漢麻酚類活性物質(zhì)生物合成調(diào)控的研究進(jìn)展

崔素娟，武文博，謝 洋，李 鵬，隋 新，張曉臣，郭春景，李廣澤，尹 靜2, *

漢麻酚類活性物質(zhì)生物合成調(diào)控的研究進(jìn)展

崔素娟3，武文博3，謝 洋1，李 鵬1，隋 新1，張曉臣1，郭春景1，李廣澤4，尹 靜2, 3*

1. 黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江 哈爾濱 150020 2. 東北林業(yè)大學(xué) 東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040 3. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040 4. 深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司，廣東 深圳 518102

漢麻是典型的一年生且雌雄異株的開花植物，是大麻素的主要來源，具有多種精神活性和藥理作用，由于對人類疾病的治療潛力而被廣泛關(guān)注。除了具有精神活性的主要成分四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）外，還含有非精神活性的酚類化合物如大麻二酚（cannabidiol，CBD），作為抗腫瘤的候選藥物具有很高的價值。然而在已知的600多種大麻素中，大多數(shù)含量較低，由于其在醫(yī)學(xué)、日化和工業(yè)方面具有廣泛的用途，迫切需要應(yīng)用新的生物技術(shù)提高大麻素的生物合成。大麻素的異源生物合成可以實(shí)現(xiàn)低成本且快速的生產(chǎn)，各種組織培養(yǎng)方法，如微繁殖、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法在漢麻育種、新性狀開發(fā)及規(guī)?；敝撤矫婢哂袧撛诘膽?yīng)用價值。綜述了漢麻酚類化合物藥理學(xué)、合成積累規(guī)律及其生物合成最新進(jìn)展，重點(diǎn)探討了大麻組織培養(yǎng)方面重要的成果，以期為漢麻酚類物質(zhì)生物合成及其利用提供科學(xué)依據(jù)和參考。

漢麻；酚類化合物；代謝途徑；生物合成；組織培養(yǎng)

漢麻L.又稱工業(yè)大麻，屬于木蘭綱（Magnoliopsida）蕁麻目（Urtiacales）大麻科（Cannabinaceae）大麻屬Linn.一年生草本植物[1]，具有悠久的藥用、工業(yè)、娛樂和農(nóng)業(yè)用途[2]。大麻中含有致幻成癮的毒性成分四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC），按照國際規(guī)定，THC含量低于0.3%的大麻稱為工業(yè)大麻。雖然數(shù)千年來漢麻一直被用于傳統(tǒng)藥物和紡織纖維材料，但其越來越多地被認(rèn)為是藥物、調(diào)味化合物等多種次級代謝物的來源[3]。

漢麻中存在大量的活性成分，迄今為止從漢麻中分離出600多種次生代謝物[4]，主要是漢麻植物特有的萜酚類化合物，即大麻素[5]。目前，已從漢麻中鑒定出超過115種大麻素，主要產(chǎn)生于雌花的腺毛中，大麻二酚（cannabidiol，CBD）、THC和大麻環(huán)萜酚（cannabichromene，CBC）為漢麻中的主要大麻素[6]，目前已經(jīng)對一些標(biāo)志性大麻素及其類似物的潛在醫(yī)用價值進(jìn)行了廣泛的研究，某些大麻素制劑已被一些國家批準(zhǔn)為治療一系列人類疾病的處方藥，研究最多的是THC和CBD[7]，二者具有治療多種人類疾病的潛力，如緩解與癌癥相關(guān)的慢性疼痛，降低細(xì)胞抑制劑和化療的不利影響，改善與厭食癥和艾滋病相關(guān)的飲食失調(diào)、炎癥性疾病、癲癇以及多發(fā)性硬化癥[8]。

次級代謝物的傳統(tǒng)獲取方式是從植物中提取或通過化學(xué)合成，但因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使用化學(xué)合成的方法成本高、效益低，無法成為大量合成大麻素的有效途徑。研究表明通過工程微生物菌株生物合成大麻素已成為獲得具有成本效益、高質(zhì)量和可靠大麻素的有效手段[9]。Zirpel等[10]通過四氫大麻酚酸（tetrahydrocannabinol acid，THCA）合成酶在酵母中的表達(dá)，使大麻萜酚酸（cannabigerolic acid，CBGA）轉(zhuǎn)化為Δ9-四氫大麻酚酸（Δ9-tetrahydrocannabinolic acid，Δ9-THCA）。有研究報道利用合成生物學(xué)方法重組釀酒酵母中的橄欖酸生物合成模塊，可以從己酸或半乳糖中生產(chǎn)大麻萜酚酸（cannabigerolic acid，CBGA），但大多數(shù)代謝物生物合成的量仍有待提高[11-12]。盡管已經(jīng)闡明了許多參與大麻素生物合成的基因，但由于很少有關(guān)于漢麻組織穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的報道，這些基因的功能尚未得到充分驗(yàn)證，其生物合成的遺傳學(xué)仍然未知，因此，掌握及利用遺傳學(xué)及生物工程技術(shù)提高大麻素含量及產(chǎn)量是目前研究者的主要目標(biāo)。體外組織培養(yǎng)技術(shù)如愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、植株再生和毛狀根培養(yǎng)是大多數(shù)生物技術(shù)工具的基礎(chǔ)[13-14]，體外培養(yǎng)方法與基因工程技術(shù)（如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化和基因組編輯）相結(jié)合，為在漢麻中產(chǎn)生新基因型和調(diào)控次級代謝產(chǎn)物的合成提供了機(jī)會[15]。另外，高效、可靠的體外培養(yǎng)方法是成功進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化、基因組編輯、微繁殖的關(guān)鍵策略。本文綜述利用基因工程、細(xì)胞工程技術(shù)調(diào)控漢麻酚類合成研究方面的最新進(jìn)展，有助于了解漢麻生物合成途徑，評估組織培養(yǎng)優(yōu)化技術(shù)在漢麻植物繁殖中的潛在應(yīng)用及價值，以期為相關(guān)領(lǐng)域的深入研究及廣泛應(yīng)用提供重要的參考依據(jù)。

1 漢麻內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)及其抗癌作用

1.1 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)

大麻素根據(jù)其來源可分為3類：植物大麻素、內(nèi)源性大麻素和合成大麻素[16]，植物大麻素與分布于全身的特定受體結(jié)合，稱為內(nèi)源性大麻素受體。內(nèi)源性大麻素受體及其內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)-花生四烯酸乙酰胺（-anandamide，-AEA）和2-花生四烯酸甘油酯（2-arachidonoylsn-glycerol，2-AG），以及負(fù)責(zé)內(nèi)源性大麻素合成和降解的酶，形成內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endogenous cannabinoid system）。除此之外，其他分子也被認(rèn)為是內(nèi)源性大麻素，如花生四烯酰多巴胺（-arachidonoyldopamine，NADA）、2-花生四烯酰甘油醚（2-arachidonoylsn-glycerol，2-AGE）、花生四烯酰乙醇胺（-virodhamine，-AEA）和油酸酰胺（oleic acid amide，OA）[17]。有2種內(nèi)源性大麻素受體CB1、CB2（1型和2型大麻素受體），它們屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（主要表達(dá)CB1）和免疫組織（主要表達(dá)CB2）。兩者都在與大麻素相互作用時發(fā)揮抑制神經(jīng)元活動的作用[18-19]。與CB2相比，AEA對CB1的親和力較高，而2-AG對CB1和CB2的親和力中等。外源性THC是部分CB1和CB2激動劑，而植物大麻素CBD對這些受體的親和力較低[19-20]（圖1）。

1.2 抗癌作用及機(jī)制

大麻素主要用于癌癥的姑息治療，以減輕疼痛、刺激食欲和緩解惡心。近年來，已經(jīng)對大麻素作為癌癥患者的抗腫瘤和癥狀緩解劑的潛在用途進(jìn)行了廣泛的研究。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在癌癥中的作用機(jī)制尚不完全清楚，但一些研究表明，大麻素受體和內(nèi)源性配體在腫瘤組織中過度表達(dá)[22]。已發(fā)現(xiàn)大麻素可通過激活大麻素受體抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲，并可在體內(nèi)外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。Jeong等[24]證實(shí)了CBD通過抑制IAP蛋白家族成員X連鎖凋亡抑制因子（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞死亡。Mazuz等[25]發(fā)現(xiàn)大麻素混合物THC和CBD以及CBD和CBGA的組合可誘導(dǎo)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）細(xì)胞周期停滯和凋亡而引起細(xì)胞死亡。Bachari等[26]研究證實(shí)大麻素單獨(dú)或組合使用抑制了腫瘤的生長，并促進(jìn)了黑色素瘤細(xì)胞的凋亡和自噬。

a-人體中大麻素受體的分布 b-內(nèi)源性大麻素受體N-花生四烯酸乙醇胺（AEA）、2-花生四烯酸甘油酯（2-AG）和外源性Δ9-四氫大麻酚（Δ9-THC）與大麻素受體1型（CB1）和2型（CB2）的結(jié)合

大麻素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的已知機(jī)制是其與G蛋白偶聯(lián)受體55（G protein-coupled receptor 55，GPR55）、瞬時受體電位陽離子通道辣椒素受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）和瞬時受體電位M型8（transient receptor potential melastatin 8，TRPM8）相互作用，如CBD和大麻酚是TRPM8受體的有效拮抗劑[8,27]，從而發(fā)揮抗癌作用。此外，CB2受體（CB2R）具有免疫調(diào)節(jié)作用，其激活可影響免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、抑制γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）產(chǎn)生和T細(xì)胞增殖[28]。此外，大麻素具有阻斷血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通路，并通過阻斷神經(jīng)酰胺生物合成激活血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）的能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞血管再生[29]。

2 漢麻不同酚類物質(zhì)的分布特性及含量積累規(guī)律

2.1 漢麻不同組織部位酚類物質(zhì)含量積累規(guī)律

陳璇等[30]研究表明，漢麻植株頂端葉片中主要大麻素含量在幼苗期和快生期含量接近零，盛蕾期、盛花期和始果期逐漸上升，說明大麻素在生殖階段開始積累，苞片、花和果外圍的變態(tài)葉是始果期大麻素含量最高的器官。也有研究表明，漢麻酚類化合物主要存在于包裹種子的小苞葉中，其次是植株頂部葉片，底部葉片中大麻素含量最少[31]。

研究證明大麻素的生物合成和積累發(fā)生在腺毛上[32]，腺毛狀體分為有柄毛狀體、無柄毛狀體和莖狀毛狀體。莖狀毛狀體是從無柄毛狀體形成的（圖2）。腺毛狀體在堆積有分泌性囊泡的氣球狀腔中積聚大麻素[33-36]。在根表面沒有發(fā)現(xiàn)腺毛，因此根組織不會積聚植物大麻素[37]。腺毛不僅分泌大麻素，還可以合成大麻素[38]。大麻素含量的增加對應(yīng)于葉片腺毛狀體的發(fā)育和生長，且葉片發(fā)育各階段的腺體密度與大麻素含量之間存在相關(guān)性[39]。

a-開花的雌花“Finola”（芬蘭品種漢麻）植物；孤立的花簇，包含無數(shù)的花萼，具密集的腺毛 b-解剖單個雌花的花萼和花柱的顯微鏡圖像 c-使用常規(guī)SEM觀察單個雌花花萼的圖像，比例尺500 μm d～f-3種類型的漢麻腺毛狀體的低溫SEM圖，分為有柄型（d）、無柄型（e）和球莖型（f），比例尺20 μm

2.2 不同漢麻酚類物質(zhì)的合成積累及分布特性

漢麻植株中不同大麻素的分布都有其特性，用于生產(chǎn)大麻素的漢麻植株是雌雄異株，這些化合物在未受精的雌性花序上積累。在雌性植株的葉和花中THC含量最高，種子和根中幾乎不含有THC[40]，CBD的分布特征與THC十分相似，因?yàn)門HC和CBD是由相同基因位點(diǎn)控制的互為共顯性的2個性狀[41]。

當(dāng)干燥后的漢麻長期暴露在紫外線、空氣或潮濕的環(huán)境中會產(chǎn)生另一種大麻素，即大麻酚（cannabinol，CBN），其在新鮮及陰干的漢麻材料中是不存在的，是THC經(jīng)氧化后得到的產(chǎn)物[42]。在漢麻幼苗期產(chǎn)生的主要大麻素是大麻環(huán)萜酚（cannabichromene，CBC），CBC的含量隨著植株的成熟而降低，以至可以忽略不計[43-45]。

3 大麻素關(guān)鍵途徑基因及合成生物學(xué)研究進(jìn)展

3.1 合成途徑及關(guān)鍵基因

大麻素合成途徑未被完全解析，是一個極其復(fù)雜的代謝過程，相關(guān)人員根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，推導(dǎo)出了大麻素生物合成過程，包括2-甲基赤蘚糖醇磷酸（2--methyl--erythritol-4-phosphate pathway，MEP）途徑、焦磷酸香葉酯（geranyl diphosphate，GPP）途徑、己酸途徑和以這3個途徑合成產(chǎn)物為底物的CBD途徑[46]。MEP和GPP途徑最終合成GPP，己酸途徑最終合成己酰輔酶A（hexanoyl-CoA），己酰輔酶A生成的戊基二羥基苯酸（olivetolic acid，OLA）與GPP合成CBGA（圖3）[47]。

OLA是由聚酮化合物合酶（polyketide synthase，PKS）和橄欖酸環(huán)化酶（olivetolic acid cyclase，OAC）催化下產(chǎn)生的[49]。產(chǎn)生的CBGA是下一階段Δ9-THCA、CBDA和大麻環(huán)萜酚酸（cannabichromenic acid，CBCA）的主要前體，其中包括OLA與GPP的烷基化反應(yīng)，該烷基化是由牻牛兒焦磷酸：橄欖油酸香葉烯基轉(zhuǎn)移酶（cannabis GOT，GOT）催化的。在MEP途徑中，異戊二烯側(cè)鏈為GPP合成提供底物，從而使芳香異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生CBGA[50]。酶促反應(yīng)包括THCA合成酶、CBDA合成酶和CBCA合成酶，它們分別將CBGA轉(zhuǎn)化為THCA、CBDA和CBCA[51-52]。最后一個階段包括通過THCA和CBDA脫羧生成THC和CBD[53]。

漢麻幼苗不積累大麻素。這一發(fā)現(xiàn)表明，大麻素的生物合成與器官和組織的發(fā)育有關(guān)，并受參與這些過程的基因控制。陳璇等[30]測定了漢麻不同生長發(fā)育時期大麻素含量變化以及大麻素合成途徑中相關(guān)酶基因表達(dá)豐度，對其相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，大麻素合成相關(guān)酶基因可能通過協(xié)同作用來調(diào)控大麻素的合成與積累，MEP和GPP途徑的酶基因在大麻素合成過程中起著至關(guān)重要的作用，而CBD途徑中、和基因主要對始果期苞片腺毛中的大麻素合成起作用。相關(guān)人員對漢麻轉(zhuǎn)錄組和代謝組進(jìn)行了分析，大麻素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶在腺毛體中過度表達(dá)[46,49,54]，大麻素和萜類物質(zhì)的生物合成和積累發(fā)生在腺毛上[42]。

CBCAS-大麻環(huán)萜酚酸合成酶 CBDAS-大麻二酚酸及其合成酶 CBGAS-大麻萜酚酸合酶 GPPS-香葉基二磷酸合酶 IPP-異戊烯二磷酸 MEV-甲羥戊酸 OAC-橄欖油酸環(huán)化酶 OLS-橄欖醇合酶 THCAS-Δ9-四氫大麻酚酸合酶 IPPI-異戊烯二磷酸異構(gòu)酶

3.2 漢麻酚類化合物合成生物學(xué)研究

合成生物學(xué)可用于產(chǎn)生底盤生物，以研究和表征與這些含量較不豐富的大麻素及其衍生物的生物合成有關(guān)的酶，并通過可擴(kuò)大的發(fā)酵過程生產(chǎn)這些化合物。此外，通過摻入定制酶，微生物生產(chǎn)可以產(chǎn)生具有增強(qiáng)特性的新型大麻素?；谥参锎舐樗厣锖铣赏緩?，人們可以通過合成生物學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)大麻素或合成某些新型大麻素藥物[55]，目前在這方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展（表1）。

2018年，美國加州伯克利勞倫斯國家實(shí)驗(yàn)室生物能源研究所Keasling教授實(shí)驗(yàn)室，羅小舟研究員在發(fā)表論文首次報道了利用合成生物學(xué)方法在釀酒酵母中合成主要大麻素類成分，通過重組相關(guān)菌株中的橄欖酸生物合成模塊，可以從更簡單的前體如己酸或半乳糖中生產(chǎn)CBGA，從1 mmol/L己酸中可合成7.2 mg/L CBGA，并且可以通過工程菌株提高CBGA的表達(dá)效率，該菌株可產(chǎn)生8.0 mg/L THCA和4.8 mg/L THCAS[12]。在大麻素合成中，必須考慮毒性作用，因?yàn)閹追N大麻素生物合成途徑的代謝物（如CBGA和THCA）會通過宿主植物中的細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞死亡[38]。Gülck等[57]研究使用基于芳香異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的方法以組合方式構(gòu)建所需的新型植物大麻素結(jié)構(gòu)，將在細(xì)胞質(zhì)中合成的橄欖酸轉(zhuǎn)移到質(zhì)體中，并將橄欖酸和香葉基焦磷酸轉(zhuǎn)化為CBGA，最后釋放到質(zhì)外體中，為異源宿主提供貯藏可能性，從而避免自身毒性。

表1 漢麻大麻素類藥物異源系統(tǒng)合成研究[56]

Table 1 Study on synthesis of cannabinoid drugs in hemp by heterologous system[56]

表達(dá)系統(tǒng)原料產(chǎn)物產(chǎn)量 釀酒酵母橄欖酸CBGA216 mg·L?1 橄欖酸CBDA234 mg·L?1 橄欖酸THCA320 mg·L?1 己酸THCA23 mg·L?1 己酸CBGA73 mg·L?1 己酸CBDA4.2 mg·L?1 葡萄糖1-甲基-CBG66 mg·L?1 葡萄糖橄欖醇76 mg·L?1 葡萄糖1-甲基橄欖醇42 mg·L?1 根瘤菌（畢赤酵母）CBGATHCA32.6 mg·L?1 CBGATHCA3.05 g·L?1 橄欖酸THCA615 pmol·L?1 大腸桿菌橄欖酸/GPPCBGA1.2 mg·L?1 葡萄糖己酸190 mg·L?1 葡萄糖CBGAN/A 煙草CBGACBDA34 mg·L?1 CBGATHCAN/A CBDACBDA-葡萄糖苷N/A 己酸橄欖酸葡萄糖苷N/A 己酸橄欖酸N/A 馬克斯克魯維酵母葡萄糖CBDA、THCA0.67 mg·L?1 維氏假絲酵母油酸CBGA上清液中為0.67 mg·L?1，裂解液中為1.51 mg·L?1 油酸橄欖酸13.1 mg·L?1 萊茵衣藻葡萄糖CBGA1.25 g·L?1 無細(xì)胞橄欖酸CBGA1.25 g·L?1

N/A-是否適合大麻素生產(chǎn)尚未報道

N/A-whether suitable for cannabinoid production is yet to be reported

4 利用植物細(xì)胞工程技術(shù)合成大麻素

由于漢麻幾千年來的藥用特性，一些大麻素及其類似物因其潛在的醫(yī)藥價值而受到廣泛關(guān)注。一些大麻素制劑已在某些國家被批準(zhǔn)為處方藥，用于治療一系列人類疾病。但漢麻的大規(guī)模田間耕種很難控制，同時因受環(huán)境、品種、氣候、土壤等因素的影響，漢麻中的大麻素含量會發(fā)生變化。鑒于此，人們開始研究大麻素替代的生產(chǎn)方法。生物技術(shù)是一種有吸引力的替代手段[9]，使用植物、真菌和細(xì)菌在內(nèi)的不同平臺來生產(chǎn)大麻素[57]。如通過外植體和微繁殖技術(shù)生產(chǎn)大麻素，可以持續(xù)穩(wěn)定地獲得大麻素，除特定植株外，高生物量作物煙草也被認(rèn)為是一種很有希望的生產(chǎn)大麻素的異源宿主。體外植物細(xì)胞培養(yǎng)物用于大麻素生產(chǎn)已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，包括遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、多毛/不定根和異源系統(tǒng)等方面[58]，如通過發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的遺傳轉(zhuǎn)化策略合成大麻素，可以加快新品種的開發(fā)并穩(wěn)定舊品種。通過異源系統(tǒng)來產(chǎn)生大麻素合成的相關(guān)酶，有望實(shí)現(xiàn)大麻素的批量生產(chǎn)。

4.1 漢麻組織體外擴(kuò)繁

微繁殖技術(shù)的發(fā)展是遺傳修飾的必要步驟，可以對大麻進(jìn)行基因改造，這可能有助于將來新品種的育種。微繁殖可以實(shí)現(xiàn)植物快速繁殖和大規(guī)模生產(chǎn)。微繁殖的最大優(yōu)勢是優(yōu)良材料的快速再生，并保存有價值的植物基因型，同時建立有效的再生體系[14]。盡管有多項(xiàng)關(guān)于通過微繁殖進(jìn)行芽增殖的報道（表2），但通過從頭再生獲得完整植株的報道較少[59]。

漢麻微繁殖方式包括直接和間接器官發(fā)生，包含腋芽、枝梢、子葉和上胚軸的節(jié)段用于直接器官發(fā)生[62-63]。MX麻醉品種在含有0.5 μmol/L（相當(dāng)于0.11 mg）噻二唑酮（thidiazuron，TDZ）的MS培養(yǎng)基上獲得最佳繁殖率（每個外植體12～14個芽）；可在加入2.5 μmol/L（0.51 mg）吲哚-3-丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）的半強(qiáng)度MS培養(yǎng)基上生根[63]。

表2 漢麻的細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化和微繁研究[59-61]

Table 2 Study on cells culture, transformation and micro reproduction of hemp[59-61]

基因型研究類型外植體最佳培養(yǎng)基結(jié)果 OSU細(xì)胞懸浮培養(yǎng)幼苗組織0.1 mg·L?1 NAA＋0.25 mg·L?1 KIN＋1 mg·L?1酪蛋白水解物愈傷組織大量形成 C-71、TU-A愈傷組織形成幼苗組織MS＋1 mg·L?1 2,4-D＋0.1 mg·L?1 KIN愈傷組織大量形成 C-150、C-152愈傷組織形成和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)苞片、花萼和葉組織MS＋I(xiàn)AA (0.25、1 mg·L?1)＋0.5 mg·L?1 NAA＋0.2 mg·L?1；2,4-D+2 mg·L?1 KIN＋1 mg·L?1酪蛋白水解物愈傷組織大量形成，但2,4-D限制了根的形成 OSU愈傷組織形成和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)幼苗組織MS＋維生素B5＋0.1 mg·L?1 2,4-D＋0.5 mg·L?1 KIN培養(yǎng)6～8周后，獲得愈傷組織 F56、F77無性插條的生根和發(fā)芽腋芽芽增殖：MS＋1 mg·L?1 BAP＋0.02 mg·L?1 IBA生根：MS＋0.2%活性炭＋2 mg·L?1 IBA2個芽/外植體，47.7%響應(yīng) 未知細(xì)胞懸浮培養(yǎng)葉組織B5培養(yǎng)基＋1 mg·L?1 2,4-D＋0.5 mg·L?1 KIN＋3%葡萄糖漢麻的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)能夠?qū)BD轉(zhuǎn)化為結(jié)合的CBE，將THC轉(zhuǎn)化為CBC MX-1芽增殖和體外生根節(jié)點(diǎn)段芽增殖：MS＋0.1 mg·L?1 TDZ生根：1/2MS＋0.5 mg·L?1 IBA＋0.05%活性炭芽增殖：12.6個芽/外植體生根：4.8個根/外植體 Mexican variety直接器官發(fā)生：離體根和芽增殖節(jié)點(diǎn)段芽增殖：MS＋0.5 mg·L?1 mT生根：MS＋0.5 mg·L?1 mT芽增殖：13.4個芽/外植體生根：13.8個根/外植體 1KG2TF、S1525、H5458未成熟和成熟花序的芽再生花卉組織芽誘導(dǎo)：MS＋2 mg·L?1 TDZ生根：MS＋0.4 mg·L?1 KIN＋0.1 mg·L?1 NAA 芽誘導(dǎo)：4個芽/花簇生根：大多數(shù)生根 Bialobriezskie、Tygra、Fibrol、Monoica、USO-31插條直接器官發(fā)生幼苗芽增殖：IMB4＋1.5 mg·L?1 KIN＋0.25 mg·L?1 BAP9THP＋40.5 mg·L?1腺嘌呤半硫酸鹽生根：1/2MS＋0.04 mg·L?1 NAA 芽增殖：4.4個芽/外植體生根：未統(tǒng)計 BA-1、BA-2、BA-41、BA-49、BA-61、BA-71愈傷組織形成，芽增殖具有2個節(jié)點(diǎn)的莖段芽增殖：DKW＋0.11 mg·L?1 TDZ芽增殖：2.23個芽/外植體 Epsilon 68的E1、E4、E40芽再生和體外生根腋芽、芽尖的節(jié)段芽增殖：1/2MS＋0.5 mg·L?1 IAA生根：1/2MS＋0.5 mg·L?1 IAA 芽增殖：2.5個芽/外植體生根：74.6%生根 MX-CBD-11MX-CBD-707腋芽再生腋芽芽增殖：MS＋0.5 mg·L?1 mT 芽增殖：1.78個芽/外植體 Sud Italian愈傷組織和芽再生葉、下胚軸、子葉和根愈傷組織/芽再生：MS＋維生B5＋3～10 mg·L?1 2,4-D＋0.01～0.09 mg·L?1 BAP愈傷組織/芽再生：偶爾會從下胚軸組織產(chǎn)生愈傷組織。 Silesia、Juso-15、Novosadska、Fibrimon-24、Fedrina-74愈傷組織的完整植株再生葉柄、腋芽愈傷組織和節(jié)間愈傷組織愈傷組織誘導(dǎo)：MS＋麥草畏（2、3 mg·L?1）芽誘導(dǎo)：MS＋麥草畏（2、3 mg·L?1）生根：MS＋0.1 mg·L?1 IAA＋0.1 mg·L?1 NAA愈傷組織誘導(dǎo)：52.3%誘導(dǎo)率芽誘導(dǎo)：2.5%誘導(dǎo)率生根：69.9%的小苗形成根

續(xù)表2

mT-間-托泊林 BAP9THP-6-芐基氨基-9-（四羥基吡喃基）嘌呤 BAP-6-芐基氨基嘌呤 DARIA (ind+)、DARIA (pro+)、DARIA (root+)-3種不同類型適用于木本植物生長的Daria培養(yǎng)基，分別有助于愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生和生根

mT-meta-topolin BAP9THP-6--benzyl-9-(tetrahydro-2-pyran-2-yl)adenine BAP-6-benzylaminopurine DARIA (ind+), DARIA (pro+), DARIA (root+)-three different types of Daria media suitable for woody plant growth are helpful to callus induction, somatic embryogenesis and rooting, respectively

纖維品種的繁殖率比較低，每個外植體的最大繁殖率在3～3.2個芽[62,64]。中國漢麻品種（Changtu）在添加0.2 mg/L TDZ和0.1 mg/L α-萘乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA）的MS培養(yǎng)基上每個外植體可以產(chǎn)生3.2個枝梢。在具有IBA和NAA的半強(qiáng)度MS培養(yǎng)基上，生根率達(dá)到85%，并且95%的植物在進(jìn)一步馴化后仍然存活[62]。Feeney等[65]使用4個纖維麻品種的葉子、莖、葉柄和子葉來獲得愈傷組織，在愈傷組織形成方面，最有效的培養(yǎng)基是添加了維生素B5以及2,4-二氯苯丙氨酸（2,4 dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D）和6-芐基氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，BA）或激動素（kinetin，KIN）的MS培養(yǎng)基，在培養(yǎng)4周后生根，但未實(shí)現(xiàn)芽再生。Slusarkiewicz-Jarzina等[66]利用不同類型的外植體（幼葉、葉柄、節(jié)間和腋芽）的愈傷組織獲得再生芽。其中葉柄外植體在含有2～3 mg/L麥草畏（dicamba）的MS培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到87%。也有通過從上胚軸誘導(dǎo)愈傷組織再生的報道，該研究使用伊朗大麻的子葉和上胚軸為外植體，在含有2 mg/L BA和0.5 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基上再生率最高（每個愈傷組織2個芽）[65]。Ioannidis等[67]開發(fā)了一種有效的體外微繁殖方法，用于大規(guī)模生產(chǎn)2種CBD和CBG高含量的漢麻品種。當(dāng)全強(qiáng)度和半強(qiáng)度MS培養(yǎng)基均添加4.0 μmol/L BA時，可獲得最高的平均芽數(shù)和芽長。培育高含量CBD品種，全強(qiáng)度培養(yǎng)基中的最高芽數(shù)為3.63個，最長為5.66 cm，而半強(qiáng)度培養(yǎng)基中的最高芽數(shù)為3.13個，最長為5.09 cm。培育高含量CBG品種，全強(qiáng)度培養(yǎng)基平均植株芽數(shù)為3.38個，平均長度為6.23 cm，而半強(qiáng)度培養(yǎng)基中的平均芽數(shù)為3.08個，平均長度為5.99 cm。CBG和CBD高含量的2個品種都具有較好的生根率，分別達(dá)到了87.50%和83.33%，成活率均達(dá)到了97%。

4.2 漢麻的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化及毛狀根的誘導(dǎo)

漢麻對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化具有相對抗性[66]，但已有文獻(xiàn)報道了基因轉(zhuǎn)化和再生的方法[65-66,68-70]。由于再生效率低，對品種、組織、植物年齡的依賴性高以及缺乏轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性等原因，漢麻的基因轉(zhuǎn)化至今仍然是一個挑戰(zhàn)。Mackinnon等[71]第1個報道了漢麻成功轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)，選擇芽尖外植體及根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將半乳糖苷酶抑制蛋白基因（polygalacturonase-inhibiting proteins，）和除草劑抗性基因成功引入漢麻中。在另1項(xiàng)研究中，利用攜帶二元pNOV3635載體的根瘤菌（EHA101）將愈傷組織細(xì)胞成功引入編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI）的基因，愈傷組織能夠表達(dá)基因，但不能實(shí)現(xiàn)器官和植株的再生[65]。Wahby等[69]報道了使用發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌品系（A4、AR10、C58和IVIA251）對漢麻進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，研究者使用了5 d齡的幼苗，并發(fā)現(xiàn)能在下胚軸和子葉節(jié)衍生的外植體上誘導(dǎo)毛狀根，但未能使幼苗再生。Zhang等[72]報道了使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法，成功生成了4株具有白化表型的基因編輯的漢麻幼苗，且繁殖了轉(zhuǎn)基因植物并驗(yàn)證了T-DNA在漢麻基因組中能夠穩(wěn)定遺傳給后代。

只有漢麻毛根被證實(shí)易受農(nóng)桿菌侵染，從而在很短的時間誘發(fā)轉(zhuǎn)化根培養(yǎng)物[69]。毛狀根培養(yǎng)物在無激素的培養(yǎng)基中具有很高的生長速率，并且具有產(chǎn)生與野生型相當(dāng)?shù)拇紊x產(chǎn)物的潛力[73]，是漢麻遺傳轉(zhuǎn)化和功能基因組學(xué)研究的重要途徑之一。毛狀根培養(yǎng)物具有諸多優(yōu)點(diǎn)：對次生代謝產(chǎn)物的生物合成能力高、生長和生物量積累快、遺傳穩(wěn)定性高、生產(chǎn)成本低等。Sirikantaramas等[52]首次報道了在根培養(yǎng)物中產(chǎn)生大麻素的研究。研究者使用煙草毛狀根培養(yǎng)物，從漢麻葉片（麻醉品種）中分離出，并對其cDNA進(jìn)行克隆和測序。在花椰菜花葉病毒的pBI121質(zhì)粒載體中，用帶有的發(fā)根農(nóng)桿菌（15834株）轉(zhuǎn)化煙草的毛狀根。轉(zhuǎn)化的根培養(yǎng)物能夠表達(dá)，并將外源添加的CBGA轉(zhuǎn)化為THCA，最高轉(zhuǎn)化率僅為8.2%。Farag等[74]從愈傷組織培養(yǎng)中建立了不定根。愈傷組織培養(yǎng)8周后，向B5固體培養(yǎng)基中添加生長素（NAA、IBA、IAA），從愈傷組織中誘導(dǎo)不定根，在黑暗條件下添加4 mg/L NAA的培養(yǎng)基上獲得了令人滿意的生長和根分化。隨后，將根尖轉(zhuǎn)移至恒定補(bǔ)充生長素（IAA、IBA、NAA）的液體培養(yǎng)基（1/2B5）中培養(yǎng)。在這項(xiàng)研究中，大麻素的最大產(chǎn)量為THCA 1 μg/g（干質(zhì)量）、CBGA 1.6 μg/g（干質(zhì)量）和CBDA 1.7 μg/g（干質(zhì)量）。研究結(jié)果也顯示在黑暗條件下（28 d的生長周期），毛狀根培養(yǎng)物中大麻素含量非常低。

5 結(jié)語

盡管人們在研究大麻素的生物合成方面付出了大量努力，但仍存在很多問題。如多種酶的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制尚不清楚，對其他將近200種次要大麻素的產(chǎn)生途徑和潛在應(yīng)用價值也知之甚少，植物中不同毛狀體的相互作用及調(diào)控機(jī)制仍不清楚；同時對漢麻生理活性的研究只限于THC和CBD，隨著大麻素活性物質(zhì)的藥理作用越來越清晰，需要更深入地解析合成途徑，以便可以在植物或重組載體中重新設(shè)計，選擇性地生產(chǎn)高活性、高價值的大麻素及其衍生物。

用微生物發(fā)酵生產(chǎn)主要大麻素與植物競爭將是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)，但是，異源大麻素生產(chǎn)能夠產(chǎn)生用于醫(yī)藥用途的稀有或新的大麻素，除了主要的大麻素THC和CBD之外，合成生物學(xué)可用于構(gòu)建一種底盤生物體，用于研究和表征參與那些含量較少的大麻素或其衍生物的生物合成的酶，并通過發(fā)酵生產(chǎn)活性化合物，使其達(dá)到工業(yè)化的生產(chǎn)水平。在植物方面，可以通過設(shè)計新型酶而合成植物大麻素，如漢麻酚類CBD及漢麻萜類精油等，進(jìn)一步通過植物育種還可以提高這些稀有且對疾病治療及健康有益的大麻素的產(chǎn)量?？傊?，這些策略將有助于挖掘和利用大麻素作為藥物的潛在價值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on biosynthesis regulation of phenolic active substances in

CUI Su-juan3, WU Wen-bo3, XIE Yang1, LI Peng1, SUI Xin1, ZHANG Xiao-chen1, GUO Chun-jing1, LI Guang-ze4, YIN Jing2, 3

1. High Tech Research Institute of Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150020, China 2. Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 3. College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 4. Shenzhen Noposion Agrochemicals Co., Ltd., Shenzhen 518102, China

L.,(hemp is an annual and typically dioecious flowering crop with medicinal and psychoactive properties. It is the main source of phytocannabinoids and getting more attention due to the therapeutic potential for human diseases. Besides the main constituent Δ9-tetrahydrocannabinol (THC), the phenolic compounds with nonpsychoactive effects, such as cannabidiol (CBD), is high value as drug candidate for antitumor. From the more than 600 known cannabinoids reported, most can only be extracted in very low amounts. It is urgent to apply new biotechnologies to improve the efficient synthesis of cannabinoids due to its wide range of medical, daily chemical and industrial applications. The ogenous biosynthesis of cannabinoids can achieve low cost and fast production, culture methods of various tissue, such as microreproduction, cell suspension culture, hair root culture, and-mediated gene transformation, they have the potential application for breeding and novel trait development, as well as mass propagation of cannabis. The pharmacology of cannabphenen compounds, synthesis accumulation rules and the latest progress of cannabphenophen biosynthesis have been reviewsed, and the important achievements in tissue culture of cannabis were discussed in this paper, in order to provide scientific basis and important reference for the biosynthesis and utilization of hemp phenols.

L. (hemp); phenolic compounds; metabolic pathway; synthetic biology; tissue culture

R282.1

A

0253 - 2670(2022)04 - 1240 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.032

2021-07-21

院企聯(lián)合橫向課題（YQLH09GJS10）；中央高校基本業(yè)務(wù)科研基金（20200522-4）

崔素娟（1995—），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物代謝調(diào)控與利用。E-mail: 18742899729@163.com

尹 靜（1978—），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物代謝調(diào)控與細(xì)胞工程利用。E-mail: yinjing20135@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]