紫外消毒對養(yǎng)殖廢水中大腸桿菌的滅活及影響因素

陳世珩，呂兆豐，鄭添予，宗玉國，王道武*

1.長春工業(yè)大學化學工程學院，吉林長春 130012；2.延邊大學，吉林延吉 133400；3.山東省濰坊市臨朐縣綜合行政執(zhí)法局，山東濰坊 261000

大腸桿菌廣泛寄生于人與動物體腸道的條件致病菌，感染性很強，宿主受感染后易引發(fā)多種臨床癥狀[1]。近年來大腸桿菌在不同環(huán)境中的傳播均被報道過，包括食物、食用動物、不同的水環(huán)境尤其是污水中的傳播。隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，動物源大腸桿菌，特別是攜帶抗性基因的致病性的大腸桿菌對環(huán)境污染造成的危害日益突出。大腸桿菌可寄生于動物呼吸道或消化道上皮細胞中，是導致腹瀉的重要病原之一。養(yǎng)殖業(yè)動物感染大腸桿菌后主要急性病例一般1～2 d死亡，亞急性1周左右死亡。體溫正?；蚱汀４竽c桿菌在水環(huán)境中的潛伏期較長，可存活數(shù)月至一年之久。養(yǎng)殖廢水中存在著大量抗生素耐藥型病菌，是造成畜牧養(yǎng)殖業(yè)疾病的主要來源之一。大腸桿菌作為環(huán)境條件下的指示性微生物，可以間接反映水環(huán)境中的病菌污染程度。近些年，隨著紫外滅活技術在不同領域的研究深入，發(fā)現(xiàn)紫外線消毒對不同種類細菌的影響具有差別性，例如革蘭氏陽性菌對紫外線的耐受性高于革蘭氏陰性菌[2]。

本研究選取了從養(yǎng)殖廢水中分離純化的多藥耐藥大腸桿菌，考察了紫外線對不同耐藥表型大腸桿菌的滅活效果及環(huán)境因素對其影響因素，尋求高效、可行的控制水中大腸桿菌的方法和工藝，對推進大腸桿菌滅活的科學研究和技術開發(fā)有著非常積極的價值和意義[3]。

1 實驗材料

1.1 菌株

所用大腸桿菌Ecoil.322鑒定為多藥耐藥大腸桿菌，耐藥表型見表1。Ecoil.201（抗生素敏感菌株，由吉林畜牧提供）。

表1 大腸桿菌Ecoil.322耐藥表型

Ecoil.322對β-內酰胺、頭孢菌素、氨基糖苷、抗葉酸、喹諾酮、大環(huán)內酯、四環(huán)素、苯丙醇類等8類14種抗生素均有耐藥性，僅對磺胺異惡唑表現(xiàn)為中介，對呋喃妥因表現(xiàn)為敏感（表1）。MIC檢測結果表明Ecoil.322呈多重耐藥，且耐藥性嚴重。

1.2 培養(yǎng)基的配制

營養(yǎng)瓊脂：取50 g營養(yǎng)瓊脂粉，加入100 mL的蒸餾水與燒杯中，用玻璃攪拌充分后，封口燒杯放置高溫滅菌鍋中，設置121 ℃滅菌65 min，冷卻50 ℃后緩慢倒入培養(yǎng)皿中，待至冷卻。

LB肉湯（Luria-Bertani broth）的配制：稱取150 g的營養(yǎng)瓊脂粉，加入500 mFL的蒸餾水與燒杯中，用玻璃攪拌充分后，放置高溫滅菌鍋中，設置121 ℃滅菌65 min，冷卻至室溫后用無菌玻璃管進行分裝。

1.3 實驗裝置

試驗裝置如圖1所示．低壓UVC燈為江蘇南京胥光燈管，波長254 nm，功率為14 W[4]，裝置下面暗室裝有直徑為40 cm的圓型轉盤放置大腸桿菌樣品，水槽及暗箱（外部封有錫紙）均為導光板[5]，可以控制中間的透鏡來調控紫外強度。

圖1 紫外實驗裝置圖

2 實驗方法

2.1 紫外線消毒實驗

2.1.1 實驗菌株的制備

分別挑選菌株接種于5 mL液體肉湯培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)箱中37 ℃振蕩過夜。24 h后，于菌液置4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取沉淀用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.2）沖洗沉淀1～2次，轉入100 mL的蒸餾水后，顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，制成大腸桿菌濃度約107CFU/mL的菌液樣品。

2.1.2 紫外消毒實驗

取3.5 mL大腸菌液樣品于半徑40 mm的滅菌培養(yǎng)皿中，放置在實驗設備的暗箱室中。經(jīng)紫外輻射強度儀測定輻照強度為100 μW/cm2，通過控制樣品的輻射時間來獲得不同紫外劑量。取時間間隔2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 min收集樣品。每組實驗進行3次重復性實驗保證實驗準確性，紫外消毒前后樣品通過營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)法測定大腸桿菌的濃度。滅活對數(shù)R的計算公式如下：

式中，N0是未經(jīng)紫外線消毒時（原始）樣品中的大腸桿菌濃度（CFU/mL）；NI是某一劑量紫外線消毒后樣品中大腸桿菌的濃度（CFU/mL）。

2.1.3 不同環(huán)境因素對紫外線消毒效果影響試驗

通過2.1.2節(jié)的實驗，確定最佳的不同種類大腸桿菌滅活輻射劑量，以及在養(yǎng)殖廢水常見水域環(huán)境條件下選擇分別選定pH5、6、7、8、9，Cu2+濃度分別為15、30、60 mg/L。探究不同pH、離子強度濃度對紫外線的影響。

3 實驗結果與討論

3.1 相同紫外輻射劑量對不同大腸桿菌菌株的滅活

控制溫度為22±1 ℃，濁度為1 ntu的實驗條件下，耐藥型和敏感型大腸桿菌的滅活對數(shù)均隨著紫外輻射劑量的增加而增加，在紫外劑量輻射0～15 mj/cm2內增長十分迅速，之后逐漸緩慢，在到達20 mj/cm2后沒有變化，在15 mj/cm2的輻照劑量下，大腸桿菌Ecoil.201和Ecoil.322的對數(shù)滅活率均值分別為2.12 log和1.82 log，之間有較為顯著的差異。盡管耐藥型大腸桿菌較敏感型大腸桿菌滅活速率較低，但20 mj/cm2以上的紫外線輻照劑量時，兩株大腸桿菌對數(shù)滅活率都在2.0 log左右。以上，不同菌株滅活率的差異主要表現(xiàn)在低輻照劑量下。

3.2 pH對大腸桿菌紫外滅活的影響

控制溫度為22±1 ℃，濁度為1 ntu的實驗條件下，探究不同pH對紫外滅活的影響。在實驗范圍內隨著pH的增加，滅活對數(shù)絕對值增加，堿性條件有一定促進大腸桿菌紫外滅活，酸性條件下抑制其紫外滅活，與大腸桿菌卵囊在不同環(huán)境下活性相關。在紫外劑量到達15 mj/cm2的時候，各個條件下滅活對數(shù)級都達到了1.5個對數(shù)級。因此，pH的改變對紫外條件下大腸桿菌的滅活有一定的影響，堿性條件下有一定的促進作用。

3.3 Cu2+離子對大腸桿菌紫外滅活的影響

控制溫度為22±1 ℃，濁度為1 ntu的實驗條件下，探究Cu2+不同濃度對紫外滅活的影響。水中金屬離子強度對紫外滅活大腸桿菌的影響為，Cu2+濃度對滅活效率的影響可以忽略不計。隨著Cu2+濃度從15 mg/L增加到60 mg/L，紫外滅活效率在10 mj/cm2內沒有顯著變化?？傮w而言，水中堿性金屬離子的存在對紫外滅活大腸桿菌無明顯影響。

4 小結

通過對養(yǎng)殖廢水中篩選出的1株不同耐藥表型的大腸桿菌和1株對抗生素敏感大腸桿菌進行紫外線消毒試驗，取得以下結果。

4.1 耐藥型和敏感型大腸桿菌的滅活對數(shù)均隨著紫外輻射劑量的增加而增加，在紫外劑量輻射0～15 mj/cm2內增長十分迅速，之后逐漸緩慢，在到達20 mj/cm2后無顯著變化，在15 mj/cm2的輻照劑量下，大腸桿菌Ecoil.201和Ecoil.322的對數(shù)滅活率均值分別為2.12log和1.82log，之間有顯著的差異。當紫外輻射劑量為20 mj/cm2，對菌株Ecoil.322的滅活率為99.5%，菌株Ecoil.201的滅活率為99.1%，無顯著差異。

4.2 隨著pH升高，紫外滅活效率隨著升高，pH降低對滅活有明顯的抑制作用，滅活對數(shù)速率常數(shù)從0.00786下降到0.00382。

4.3 Cu2+離子不干擾紫外對隱孢子蟲的滅活效率，隨著Cu2+濃度從15 mg/L增加到60 mg/L相應的離子強度分別從40 mM增加到80 mM，紫外滅活效率在20 mj/cm2內沒有顯著變化。