饑餓對眼斑雙鋸魚幼魚形態(tài)特征的影響

王海山，葉 樂，陳 治，楊超杰，胡清雨

（1.海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院，海南三亞 572022；2.教育部熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)重點實驗室，海南三亞 572022）

魚類的形態(tài)是其重要的特征，在魚類育種工作中通常將某些形態(tài)指標(biāo)作為重要的選育指標(biāo)［1］，因此，采集魚類形態(tài)特征信息是魚類生態(tài)調(diào)查和育種的重要基礎(chǔ)工作。圖像分析系統(tǒng)的發(fā)展促進(jìn)了形態(tài)測量法的發(fā)展和多樣化，并擴大了使用形態(tài)測量法作為種群識別工具的潛力；使用多元技術(shù)，如主成分和判別分析來量化形態(tài)變量，在種群識別方面也受到越來越多的關(guān)注［2］。研究表明，由于生境［3-4］、性別［5-6］、生長發(fā)育階段［7-9］等方面的不同，魚類形態(tài)信息存在著種內(nèi)差異。在自然生境中，魚類常受到饑餓的脅迫，饑餓會影響魚類生長、生理、代謝、行為等方面，這些研究目前已經(jīng)較多見［10-12］，而饑餓對魚類形態(tài)特征影響方面的研究相對匱乏［13］。

眼斑雙鋸魚（Amphiprionocellaris）俗稱公子小丑，屬?？~亞科（Amphiprioninae），是重要的海水觀賞魚種類之一。小丑魚人工繁殖已經(jīng)可以大規(guī)模實施，但許多研究工作尚未開展。目前國內(nèi)對于眼斑雙鋸魚的報道僅見胚胎發(fā)育［14-15］、營養(yǎng)［16-17］和藥物應(yīng)激生理［18］等方面，國外則多聚焦于性轉(zhuǎn)化［19］、領(lǐng)域行為［20］和熱應(yīng)激［21］等問題，而饑餓對眼斑雙鋸魚形態(tài)性狀影響還未見報道。在生態(tài)調(diào)查和人工養(yǎng)殖中，魚類的營養(yǎng)狀況調(diào)查非常重要。特別在人工養(yǎng)殖過程中，由于投餌不足或餌料適口性和營養(yǎng)未能滿足魚類需求會使魚類處于長期饑餓狀態(tài)，容易引發(fā)疾病，導(dǎo)致魚類大量死亡。通過魚類饑餓狀態(tài)判別可以推斷前一段時間投喂量是否適當(dāng)，飼料營養(yǎng)是否合理，有助于改進(jìn)養(yǎng)殖措施。但目前對魚類饑餓營養(yǎng)狀態(tài)判斷往往僅憑個人經(jīng)驗，沒有在生產(chǎn)上適用的量化指標(biāo)。因此，本研究通過圖像分析軟件采集數(shù)據(jù)，運用t檢驗、聚類分析、因子分析和判別分析，研究饑餓對眼斑雙鋸魚幼魚形態(tài)性狀變異的影響，旨在揭示饑餓和非饑餓條件下眼斑雙鋸魚主要形態(tài)性狀的差異，通過量化指標(biāo)評估其饑餓狀態(tài)，為眼斑雙鋸魚的生態(tài)調(diào)查和人工養(yǎng)殖提供參考資料、奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與處理方法

實驗于2019年12月在海南熱帶海洋學(xué)院實驗室進(jìn)行。實驗魚購自海南萬寧小丑魚繁殖場，選取同一批親魚產(chǎn)卵孵化培育60 d的健康幼魚180尾，打包充氧帶回實驗室，在實驗室循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)，7 d后隨機分到60 cm×40 cm×40 cm玻璃養(yǎng)殖缸中。實驗設(shè)饑餓組和對照組，每組30尾，設(shè)3個平行。對照組正常投喂（與暫養(yǎng)時一致），每日投喂2次配合飼料（佛山市順德區(qū)全興水產(chǎn)飼料有限公司生產(chǎn)的頂旺牌石斑魚配合飼料0＃料），日按體質(zhì)量1%～2%投喂，根據(jù)攝食情況調(diào)節(jié)，饑餓組不投喂，其余養(yǎng)殖條件一致。暫養(yǎng)和實驗均為循環(huán)水養(yǎng)殖，每天采用7 w LED燈光照12 h，水溫25～26℃。實驗進(jìn)行7 d，實驗結(jié)束后全部取樣，然后用MS-222麻醉劑將魚麻醉后進(jìn)行拍照和體質(zhì)量測定。

1.2 數(shù)據(jù)測量和分析方法

用吸水紙吸干魚體表水分后用精度為0.001 g的電子天平測量體質(zhì)量（W，g），然后在體視顯微鏡下對每條魚進(jìn)行正反面拍照，用Image-Pro plus 6.0軟件準(zhǔn)確測量每條幼魚的形態(tài)性狀，包括全長（TL）、體長（SL）、體高（BD）、頭長（HL）、頭高（HD）、吻長（SnL）、尾柄長（CL）、尾柄高（CD）、背鰭前距（PDL）、胸鰭前距（PPL）、腹鰭前距（PVL）、臀鰭前距（PAL）、眼徑（ED）、瞳孔直徑（PD）等14個指標(biāo)，精確至0.001 mm。

測量的形態(tài)性狀指標(biāo)如圖1所示，為減少操作誤差，所有樣品魚的測量指標(biāo)由2人分別測定，每人對魚體左右側(cè)所有指標(biāo)各測定1次，綜合兩人測定的4組數(shù)據(jù)取平均值作為最終數(shù)值用于統(tǒng)計。

圖1 形態(tài)指標(biāo)測量示意圖Fig.1 Schematic diagram of morphological index measurement

計算各性狀的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行獨立樣本t檢驗。各性狀變異系數(shù)（CV）的估計公式：CV=（標(biāo)準(zhǔn)差／平均值）×100%；肥滿度（K）計算公式：K=（W／L3）×100%。

為消除魚體大小差異的影響，將可量性狀參數(shù)轉(zhuǎn)化為比值參數(shù)，取全長／體長（TL／SL）、體長／體高（SL／BD）、體長／頭長（SL／HL）、體高／頭高（BD／HD）、頭長／吻長（HL／SnL）、體長／尾柄長（SL／CL）、尾柄長／尾柄高（CL／CD）、體長／背鰭前距（SL／PDL）、體長／胸鰭前距（SL／PPL）、體長／腹鰭前距（SL／PVL）、體長／臀鰭前距（SL／PAL）、體高／尾柄高（BD／CD）、頭長／眼徑（HL／ED）、頭長／瞳孔（HL／PD）共14個形態(tài)比值參數(shù)。對未經(jīng)處理的形態(tài)性狀、體質(zhì)量、肥滿度和形態(tài)比值參數(shù)等數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立樣本t檢驗，當(dāng)P＜0.05時，表示參數(shù)在兩組之間差異性顯著，當(dāng)P＜0.01時，表示參數(shù)在兩組之間差異性極顯著。分別將所有試驗魚的14項形態(tài)性狀和14個比值數(shù)據(jù)，用IBM SPSSstatistics25進(jìn)行聚類分析、因子分析和判別分析。聚類分析采用系統(tǒng)聚類法；因子分析采用主成分提取，最大四次方值法（quartimax method）進(jìn)行旋轉(zhuǎn)；判別分析采用Wilks’Lambda步進(jìn)法，獲得未標(biāo)準(zhǔn)化判別方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 可量性數(shù)據(jù)和比值數(shù)據(jù)t檢驗

對眼斑雙鋸魚幼魚體質(zhì)量和形態(tài)性狀數(shù)據(jù)t檢驗結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，饑餓組和對照組除了尾柄高有顯著差異外（P＜0.05），其余形態(tài)性狀包括體質(zhì)量和肥滿度均未達(dá)到顯著性差異水平（P＞0.05）。形態(tài)比值參數(shù)數(shù)據(jù)t檢驗結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，TL／SL、SL／BD、SL／HL、BD／HD、HL／SnL和SL／CL等6個參數(shù)在饑餓組和對照組間無顯著性差異（P＞0.05）；CL／CD在兩組之間差異性顯著（P＜0.05）；SL／PDL、SL／PPL、SL／PVL、SL／PAL、BD／CD、HL／ED和HL／PD等7個參數(shù)在兩組之間差異性極顯著（P＜0.01）。

表1 表型性狀和形態(tài)比值數(shù)據(jù)的t檢驗結(jié)果Tab.1 t-test results of measurable traits and morphological ratio data between starvation and control group

2.2 聚類分析

分別對所有試驗魚的形態(tài)性狀數(shù)據(jù)和比值數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析表明，對2類數(shù)據(jù)進(jìn)行的系統(tǒng)聚類分析可以將全部試驗魚分為2大類，分別包含饑餓組和對照組魚類。

2.3 因子分析

對直接測量獲得的形態(tài)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行因子分析結(jié)果見表2，只獲得1個主成分。該主成分對變異的方差貢獻(xiàn)率較大（77.478%），包含了群體總變異的大部分。對主成分的因子負(fù)荷矩陣進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)主成分1在全部形態(tài)性狀的載荷值均大于0.5，即主要反映整體形態(tài)的變化，不能具體分析主要差異在哪。強行提取3個主成分并運用主成分1、2和3成分得分系數(shù)繪制三維立體圖，結(jié)果如圖2-a所示。由圖2-a可見，饑餓組和對照組群體分布區(qū)域絕大部分重疊，不能分開。

表2 形態(tài)性狀數(shù)據(jù)的載荷矩陣及主成分對總變異的貢獻(xiàn)率Tab.2 Loading matrix of morphological data and contribution rate of principal components to total variation

對形態(tài)比值參數(shù)進(jìn)行因子分析共獲得4個主成分，綜合指標(biāo)分析結(jié)果見表3。4個主成分對變異的方差貢獻(xiàn)率較大，分別為25.625%、21.836%、16.005%和9.233%，累積貢獻(xiàn)率為72.689%，這4個主成分包含了群體總變異的大部分。對主成分的因子載荷矩陣進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)主成分1在SL／HL、SL／PDL、SL／PPL和SL／PVL的載荷值均大于0.7，即主要反映頭長和各魚鰭相對位置的變化；主成分2在HL／PD上載荷值較大（載荷值＞0.9），主要反映魚頭部和瞳孔之間的形態(tài)變化；主成分3在CL／CD和BD／CD的載荷值較大（載荷值＞0.6），主要反映尾柄部位的形態(tài)變化；主成分4在BD／HD的載荷值較大（載荷值＞0.6），主要反映頭部高度的形態(tài)變化。從主成分1、2、3和4可見，2個實驗群體的魚在形態(tài)上的差別主要是由魚頭部形態(tài)、各魚鰭相對位置和尾柄部位差異引起。運用主成分1、2和3成分得分系數(shù)繪制三維立體圖，結(jié)果如圖2-b所示。由圖2-b可見，饑餓組和對照組群體只有極少量重疊區(qū)域，絕大部分可以分開。

圖2 利用形態(tài)性狀（A）和形態(tài)比值數(shù)據(jù)（B）進(jìn)行因子分析的主成分三維圖Fig.2 Three dimensional principal component diagram of factor analysis for morphological data（A）and morphological ratio data（B）

表3 形態(tài)比值參數(shù)數(shù)據(jù)的載荷矩陣及主成分對總變異的貢獻(xiàn)率Tab.3 Loading matrix of morphological ratio parameter data and contribution rate of principal components to total variation

2.4 判別分析

對形態(tài)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行經(jīng)判別分析篩選得到貢獻(xiàn)最大的4個參數(shù)，分別為PDL、PPL、PVL和PAL，據(jù)此構(gòu)建未標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù)方程Y1=-3.010+2.144PDL-2.243PPL-1.068PVL+0.994PAL。饑餓組Y1平均值為-1.385，對照組Y1平均值為1.157；對形態(tài)比值數(shù)據(jù)進(jìn)行經(jīng)判別分析篩選得到貢獻(xiàn)最大的3個參數(shù)，分別為BD／HD、HL／ED、HL／PD，分別以X1、X2、X3表示，據(jù)此構(gòu)建未標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù)方程Y2=-8.224 5+0.265X1-1.852X2+2.174X3。饑餓組Y2平均值為-8.245，對照組Y2平均值為6.887。判斷某尾魚的群體是否為饑餓狀態(tài)時，將所測數(shù)據(jù)代入方程，獲得的函數(shù)值與哪組平均值更接近即為其所屬狀態(tài)。上述2個函數(shù)的威爾克Lambda顯著性P＜0.01，表明均有統(tǒng)計學(xué)意義。

為了驗證上述判別方程的實用性，對建立的判別方程進(jìn)行預(yù)測分析和統(tǒng)計評價，判別結(jié)果見表4。結(jié)果可見，由形態(tài)性狀數(shù)據(jù)建立的方程，饑餓組中有8尾誤判到對照組中，判別正確率為90.00%，對照組中有7尾誤判到饑餓組中，判別正確率為91.25%；而使用形態(tài)比值數(shù)據(jù)建立的方程，饑餓組和對照組判別準(zhǔn)確率均為100.00%，交互驗證結(jié)果證明使用形態(tài)比值數(shù)據(jù)建立的判別函數(shù)可信度高于使用形態(tài)性狀數(shù)據(jù)建立的方程。

表4 對照組和饑餓組試驗魚的判別驗證結(jié)果Tab.4 Discrimination results for judging A.ocellaris starving status

3 討論

3.1 魚類饑餓形態(tài)性狀變異

魚類形態(tài)性狀存在種間差異［22］，也存在種內(nèi)差異。已有研究表明，引起種內(nèi)形態(tài)差異的原因有不同地理居群的形態(tài)分化［23］、性別［5］、不同生長發(fā)育階段［8-9］和環(huán)境因素［3-4，24-25］。自然環(huán)境中的餌料缺乏以及養(yǎng)殖過程中餌料投喂不當(dāng)?shù)瘸?dǎo)致魚類處于饑餓的脅迫狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)，饑餓對魚類形態(tài)特征存在顯著影響，如中華倒刺鲃（Spinibarbussinensis）仔魚隨著饑餓程度增加，體長和體高均顯著下降［26］；饑餓時牙鲆（Paralichthysolivaceus）前后體軸相關(guān)的形態(tài)性狀數(shù)值下降，頭部形態(tài)特征的經(jīng)典尺寸（classical dimensions）顯著增大［27］；鯉（Cyprinuscarpio）幼魚饑餓后體高明顯下降，導(dǎo)致體高／體長明顯下降，體型變得更加“細(xì)長”［13］；本研究與之不同的是，本研究中7 d的饑餓脅迫并沒有對眼斑雙鋸魚幼魚形態(tài)和體質(zhì)量指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響，這可能與種間差異和饑餓脅迫的時間還不足夠長有關(guān)，但大多數(shù)形態(tài)比值在饑餓組和對照組之間已出現(xiàn)顯著差異，因此本研究證實了饑餓脅迫確實對魚類的形態(tài)性狀特征造成了影響，形態(tài)參數(shù)可作為一個衡量魚類饑餓狀態(tài)的有效指標(biāo)。

3.2 魚類形態(tài)測量分析技術(shù)

傳統(tǒng)魚類形態(tài)測量方法為盡可能的減少人為誤差，加大了取樣數(shù)量，增加了工作量，測定時魚類離水時間過長難免造成魚類死亡。因此本研究摒棄傳統(tǒng)游標(biāo)卡尺現(xiàn)場測定的方法，采用較先進(jìn)的圖像分析技術(shù)，用麻醉劑將魚麻醉后拍照，再用電腦軟件分析，精確度高，而且對于同一批實驗樣本，采用2人測定正反面數(shù)據(jù)取平均值再統(tǒng)計，進(jìn)一步消除了人為誤差，使得結(jié)果更為可信。

因子分析是一種多元統(tǒng)計方法，已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域的調(diào)查和分析，如：1）地理種群區(qū)分：楊琴等［23］運用主成分和判別分析發(fā)現(xiàn)，影響鳳鱭（Coiliamystus）群體形態(tài)差異的主要因素在軀干部和尾部，并且構(gòu)建了4個群體的判別方程；KARTAVTSEV等［28］通過形態(tài)計量學(xué)性狀的因子分析和判別分析發(fā)現(xiàn)，太平洋鯡魚（Clupea pallasii）本地種群具有明顯生物學(xué)意義的3個分化群存在；2）魚類的行為和環(huán)境分析：QUEIROZ等［29］通過幾何形態(tài)測量方法發(fā)現(xiàn)，松鯛（Lobotes surinamensis）、圓眼燕魚（Plataxorbicularis）和疣鱗鲀（Canthidermismaculata）3種魚的幾何形態(tài)與其伴生植物的幾何形態(tài)具有較強的相關(guān)性；3）群落結(jié)構(gòu)分析：BAGHERI等［30］運用主成分分析揭示了網(wǎng)箱養(yǎng)殖對浮游動物豐度的影響；4）性別判別：武兆文等［6］運用主成分分析發(fā)現(xiàn)，雌雄雜交黃顙魚的差異主要集中在肥滿度及外部輪廓指標(biāo)上，并建立了性別判別函數(shù)。本研究采用因子分析和判別分析，嘗試對魚類的饑餓狀態(tài)進(jìn)行評估。結(jié)果表明，與t檢驗方法相比，因子分析和判別分析可以更清晰地揭示變異的主要因素。t檢驗未發(fā)現(xiàn)7 d饑餓對體質(zhì)量、肥滿度和大部分形態(tài)性狀參數(shù)造成顯著影響，而對8個形態(tài)性狀比參數(shù)（CL／CD、SL／PDL、SL／PPL、SL／PVL、SL／PAL、BD／CD、HL／ED和HL／PD）則均有顯著影響，導(dǎo)致無法判斷主要變異因子具體為哪些可度量參數(shù)。因此，進(jìn)一步的因子分析通過提取主成分和旋轉(zhuǎn)矩陣，而獲得較清晰的形態(tài)變異因子，揭示其主要變異由魚頭部形態(tài)、各魚鰭相對位置和尾柄部位引起。而進(jìn)一步經(jīng)判別分析得出的饑餓狀態(tài)的未標(biāo)準(zhǔn)化典則判別方程，通過檢驗發(fā)現(xiàn)將所測相關(guān)數(shù)據(jù)代入方程即可有效快捷地評估魚類的饑餓狀態(tài)。除未標(biāo)準(zhǔn)化方程以外，還有標(biāo)準(zhǔn)化方程，而標(biāo)準(zhǔn)化方程需要將所測數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理再代入方程中才能計算。本研究選取的未標(biāo)準(zhǔn)化方程則可直接將測量數(shù)據(jù)代入方程中計算，不需標(biāo)準(zhǔn)化處理，相比標(biāo)準(zhǔn)化方程更加方便快捷。