聚為一支，之后再與南海的銀鯧聚為一支。分子進(jìn)化結(jié)果與形態(tài)進(jìn)化結(jié)果之間不是完全吻合的，這可能是由各種類(lèi)間生活習(xí)性的趨同進(jìn)化所引起的。

綜上可知，中國(guó)東海區(qū)的銀鯧或鐮鯧與珍鯧是鯧屬魚(yú)類(lèi)中最先分化的物種，翎鯧和中國(guó)鯧為姐妹種，爭(zhēng)議點(diǎn)在于灰鯧是否為有效種以及南海區(qū)銀鯧的的系統(tǒng)發(fā)育地位，還需進(jìn)一步的研究。

致謝：張衡博士參與部分樣本采集，孫丹丹碩士參與部分實(shí)驗(yàn)，謹(jǐn)致謝忱。