藜蘆屬藥用植物的葉綠體基因組比較分析和系統(tǒng)發(fā)育研究

田 星，劉瑩瑩，張穎敏，楊從衛(wèi)，錢子剛*，李國棟*

? 藥材與資源 ?

藜蘆屬藥用植物的葉綠體基因組比較分析和系統(tǒng)發(fā)育研究

田 星1，劉瑩瑩2，張穎敏1，楊從衛(wèi)1，錢子剛1*，李國棟1*

1. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室，云南 昆明 650500 2. 云南省食品藥品審核查驗中心，云南 昆明 650106

以藜蘆屬藥用植物蒙自藜蘆、大理藜蘆、狹葉藜蘆和毛葉藜蘆為材料，對其葉綠體基因組進(jìn)行組裝和序列分析。采用高通量測序技術(shù)對4種植物葉綠體基因組進(jìn)行測序，并且使用NOVOPlasty和Geneious R11軟件分別組裝和注釋序列，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行基本結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析。藜蘆屬4種植物葉綠體基因組具有典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，全長151 875～153 711 bp，總GC含量37.7%～37.8%。藜蘆屬葉綠體基因組均注釋到135個基因，其中蛋白質(zhì)編碼基因83～84個，rRNA基因8個和tRNA基因38個。通過比較發(fā)現(xiàn)，4種植物IR區(qū)邊界未出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張或收縮；毛葉藜蘆葉綠體基因組序列較保守，變異位點少；蒙自藜蘆、大理藜蘆和狹葉藜蘆序列變異較大，種間差異較?。淮送?，在一個大單拷貝區(qū)（large single copy region，LSC）和小單拷貝區(qū)（small single copy region，SSC）區(qū)篩選到13個高變片段。系統(tǒng)發(fā)育研究表明，毛葉藜蘆與蒙自藜蘆、大理藜蘆和狹葉藜蘆親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，后兩者親緣關(guān)系最近。對藜蘆屬4種植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了分析，為后續(xù)開展分子鑒定及群體遺傳學(xué)研究提供了數(shù)據(jù)資料。

藜蘆屬；葉綠體基因組；高通量測序；序列變異；系統(tǒng)發(fā)育

藜蘆屬L.，隸屬于百合科，中國分布有13種和1變種，該屬植物多具有顯著的藥用價值，被廣泛用于催吐、化瘀、止痛等。披麻草作為國家保密配方制劑“云南白藥”和國家中藥保護(hù)品種“一粒止痛丸”[1]主要組成藥物之一，其基原為藜蘆屬植物。在《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》[2]中收錄的披麻草基原植物為百合科藜蘆屬蒙自藜蘆Loes. f、大理藜蘆Loes. f、狹葉藜蘆Diels和毛葉藜蘆(Maxim.) Loes. f的干燥根及根莖；在《中華本草》[3]和《中藥大辭典》[4]中記載披麻草為大理藜蘆和狹葉藜蘆的根；在《云南中藥志》[5]中記載披麻草為蒙自藜蘆的根；《中藥辭海》[6]收錄披麻草為大理藜蘆的根及根莖；另外在《中國植物志》[7]和《中國高等植物圖鑒》[8]中大理藜蘆、蒙自藜蘆和狹葉藜蘆別名均有被稱作披麻草，可見在不同資料中記載的披麻草的基原植物存在爭議。

披麻草作為藥物首載于《云南中草藥選》[9]，現(xiàn)收載于1996年版《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》[2]，別名小棕包、天蒜、千張紙、大力王等[3]，根據(jù)《昆明民間常用草藥》[10]中記載：披麻草味麻苦、性涼，有大毒。全草或根及根莖入藥，具有內(nèi)服催吐、撐骨、祛竊；外用止血、止痛、通竅的功效。目前，披麻草除了作為“云南白藥”和“一粒止痛丸”的主要組成藥物，也被廣泛用于其他傷科藥物中[11]，其顯著的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值，對于傷科藥物的發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義[12]。但近年來由于披麻草未進(jìn)入規(guī)?；斯しN植，使用完全依賴自然生長緩慢的野生資源[13]，資源趨向漸危狀態(tài)，越來越不能滿足日常用藥需求，從而導(dǎo)致披麻草基原植物使用混亂，市場上混偽品較多。因此采用分子生物學(xué)手段來解決基原和用藥問題已經(jīng)是迫在眉睫。

葉綠體是進(jìn)行光合作用的重要細(xì)胞器，存在于植物、藻類和一些原生生物中。葉綠體是半自主性細(xì)胞器，擁有自己的基因組，稱為葉綠體基因組（chloroplast DNA，cpDNA）[14-15]。隨著測序技術(shù)進(jìn)步和測序成本的降低，越來越多的研究以葉綠體基因組為基礎(chǔ)展開。如陽春砂[16]、美麗芍藥[17]、金鐵鎖[18]、蕓薹[19]等藥用植物的系統(tǒng)發(fā)育研究。呂瑞華等[20]采用和ITS2序列對商陸資源及其混偽品進(jìn)行了識別和鑒定，為商陸資源品種現(xiàn)狀與分布研究提供了理論依據(jù)。董博然等[21]對龍膽科5屬27個分類群葉綠體基因組進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明龍膽屬多枝組的短柄龍膽與秦艽組植物聚為一支，在親緣關(guān)系上與秦艽組更近。

本研究通過對3種藜蘆屬植物（蒙自藜蘆、大理藜蘆、狹葉藜蘆）進(jìn)行葉綠體基因組測序得到的序列以及課題組前期對毛葉藜蘆葉綠體基因組測序獲得的序列（GenBank登錄號：MN613592）進(jìn)行分析，揭示其基本特征與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期為披麻草的基原植物、分子鑒定、資源保護(hù)與開發(fā)利用等研究提供參考資料。

1 材料

藜蘆屬4種植物新鮮葉片采自8個不同居群，采樣信息見表1，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)李國棟副教授鑒定，憑證標(biāo)本存放于云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥材優(yōu)良種苗繁育中心。

表1 藜蘆屬4種植物居群基本信息

Table 1 Information on eight populations of four Veratrum plants

種名拉丁名采集地居群編號經(jīng)度（E）緯度（N）憑證標(biāo)本GenBank登錄號 蒙自藜蘆V. mengtzeanumLoes. f云南省賓川縣VmBC100°25′25°35′5329240001 云南省麗江市VmLJ100°14′27°02′5307000001 大理藜蘆V. taliense Loes. f云南省師宗縣VtSZ103°59′24°45′5303230001 云南省漾濞縣VtYB100°04′25°43′5329220001 云南省賓川縣VtBC100°25′25°35′5329240002 云南省澄江縣VtCJ102°31′24°27′5304220001 狹葉藜蘆V. stenophyllum Diels云南省鶴慶縣VsHQ100°17′26°42′5329320001 毛葉藜蘆V. grandiflorum (Maxim.) Loes. f云南省昭通市VgZT103°05′27°12′MN613592

2 方法

2.1 基因組DNA的提取和測序

取新鮮幼嫩葉片，利用植物基因組DNA提取試劑盒（BioTeke公司）提取總DNA。使用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop One超微量分光光度計（美國賽默飛世爾科技有限公司）檢測DNA質(zhì)量及濃度。將檢測合格的DNA送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用Illumina HiSeq2500-PE150平臺進(jìn)行建庫測序。

2.2 葉綠體基因組的組裝、注釋及物理圖譜繪制

將測序獲得的raw reads使用NGS QC Toolkit[22]濾過掉低質(zhì)量區(qū)獲得clean reads。以尖被藜蘆（NC022715）作為參考序列，采用NOVOPlasty[23]組裝葉綠體基因組。再使用DOGMA[24]對藜蘆屬4種植物葉綠體基因組進(jìn)行注釋，以蒙自藜蘆（NC045300）葉綠體基因組作為參考序列，并且使用Geneious R11進(jìn)行手動修正注釋。用在線軟件OGDraw[25]繪制葉綠體基因組物理圖譜。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用MISA[26]軟件分析葉綠體基因組SSR位點。設(shè)置參數(shù)：單核苷酸重復(fù)≥10；二核苷酸重復(fù)≥5；三核苷酸重復(fù)≥4；四、五、六核苷酸重復(fù)≥3。通過在線軟件REPuter[27]分析散在重復(fù)序列，參數(shù)設(shè)置：最小重復(fù)序列長度為30（minimal repeat size＝30），最多堿基錯配為3（hamming distance＝3）。使用IRscope[28]和在線比對工具mVISTA[29]分別進(jìn)行IR區(qū)邊界收縮/擴(kuò)張和全基因組比對分析。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

為確定4種植物在藜蘆屬中的系統(tǒng)位置，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載9條藜蘆屬葉綠體基因組序列，分別是毛穗藜蘆Regel（MN613590）；藜蘆L.（MN613595）；長梗藜蘆Loes. f（MN613593）；牯嶺藜蘆(Baker) Loes. f（MN613588）；黑紫藜蘆Loes. f（MN613594）；南川藜蘆S. Z. Chen & G. J. Xu（MN613591）；興安藜蘆(Turcz.) Loes. f（MN699635）；尖被藜蘆Turcz（MW147219）；尖被藜蘆Turcz（NC022715）；以熊尾草(Pursh) Nutt（NC027158）和丫蕊花Franch.（NC044639）作為外類群。基于Model Finder[30]的Akaike Information Criterion（AIC）篩選出核苷酸的最佳替代模型，然后使用Phylosuite軟件分別構(gòu)建最大似然（maximum likelihood，ML）系統(tǒng)發(fā)育樹和貝葉斯（bayesian，BI）系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap＝1000）。

3 結(jié)果與分析

3.1 葉綠體基因組基本特征及分類

藜蘆屬4種植物的葉綠體基因組均為典型的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)（圖1），包括1個大單拷貝區(qū)（large single copy region，LSC）；1個小單拷貝區(qū)（small single copy region，SSC）和1對反向重復(fù)區(qū)（inverted repeat，IR）。序列總長度151 875～153 711 bp，總GC含量37.7%～37.8%；LSC、SSC、IR區(qū)長度和GC含量分別為：81 967～83 367 bp、17 537～17 628 bp、26 148～26 358 bp；35.7%～35.8%、31.4%～31.5%、42.9%～43.0%。所有序列均注釋到135個基因，蛋白質(zhì)編碼基因83～84個，rRNA基因8個和tRNA基因38個（表2）。

圖1 藜蘆屬4種植物葉綠體基因組圖譜

4種植物全部基因分類情況如表3所示，根據(jù)其功能可以分為4大類：與光合作用有關(guān)的基因（45個）、與自我復(fù)制有關(guān)的基因（74個）、未知功能的蛋白質(zhì)基因（10個）以及成熟酶基因（）、囊膜蛋白基因（）等其他基因（6個）。在這些基因中含有21個雙拷貝基因，包括2個核糖體大亞基（、）、2個核糖體小亞基（、）、4個rRNA基因（、、、）、8個tRNA基因（trnA、trnH、trnI、trnI、trnL、trnN、trnR、trnV）、1個NADH脫氫酶（）、4個未知功能基因（、、、）。總共含有20個內(nèi)含子，其中、、、trnA、trnG、trnI、trnK、trnL、trnV、、、、、基因各包含1個內(nèi)含子，、和基因各包含2個內(nèi)含子，并且基因位于LSC區(qū)和IR區(qū)，被分成2個獨立的轉(zhuǎn)錄單元，為反式剪接基因（-splicing gene）。

表2 藜蘆屬植物葉綠體基因組基本特征

Table 2 Comparison of chloroplast genomes features of Veratrum plants

居群WholeLSCSSCIR基因數(shù)量蛋白編碼基因rRNA基因tRNA基因 長度/bpGC/%長度/bpGC/%長度/bpGC/%長度/bpGC/% VmBC151 88837.881 96735.817 53731.526 19243.013584838 VmLJ152 17637.882 23835.817 54231.526 19843.013584838 VtSZ151 87537.882 02935.817 55031.526 14843.013584838 VtYB152 03737.882 11935.817 55831.526 18043.013584838 VtBC152 06237.882 12435.817 54231.526 19243.013584838 VtCJ152 06137.882 12335.817 54231.526 19843.013584838 VsHQ152 05437.882 10835.817 55031.526 19843.013584838 VgZT153 71137.783 36735.717 62831.426 35842.913583838

表3 藜蘆屬植物葉綠體基因組基因分類

Table 3 List of genes of Veratrum plants chloroplast genomes

基因分類基因分組基因名稱 self-replicationlarge subunit of ribosomalrpl2a,c、rpl14、rpl16a、rpl20、rpl22、rpl23c、rpl32、rpl33、rpl36 small subunit of ribosomalrps2、rps3、rps4、rps7c、rps8、rps11、rps12b,c,d、rps14、rps15、rps18、rps19 DNA dependent RNA polymeraserpoA、rpoB、rpoC1a、rpoC2 rRNA genesrrn4.5c、rrn5c、rrn16c、rrn23c tRNA genestrnAUGCa,c、trnCGCA、trnDGUC、trnEUUC、trnFGAA、trnfMCAU、trnGGCC、trnGUCCa、trnHGUGc、trnICAUc、trnIGAUa,c、trnKUUUa、trnLCAAc、trnLUAAa、trnLUAG、trnMCAU、trnNGUUc、trnPUGG、trnQUUG、trnRACGc、trnRUCU、trnSGCU、trnSGGA、trnSUGA、trnTGGU、trnTUGU、trnVGACc、trnVUACa、trnWCCA、trnYGUA gene for photosynthesisphotosystem IpsaA、psaB、psaC、psaI、psaJ photosystem IIpsbA、psbB、psbC、psbD、psbE、psbF、psbH、psbI、psbJ、psbK、psbL、psbM、psbN、psbT、psbZ NadH oxidoreductasendhAa、ndhBa,c、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH、ndhI、ndhJ、ndhK cytochrome b6/f complexpetA、petBa、petDa、petG、petL、petN ATP synthaseatpAa、atpB、atpE、atpF、atpH、atpI rubiscorbcL other genesmaturasematK translationalinfA proteaseclpPb envelop membrane proteincemA subunit of acetyl-CoAaccD c-type cytochrome synthesis geneccsA unknown functionconserved open reading framesycf1c、ycf2c、ycf3b、ycf4、ycf15c、ycf68c a包含1個內(nèi)含子；b包含2個內(nèi)含子；c雙拷貝基因；d反式剪接基因aGene containing a single intron; bGene containing two introns; cGene with two copies; dTrans-splicing gene

a包含1個內(nèi)含子；b包含2個內(nèi)含子；c雙拷貝基因；d反式剪接基因

aGene containing a single intron;bGene containing two introns;cGene with two copies;dTrans-splicing gene

3.2 散在重復(fù)序列及SSR分析

4種植物葉綠體全基因組序列檢測到長度不小于30且重復(fù)序列間相似度大于90%的散在重復(fù)序列分別為正向重復(fù)（forward repeats，F(xiàn)）12～14條、反向重復(fù)（reverse repeats，R）1～3條、回文重復(fù)（palindromic repeats，P）18～21條、互補重復(fù)（complement repeats，C）除VmBC、VtSZ、VsHQ居群各1條外，其余居群未檢測到互補重復(fù)序列（表4）。

在8個居群葉綠體基因組序列中，總共檢測到SSR位點64～72個（表5），其中單核苷酸重復(fù)為41～50個、二核苷酸重復(fù)為10～13個、三核苷酸重復(fù)3～4個、四核苷酸重復(fù)5～6個、五核苷酸重復(fù)1～5個，未檢測到六核苷酸重復(fù)。重復(fù)最多的是單核苷酸重復(fù)（59.42%～69.70%），且主要是A/T的重復(fù)（表6），占總重復(fù)類型的63.93%，緊接著為AT/AT重復(fù)（16.82%）、C/G重復(fù)（3.36%）、AAAG/CTTT重復(fù)（3.00%）。這些SSR主要分布于葉綠體基因組的LSC區(qū)（66.67%～78.79%），編碼基因序列中分布的SSR數(shù)量僅占總數(shù)的19.44%～25.00%。

表4 藜蘆屬植物散在重復(fù)序列

Table 4 Interspered repeat sequences information of Veratrum plants

居群重復(fù)條數(shù) 正向重復(fù)反向重復(fù)回文序列互補序列 VmBC141181 VmLJ13118/ VtSZ133211 VtYB13319/ VtBC13319/ VtCJ13319/ VsHQ123191 VgZT13319/

3.3 IR區(qū)邊界比較分析

在葉綠體基因組中，IR區(qū)與LSC和SSC區(qū)存在4個邊界，即LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa、IRa/LSC。本研究中藜蘆屬植物葉綠體基因組4個邊界相對保守（圖2）。8個居群中VmBC、VmLJ、VtYB、VtBC、VtCJ、VsHQ居群的LSC/IRb邊界均在基因內(nèi)，且基因均有277 bp分布在LSC區(qū)、2 bp分布在IRb區(qū)；VtSZ和VgZT居群的基因均位于LSC區(qū)，分別距LSC/IRb邊界49、3 bp。在IRb/SSC邊界的基因終止子缺失，為一個假基因，所有居群的IRb/SSC、SSC/IRa邊界分別處于假基因和基因內(nèi)，且假基因大部分分布在IRb區(qū)（960～991 bp），有1～9 bp位于SSC區(qū)；基因大部分分布在SSC區(qū)（4401～4398 bp），有960～991 bp分布在IRa區(qū)。IRa/LSC邊界在所有居群中均位于與基因之間。

表5 藜蘆屬植物葉綠體基因組中SSR位點類型及數(shù)量

Table 5 Type and number of SSR loci of four Veratrum plants chloroplast genomes

居群SSR位點數(shù)（占比/%） 單核苷酸二核苷酸三核苷酸四核苷酸五核苷酸IRSSCLSCCDS VmBC50(69.44)10(13.89)4(5.56)6(8.33)2(2.78)016(22.22)56(77.78)14(19.44) VmLJ41(64.06)12(18.75)4(6.25)6(9.38)1(1.56)015(23.44)49(76.56)14(21.88) VtSZ46(69.70)11(16.67)3(4.55)5(7.58)1(1.52)014(21.21)52(78.79)16(24.24) VtYB44(68.75)11(17.19)3(4.69)5(7.81)1(1.56)014(21.88)50(78.13)16(25.00) VtBC46(69.70)11(16.67)3(4.55)5(7.58)1(1.52)014(21.21)52(78.79)15(22.73) VtCJ45(69.23)11(16.92)3(4.62)5(7.69)1(1.54)014(21.54)51(78.46)15(23.08) VsHQ47(69.12)11(16.18)3(4.41)5(7.35)2(2.94)016(23.53)52(76.47)15(22.06) VgZT41(59.42)13(18.84)4(5.80)6(8.70)5(7.25)2(2.90)21(30.43)46(66.67)15(21.74)

表6 藜蘆屬植物葉綠體基因組SSR重復(fù)類型

Table 6 Repeat types of SSR of four Veratrum plants

重復(fù)類型居群重復(fù)數(shù)量占比/% VmBCVmLJVtSZVtYBVtBCVtCJVsHQVgZT A/T473844424443453963.93 C/G 3 3 2 2 2 2 2 2 3.36 AT/AT101211111111111316.82 AAG/CTT 1 1 1 1 1 1 1 2 1.68 AAT/ATT 1 1 / / / / / 1 0.56 ACT/AGT 1 1 1 1 1 1 1 1 1.50 AGG/CCT 1 1 1 1 1 1 1 / 1.31 AAAG/CTTT 2 2 2 2 2 2 2 2 3.00 AAAT/ATTT 2 2 1 1 1 1 1 2 2.06 AATG/ATTC 2 2 2 2 2 2 2 2 3.00 AAAGT/ACTTT 1 1 1 1 1 1 1 / 1.31 AATAT/ATATT 1 1 / / / / / / 0.37 AAAAT/ATTTT / / / / / / / 1 0.19 AATAG/ATTCT / / / / / / / 2 0.37 AATGG/ATTCC / / / / / / 1 / 0.19 ACTAT/AGTAT / / / / / / / 1 0.19 ATATC/ATATG / / / / / / / 1 0.19

圖2 藜蘆屬植物葉綠體全基因組IR邊界的比較示意圖

3.4 葉綠體基因組比對及特異性DNA條形碼篩選

利用mVISTA在線軟件對藜蘆屬8個居群葉綠體基因組進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，在居群水平上，毛葉藜蘆居群葉綠體基因組序列較保守，變異位點少，其他7個居群在種內(nèi)序列變異較大，種間差異較小，在、trnD-trnY、、trnT-trnL、、ndhB-trnL區(qū)存在不同程度的變異（圖3）。整體上，變異較高的區(qū)域基本集中在LSC和SSC區(qū)域的非編碼區(qū)，編碼區(qū)比較保守。

使用DnaSP 6軟件的多態(tài)性分析檢測藜蘆屬4種植物葉綠體基因組中的高度可變區(qū)。核苷酸多樣性（Pi）整體變化范圍為0～0.008，且LSC區(qū)和SSC區(qū)核苷酸多樣性高于IR區(qū)。在圖4中標(biāo)記了Pi＞0.006的基因片段，分別是LSC區(qū)（trnK-psbI、trnL-ndhJ、trnV-atpE、）、SSC區(qū)（ndhF-trnL、、）。

圖4 藜蘆屬植物葉綠體基因組核苷酸多樣性

3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

篩選出核苷酸的最佳替代模型為GTR＋I(xiàn)＋G，使用Phylosuite軟件對測序獲得的藜蘆屬8個居群葉綠體基因組以及NCBI下載的9條藜蘆屬序列和2條其他屬外類群分別構(gòu)建最大似然（maximum likelihood，ML)和貝葉斯（bayesian，BI)系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖5所示，藜蘆屬被明顯分為了5個進(jìn)化枝，毛葉藜蘆在A節(jié)點和蒙自藜蘆、大理藜蘆、狹葉藜蘆分化開（支持率100%），并且與南川藜蘆親緣關(guān)系最近；蒙自藜蘆在B節(jié)點與大理藜蘆和狹葉藜蘆分化開（支持率100%）形成進(jìn)化枝III；大理藜蘆和狹葉藜蘆在C節(jié)點處分別形成了進(jìn)化枝I和進(jìn)化枝II（支持率100%），親緣關(guān)系較近。

圖5 基于19個葉綠體基因組構(gòu)建的藜蘆屬ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

披麻草作為“云南白藥”和“一粒止痛丸”的主要組成藥物，由于未進(jìn)入規(guī)范化人工種植和過度采挖，導(dǎo)致野生居群數(shù)量急劇下降。目前，研究者們?yōu)榱吮Ｗo(hù)和合理開發(fā)披麻草野生資源，對其進(jìn)行了植物分類學(xué)[12]、生藥學(xué)鑒定[1]、化學(xué)成分[31]、藥理作用[32-34]等方面的研究。然而關(guān)于披麻草基原植物葉綠體基因組的研究還尚未見報道。

葉綠體作為植物進(jìn)行光合作用的場所，在植物的整個生命過程中具有重要意義，其基因組序列高度保守。本研究對披麻草基原植物葉綠體基因組進(jìn)行了分析，結(jié)果表明其基本結(jié)構(gòu)均為環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，基因組大小差異較小，最大差僅1836 bp，LSC區(qū)差異最大（1400 bp）?？侴C含量37.7%～37.8%；IR區(qū)的GC含量最高（42.9%～43.0%），所有居群均注釋到135個基因，蛋白質(zhì)編碼基因83～84個，rRNA和tRNA基因分別為8、38個。這與金鐵鎖[18]、湖北麥冬[35]、三葉崖爬藤[36]等的研究結(jié)果相似，體現(xiàn)出葉綠體基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，總體進(jìn)化速率較慢。

SSR分子標(biāo)記由于其數(shù)量豐富、多態(tài)性高、信息含量高、不受外界環(huán)境等因素的影響，并且是共顯性遺傳已被廣泛用于藥用植物的群體遺傳學(xué)研究[37-38]。本研究共檢測到SSR位點64～72個，重復(fù)最多的是單核苷酸重復(fù)（59.42%～69.70%），其次為二核苷酸重復(fù)（13.89%～18.84%），主要重復(fù)類型是A/T重復(fù)，緊接著為AT/AT重復(fù)，共占比80.75%。張明英等[39]報道了柴胡屬葉綠體基因組SSR主要由polyA或polyT構(gòu)成，此結(jié)果與本實驗的研究結(jié)果一致。此外，在8個居群中檢測到散在重復(fù)序列32～38條。這些SSR以及散在重復(fù)序列為今后開發(fā)披麻草SSR標(biāo)記以及群體遺傳學(xué)研究提供了候選分子標(biāo)記。

在葉綠體基因組中，其差異主要體現(xiàn)在IR區(qū)邊界的收縮和擴(kuò)張上。本研究中藜蘆屬4種植物葉綠體基因組在4個邊界上除LSC/IRb邊界存在微小的差異外，其余邊界均較保守。在IRb/SSC邊界的基因終止子缺失，為1個假基因。此現(xiàn)象在石豆蘭屬[40]、菜頭腎[41]等植物中也有報道。基于mVISTA和Pi分析結(jié)果顯示，在、trnD-trnY、、trnT-trnL、、ndhB-trnL、trnK-psbI、trnL-ndhJ、trnV-atpE、、ndhF-trnL、、區(qū)存在明顯變異，這些片段可為披麻草分子鑒定的特異性DNA條形碼的篩選提供參考。

基于ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，毛葉藜蘆與其他3個種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，蒙自藜蘆、大理藜蘆和狹葉藜蘆親緣關(guān)系較近。披麻草作為藥用價值較高的傷科藥物，在不同資料中記載的基原植物存在爭議。本研究結(jié)果顯示：從葉綠體基因組角度分析，毛葉藜蘆同其他3個種葉綠體基因組序列差異較大，變異較小；ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹一致表明毛葉藜蘆與其他3個種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本課題組前期通過《中國植物志》[7]中的描述對披麻草基原植物進(jìn)行鑒定時發(fā)現(xiàn)蒙自藜蘆、大理藜蘆、狹葉藜蘆形態(tài)學(xué)特征（花序、葉片、果實）極其相似，僅存在微小的差異，如蒙自藜蘆花被片上存在明顯的腺體，大理藜蘆莖多分枝，花序相對密集，狹葉藜蘆莖幾乎沒有分支，花序相對擴(kuò)展，而毛葉藜蘆與前三者形態(tài)差異較大，其葉片、花被片和花序較前3者寬大；在對披麻草藥材鑒定時發(fā)現(xiàn)蒙自藜蘆、大理藜蘆、狹葉藜蘆藥材外觀性狀十分相似，但毛葉藜蘆藥材外觀性狀和大小與前三者差異較大。

目前，研究者們從蒙自藜蘆中分離了藜蘆胺、藜蘆明寧、藜蘆胺--氧化物、3-當(dāng)歸?；嬅鲏A、胡蘿卜苷等11個化合物[42]；從大理藜蘆中分離了大理藜蘆堿A～D、介藜蘆胺、介芬胺、狹葉藜蘆堿乙、3-藜蘆酰棋盤花胺、計明堿、新大理藜蘆堿A和B等14個化合物[43-45]；從狹葉藜蘆中分離了藜蘆胺、棋盤花胺、介藜蘆胺、介芬胺、狹葉藜蘆堿甲～丁、β-查茄堿、原藜蘆堿B、季明堿等22個化合物[46-47]；從毛葉藜蘆中分離并鑒定了藜蘆胺、表紅介芬胺、介芬胺、3-當(dāng)歸?；灞P花胺、藜蘆托素、表紅介藜蘆堿、異玉紅芥芬胺、桑皮苷A、等21個化合物[48-49]。從分離出的化學(xué)成分可以看出雖然4種植物化學(xué)成分有所差異，但基本結(jié)構(gòu)類型都涉及了藜蘆胺型、介藜蘆堿型的甾體生物堿。楊崇仁等[42]報道了蒙自藜蘆須根中的甾體生物堿以藜蘆胺的含量較高，并且藥理實驗表明藜蘆胺有鎮(zhèn)痛和降壓的生理活性；Li等[50]采用醋酸致小鼠扭體法和角叉菜膠致小鼠足腫脹法得出大理藜蘆中介芬胺型生物堿具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用；馬麗焱等[34]發(fā)現(xiàn)狹葉藜蘆堿甲有較強且持久的降壓和減慢心率的生理活性。劉瑩瑩[11]對披麻草基原植物中藜蘆胺和介芬胺含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明4種植物間藜蘆胺和介芬胺含量差異較大，不同藥用部位含量差異也較大，其中根及根莖含量最高，此結(jié)果表明了披麻草以根及根莖入藥的合理性。

綜上所述，本研究從葉綠體基因組角度認(rèn)為蒙自藜蘆、大理藜蘆、狹葉藜蘆為披麻草基原植物比較合理，為披麻草基原問題提供了葉綠體基因組方面的資料。但披麻草化學(xué)成分和藥理研究表明4種植物均含有藜蘆胺型和介藜蘆堿型甾體生物堿，且是鎮(zhèn)痛和降壓作用的主要活性成分，說明4種植物間差異不大，該結(jié)果沒有支持本研究結(jié)果，原因可能是由于目前藥理研究僅是針對1種植物進(jìn)行研究，而沒有將4種植物一起進(jìn)行藥理比對所致。因此，后期還需從藥理活性、化學(xué)等方面進(jìn)一步深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative and phylogeny analysis of fourmedicinal plants complete chloroplast genomes

TIAN Xing1, LIU Ying-ying2, ZHANG Ying-min1, YANG Cong-wei1, QIAN Zi-gang1, LI Guo-dong1

1. Yunnan Key Laboratory of Dai and Yi Medicines, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China 2. Center for Food and Drug Inspection of Yunnan, Kunming 650106, China

The chloroplast genomes of,,andwere sequenced and assembled, laying a foundation for the further development of molecular identification and population genetics.The chloroplast genomes of fourplants were sequenced using high-throughput sequencing technology. NOVOPlasty and Geneious R11 were used to assemble and annotate the chloroplast genomes from the sequence reads respectively. Comparative and phylogenetic analyses were conducted based on gene annotation results.The chloroplast genomes ofplants were 151 875—153 711 bp in length, GC content of 37.7%—37.8% and both exhibited the typical quadripartite circular structure. A total of 135 genes were annotated, including 83—84 protein-coding genes, 38 tRNA genes, eight rRNA genes. Comparative analyses of chloroplast genomes in fourplants revealed that no obvious expansion or contraction of the inverted repeat regions. The chloroplast genome sequence ofwas relatively conservative, with fewer mutation sites. The sequences variation of,andwere relatively large, and the interspecific differentiation were relatively small. In addition, 13 sequences with higher variation interspecific were detected in the LSC and SSC regions. Phylogenetic trees showed thathad farther relationship with,,, and the relationship betweenandwas the closest.The complete chloroplast genome of fourmedicinal plants and phylogenetic relations were analyzed in this study, and the results will provide data information for the further development of molecular identification and population genetics.

; chloroplast genome; high-throughput sequencing; sequence variation; phylogeny

R282.12

A

0253 - 2670(2022)04 - 1127 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.021

2021-08-09

國家自然科學(xué)基金資助項目（81560613）；2018年中醫(yī)藥公共衛(wèi)生服務(wù)補助專項“全國中藥資源普查項目”（財社[2018]43號）；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才（202105AC160050）；云南省高層次人才培養(yǎng)支持計劃“青年拔尖人才”專項（YNWR-QNBJ-2020-278）

田 星（1997—），男，碩士，研究方向為中藥資源開發(fā)與利用。E-mail: 820393356@qq.com

李國棟，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為分子生藥學(xué)。E-mail:liguodong@ynutcm.edu.cn

錢子剛，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥資源學(xué)。E-mail: qianzig@aliyun.com

[責(zé)任編輯 時圣明]