基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討澤瀉三萜抗肝纖維化的作用機(jī)制

江 雯，葉 晨，胡 熳，劉鈺偲，張 艷，梁繼超，陳 勇

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討澤瀉三萜抗肝纖維化的作用機(jī)制

江 雯，葉 晨，胡 熳，劉鈺偲，張 艷，梁繼超*，陳 勇*

湖北大學(xué) 藥物高通量篩選技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 中藥生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建生物催化與酶工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探究澤瀉三萜成分抗肝纖維化的潛在作用機(jī)制。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選及文獻(xiàn)調(diào)研選取以澤瀉三萜中8種活性成分為研究對(duì)象，利用Swiss Target Prediction網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)；通過(guò)GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與肝纖維化有關(guān)的靶點(diǎn)，借助Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“活性成分-抗肝纖維化靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并通過(guò)度值篩選核心成分；使用String平臺(tái)進(jìn)行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，結(jié)合Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，通過(guò)度值、節(jié)點(diǎn)緊密度、節(jié)點(diǎn)介度篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)；采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)澤瀉三萜抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；使用AutoDock軟件對(duì)核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接；考察乙酰澤瀉醇C對(duì)油酸和棕櫚酸誘導(dǎo)的小鼠正常肝細(xì)胞（NCTC-1469）上清液一氧化氮（nitric oxide，NO）水平的影響。篩選出澤瀉三萜中8種活性成分包括24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B、乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C、澤瀉內(nèi)酯D、25-甲氧基澤瀉醇F，預(yù)測(cè)得到35個(gè)抗肝纖維化靶點(diǎn)，4個(gè)核心成分包括乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C，4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)包括蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PRKCA）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、磷酯酰肌醇-3激酶催化亞基γ（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit γ，PIK3CG）、MAPK8；基因富集分析得到GO功能條目142個(gè)、通路69條（＜0.05）；分子對(duì)接結(jié)果顯示，核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均有較強(qiáng)的潛在結(jié)合能力；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，澤瀉三萜成分主要通過(guò)作用于脂多糖反應(yīng)、凋亡等生物過(guò)程及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、MAPK等信號(hào)通路發(fā)揮抗肝纖維化作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乙酰澤瀉醇C顯著降低肝損傷細(xì)胞模型NO水平（＜0.05）。澤瀉三萜中的活性成分乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C可能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK、PI3K/Akt等信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

澤瀉三萜；肝纖維化；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；乙酰澤瀉醇B；16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B；澤瀉醇C；乙酰澤瀉醇C

肝纖維化的本質(zhì)是慢性肝病過(guò)程中的一種可逆的肝組織損傷過(guò)度修復(fù)反應(yīng)。肝纖維化的主要發(fā)病機(jī)制包括肝脂代謝及能量代謝紊亂、慢性肝炎病毒感染等各種慢性損傷因素[1]，誘導(dǎo)靜止型肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞樣細(xì)胞[2]，誘導(dǎo)生成大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）[3]，并逐漸沉積于肝實(shí)質(zhì)形成纖維瘢痕，同時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子引發(fā)纖維結(jié)締組織過(guò)度增生，最終可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌[4]。引起肝纖維化的常見(jiàn)疾病包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、酒精性肝炎、遺傳代謝性肝病及膽汁瘀積性肝病等。目前NASH的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)迅速上升[5-6]，約1/3以上的患者可能進(jìn)展為纖維化[7]。

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉(Sam.) Juzep.的干燥塊莖，具有利水滲濕、化濁調(diào)脂等功效[8]。作為澤瀉的活性成分，澤瀉三萜類(lèi)化合物具有抗炎等多方面活性[9-10]。高慧等[11]發(fā)現(xiàn)活血清肝飲（含澤瀉）可改善患者肝纖維化。韓曉穎等[12]發(fā)現(xiàn)澤瀉湯能夠顯著降低纖維化指標(biāo)。此外多種有改善肝纖維化作用的中藥組方含有澤瀉[13-15]。研究表明，澤瀉三萜單體化合物24-乙酰澤瀉醇A可降低NASH小鼠模型中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[16]；23-乙酰澤瀉醇B通過(guò)激活法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）降低膽堿蛋氨酸缺乏誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟炎癥標(biāo)志物細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte ehemoattractant protein-1，）及纖維化標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transformed growth factor-β1，）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，）mRNA表達(dá)[17]。但澤瀉抗肝纖維化的作用機(jī)制并不明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[18]和分子對(duì)接的方法，以澤瀉三萜類(lèi)成分為研究對(duì)象，預(yù)測(cè)分析澤瀉三萜主要活性成分及其抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)，并利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，為揭示澤瀉的抗纖維化機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞

小鼠正常肝細(xì)胞NCTC-1469購(gòu)買(mǎi)自杭州海晟生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

乙酰澤瀉醇C（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)B21764）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四季青胎牛血清購(gòu)自杭州天杭生物科技有限公司；雙抗（青霉素和鏈霉素）、胰酶、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；油酸鈉（批號(hào)A1529012）購(gòu)自上海阿拉丁生物公司；棕櫚酸、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaHCO3購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)S0023）購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)23225）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）；液氮罐（成都金鳳液氮容器有限公司）；立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；XDS-1B型倒置相差顯微鏡（北京佳源興業(yè)科技有限公司）；BP211D型電子天平（德國(guó)Startorius公司）；JA3003型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；iMARKTM酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.1.1 澤瀉三萜類(lèi)活性成分庫(kù)的構(gòu)建 澤瀉三萜類(lèi)成分是澤瀉分離出的主要化學(xué)成分，也是主要的活性成分。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)與分析平臺(tái)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[19]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、中醫(yī)藥證候關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)SymMap平臺(tái)[20]（http:// www.symmap.org/）及文獻(xiàn)檢索查詢(xún)澤瀉的三萜類(lèi)化學(xué)成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類(lèi)藥性（drug- likeness，DL）≥0.18作為篩選條件[21]；在SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)定OB≥30%作為篩選條件獲取有效三萜類(lèi)成分[21]，同時(shí)查閱相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充部分未收錄但已經(jīng)報(bào)道的活性三萜類(lèi)成分以構(gòu)成澤瀉三萜類(lèi)活性成分庫(kù)。使用有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)檢索到的各個(gè)成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)，對(duì)于未收錄的化學(xué)成分根據(jù)文獻(xiàn)通過(guò)ChemDraw進(jìn)行繪制，均保存為sdf格式文件。

2.1.2 澤瀉三萜類(lèi)活性成分靶點(diǎn)庫(kù)的構(gòu)建 利用Swiss Target Prediction靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)[22]（http:// www.swisstargetprediction.ch/）、藥效團(tuán)匹配與潛在識(shí)別靶標(biāo)平臺(tái)PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)[23]（http://www. lilab-ecust.cn/pharmmapper/）預(yù)測(cè)澤瀉三萜類(lèi)活性成分的作用靶點(diǎn)蛋白。在Swiss Target Prediction平臺(tái)中導(dǎo)入化合物結(jié)構(gòu)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，篩選Probability＞0，得到相關(guān)的靶點(diǎn)名稱(chēng)、Uniprot ID等結(jié)果；在PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)中基于藥效團(tuán)模型預(yù)測(cè)化合物的靶標(biāo)蛋白，選擇“Human Protein Targets Only”，設(shè)置最終產(chǎn)生300個(gè)蛋白構(gòu)象，獲得所選成分潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果。將所篩選的活性成分靶點(diǎn)導(dǎo)入至Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www. uniprot.org/uploadlists/），限定物種為“human”，將檢索得到的所有蛋白靶標(biāo)校正為Uniprot ID，并得到靶標(biāo)蛋白所對(duì)應(yīng)的基因名。

2.1.3 肝纖維化疾病靶點(diǎn)庫(kù)的構(gòu)建 以“l(fā)iver fibrosis”“hepatic fibrosis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim. org/）、CTD（http://ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索肝纖維化疾病相關(guān)靶點(diǎn)，整合3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果并刪除重復(fù)的基因靶點(diǎn)，得到肝纖維化疾病相關(guān)的靶點(diǎn)以構(gòu)建肝纖維化疾病靶點(diǎn)庫(kù)。

2.1.4 澤瀉三萜的“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將澤瀉三萜類(lèi)活性成分靶點(diǎn)庫(kù)與肝纖維化疾病靶點(diǎn)庫(kù)取交集，獲得澤瀉三萜類(lèi)活性成分治療肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件將活性成分與潛在作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果導(dǎo)入，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，通過(guò)節(jié)點(diǎn)和邊表示關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)及其之間的關(guān)系。利用Network Analyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，通過(guò)參考拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)對(duì)比化合物在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，參數(shù)包括節(jié)點(diǎn)介數(shù)中心性、節(jié)點(diǎn)緊密度和度值等，分析主要活性成分及核心靶點(diǎn)。

2.1.5 澤瀉三萜類(lèi)“活性成分-肝纖維化”潛在靶點(diǎn)的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用String平臺(tái)[24]（https://www. string-db.org/），將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入后設(shè)置物種為“Homo sapiens”，將最低相互作用分值設(shè)為“medium confidence＝0.4”，隱藏沒(méi)有相互作用聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，其他參數(shù)設(shè)置不變以獲得PPI關(guān)系，導(dǎo)出數(shù)據(jù)文件，之后導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)行可視化分析，設(shè)置參數(shù)使節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺反映度值的大小，邊的粗細(xì)反映結(jié)合率評(píng)分的高低，建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.1.6 澤瀉三萜類(lèi)“活性成分-肝纖維化”潛在作用靶點(diǎn)的京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路和基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析 使用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 6.8生物信息學(xué)分析平臺(tái)（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），將潛在作用靶點(diǎn)的Symbol錄入后，Identifier選擇為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，物種為“Homo sapiens”，列表類(lèi)型為“Gene List”，進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析，以研究澤瀉三萜類(lèi)活性成分抗肝纖維化的主要生物功能包括可能存在的生物過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC），并根據(jù)值使用GraphPad v8.3繪制柱狀圖；進(jìn)行KEGG通路分析，以研究澤瀉三萜類(lèi)活性成分抗肝纖維化的主要信號(hào)通路，將結(jié)果通過(guò)生物信息分析平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制成氣泡圖進(jìn)行可視化。

2.1.7 澤瀉三萜的“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 篩選澤瀉三萜類(lèi)活性成分靶點(diǎn)富集得到抗肝纖維化的主要信號(hào)通路以及各通路對(duì)應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn)，導(dǎo)入至CytoScape 3.7.2軟件[25]中構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，利用Network Analyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，參數(shù)包括度值、介度等，分析主要活性成分及核心靶點(diǎn)。

2.1.8 澤瀉三萜活性成分與潛在靶點(diǎn)分子對(duì)接 為更好地闡述澤瀉三萜活性成分抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的活性成分之間的結(jié)合活性，將“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的核心成分與關(guān)鍵潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)[26]（http://www.wwpdb.org/）中下載關(guān)鍵潛在靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)并保存為pdb格式，運(yùn)用PyMOL軟件進(jìn)行蛋白受體分子的前處理，運(yùn)用Chemdraw 3D軟件進(jìn)行活性化合物配體的前處理。將前處理好的潛在靶點(diǎn)和活性化合物成分導(dǎo)入對(duì)接軟件AutoDock[27]中進(jìn)行分子對(duì)接，將結(jié)果保存為pdbqt格式。借助Open Babel 2.2軟件將結(jié)果文件轉(zhuǎn)化為pdb格式，使用PyMOL軟件將對(duì)接得分較高且構(gòu)象較穩(wěn)定的化合物與靶點(diǎn)蛋白，進(jìn)行分子對(duì)接可視化分析。依據(jù)結(jié)果參數(shù)文件中配體與受體的結(jié)合能來(lái)判斷結(jié)合活性和可能性，一般認(rèn)為配體與受體的結(jié)合能越低，其結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能＜0 kJ/mol認(rèn)為化合物和靶蛋白可以自發(fā)結(jié)合，≤?17.78 kJ/mol時(shí)認(rèn)為具有一定的結(jié)合活性，≤?20.92 kJ/mol時(shí)認(rèn)為具有較好的結(jié)合活性，≤?29.29 kJ/mol時(shí)認(rèn)為結(jié)合活性比較強(qiáng)烈[28]。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NCTC-1469細(xì)胞用含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

2.2.2 NO測(cè)定 將NCTC-1469細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，設(shè)置對(duì)照組、模型組和乙酰澤瀉醇C（8、16、32 μmol/L）組，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，其余各組用含0.5 mmol/L油酸和0.25 mmol/L棕櫚酸的高糖DMEM完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)處理24 h使細(xì)胞脂肪變性[29]；各給藥組再加入藥物處理24 h，收集細(xì)胞。加入裂解液裂解細(xì)胞，取上清，一部分用于檢測(cè)NO含量，另一部分檢測(cè)蛋白濃度。使用總NO檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NO含量，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。以對(duì)照組NO含量與蛋白濃度的比值為100%，計(jì)算各孔細(xì)胞內(nèi)NO的相對(duì)含量。

3 結(jié)果

3.1 澤瀉三萜活性化學(xué)成分的篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到澤瀉中的活性成分共46個(gè)，SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到75個(gè)活性成分，根據(jù)ADME和Lipinski類(lèi)藥五規(guī)則[30]標(biāo)準(zhǔn)篩選并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[17,31-32]補(bǔ)充，分析選取8個(gè)澤瀉三萜類(lèi)活性成分為研究對(duì)象，分別為24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B、乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C、澤瀉內(nèi)酯D、25-甲氧基澤瀉醇F，其化合物結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

3.2 澤瀉三萜活性化學(xué)成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

將各個(gè)澤瀉三萜類(lèi)活性成分分別導(dǎo)入Swiss Target Prediction和PharmMapper預(yù)測(cè)活性成分的潛在靶點(diǎn)，Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)結(jié)果選擇各個(gè)化合物可能性最高的前15位預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果篩選“Norm Fit＞0.9”的靶點(diǎn)，合并后刪除重復(fù)值共獲得111個(gè)基因靶點(diǎn)。

3.3 肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)獲取結(jié)果

通過(guò)GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出7238個(gè)靶點(diǎn)，OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出6161個(gè)靶點(diǎn)，CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出93 367個(gè)靶點(diǎn)，根據(jù)相關(guān)性打分篩選，合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選結(jié)果并去除重復(fù)項(xiàng)共選取1330個(gè)靶點(diǎn)，采用這些靶點(diǎn)組建了肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

3.4 澤瀉三萜“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析

利用VENNY2.1在線平臺(tái)（https://bioinfogp cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對(duì)澤瀉三萜類(lèi)活性成分靶點(diǎn)與肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到澤瀉三萜類(lèi)活性成分治療肝纖維化可能的35個(gè)作用靶點(diǎn)基因，包括絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PRKCA）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARG）、磷酯酰肌醇-3激酶催化亞基γ（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit γ，PIK3CG）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等，交集靶點(diǎn)信息見(jiàn)表1。將篩選出的8個(gè)澤瀉三萜活性成分和35個(gè)潛在作用靶點(diǎn)利用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行“活性成分-肝纖維化”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)果如圖2所示，該網(wǎng)絡(luò)包含43個(gè)節(jié)點(diǎn)，165條相互作用的邊，外圈節(jié)點(diǎn)表示35個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，內(nèi)圈節(jié)點(diǎn)表示8個(gè)活性成分。進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)分析，得到節(jié)點(diǎn)介度、節(jié)點(diǎn)緊密度、度值等數(shù)據(jù)，其中度值代表與節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的邊的數(shù)量，度值越大，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。由表2可以看出，乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C具有較好的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，在“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中較其他化合物更重要。

圖1 澤瀉三萜成分化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fig. 1 Chemical structures of triterpenes from A. orientalis

表1 澤瀉三萜活性成分靶點(diǎn)與肝纖維化靶點(diǎn)交集信息

Table 1 Intersection information between triterpene active components of A. orientalis and hepatic fibrosis targets

Uniprot ID靶點(diǎn)Uniprot ID靶點(diǎn) P35228NOS2P42574CASP3 Q13133NR1H3P04035HMGCR P06276BCHEP35968KDR P37231PPARGP08254MMP3 Q05655PRKCDP02766TTR P09211GSTP1P25024CXCR1 Q14994NR1I3P28482MAPK1 P04150NR3C1P48736PIK3CG Q16539MAPK14Q00987MDM2 P02774GCP00533EGFR P55055NR1H2Q9HBA0TRPV4 P00734F2P45983MAPK8 P35354PTGS2P80188LCN2 P12643BMP2P02768ALB P03372ESR1O75469NR1I2 P04062GBAP10275AR P62937PPIAP17252PRKCA P49841GSK3B

3.5 澤瀉三萜“活性成分-肝纖維化”潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

借助String平臺(tái)輸入35個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，獲得包含35節(jié)點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，隱藏沒(méi)有相互作用聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，如圖3所示，共34個(gè)節(jié)點(diǎn)，度值越大，節(jié)點(diǎn)越大；連接評(píng)分越高，邊越粗。拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)表明，PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)介度的中位數(shù)為0.005 862 64、節(jié)點(diǎn)緊密度的中位數(shù)為0.550 152 82、度值的中位數(shù)為8，經(jīng)3個(gè)參數(shù)綜合篩選關(guān)聯(lián)度最高的3個(gè)靶點(diǎn)分別為白蛋白（albumin，ALB）、MAPK1和EGFR，提示它們可能是澤瀉三萜活性成分抗肝纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 澤瀉三萜“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 澤瀉三萜在“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵W(xué)分析

Table 2 Topological analysis of A. orientalis triterpenes in network of “active ingredients-potential targets against liver fibrosis”

成分介數(shù)中心性緊密度度值 乙酰澤瀉醇B0.164 576 560.560 000 0022 16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B0.152 336 230.545 454 5521 澤瀉醇C0.173 364 280.545 454 5521 乙酰澤瀉醇C0.148 704 160.531 645 5720 澤瀉醇B0.153 719 170.506 024 1018 24-乙酰澤瀉醇A0.096 293 670.471 910 1115 25-甲氧基澤瀉醇F0.052 383 620.451 612 9013 澤瀉內(nèi)酯D0.070 236 710.415 841 589

3.6 澤瀉三萜“活性成分-肝纖維化”潛在靶點(diǎn)GO功能與KEGG通路富集分析

通過(guò)DAVID 6.8在線平臺(tái)對(duì)35個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，設(shè)定＜0.05，總共富集到142條生物學(xué)過(guò)程或通路，其中96個(gè)與BP相關(guān)、15個(gè)與MF相關(guān)、31個(gè)與CC相關(guān)。根據(jù)值從小到大排列，各選取排名前10位結(jié)果繪制柱狀圖，由圖4可以看出，澤瀉三萜活性成分可能參與眾多過(guò)程，BP主要涉及甾體激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、脂多糖的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）介導(dǎo)的信號(hào)通路、MAPK活性、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）活性等；MF主要涉及到類(lèi)固醇激素受體活性、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、MAPK活性等；CC主要涉及蛋白質(zhì)復(fù)合體、細(xì)胞核、胞質(zhì)、核質(zhì)等。

圖3 澤瀉三萜“活性成分-肝纖維化”潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖

對(duì)35個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，設(shè)定＜0.05，共獲得69條富集通路，按照值從小到大排列且篩選富集靶點(diǎn)數(shù)＞5的通路，結(jié)合文獻(xiàn)篩選出與肝纖維化相關(guān)的14條主要通路，14條通路的富集氣泡圖見(jiàn)圖5，包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路、酪氨酸激酶受體2（tyrosine kinase receptor 2，ErbB）信號(hào)通路、炎癥介質(zhì)對(duì)瞬時(shí)感受器電位（transient receptor potential，TRP）通道的調(diào)節(jié)、胰島素抵抗、甲狀腺激素信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。

圖4 GO功能富集分析(前10)

圖5 KEGG通路富集分析

3.7 澤瀉三萜“活性成分-抗肝纖維化潛在靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)KEGG通路富集分析結(jié)果選取的14條相關(guān)性高的信號(hào)通路，同時(shí)與這些相關(guān)通路的靶點(diǎn)建立相互作用聯(lián)系，將活性成分、通路靶點(diǎn)、信號(hào)通路通過(guò)CytoScape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化，如圖6所示，包括58個(gè)節(jié)點(diǎn)和238條邊，根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)數(shù)據(jù)表明，乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C可能是澤瀉三萜治療肝纖維化的主要活性成分；PRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8可能是澤瀉三萜治療肝纖維化的主要作用靶點(diǎn)。

圖6 澤瀉三萜“活性成分-潛在靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)

3.8 澤瀉三萜主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

根據(jù)GO功能及KEGG通路富集分析結(jié)果，初步選擇“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值較大的4個(gè)作用靶點(diǎn)PRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8，分別以4個(gè)度值較大的核心成分乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C為對(duì)象進(jìn)行分子對(duì)接。選取該靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的配體作為參考來(lái)對(duì)比對(duì)接結(jié)果，所選取的靶點(diǎn)信息和對(duì)接打分情況如表3所示。所有核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能均≤?20.92 kJ/mol，其中乙酰澤瀉醇B與MAPK1、PIK3CG、MAPK8結(jié)合能≤?29.29 kJ/mol且強(qiáng)于PIK3CG特異性配體；16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B與MAPK8結(jié)合能≤?29.29 kJ/mol；澤瀉醇C與MAPK1、MAPK8結(jié)合能≤?29.29 kJ/mol且強(qiáng)于MAPK1特異性配體；乙酰澤瀉醇C與MAPK1、MAPK8結(jié)合能≤?29.29 kJ/mol且強(qiáng)于MAPK1特異性配體，以上結(jié)果表明活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，它們之間的相互作用見(jiàn)圖7。

表3 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

Table 3 Verification results of molecular docking

靶點(diǎn)PDB ID活性成分結(jié)合能/(kJ·mol?1)抑制劑常數(shù)/(μmol·L?1) PRKCA3IW4乙酰澤瀉醇B?25.1539.55 16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B?22.72105.37 澤瀉醇C?23.0193.11 乙酰澤瀉醇C?26.2824.81 LW4（unique ligands）?43.430.024 67 MAPK16SLG乙酰澤瀉醇B?31.133.53 16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B?25.8629.54 澤瀉醇C?30.794.05 乙酰澤瀉醇C?38.160.206 59 LHZ（unique ligands）?29.336.91 PIK3CG2A4Z乙酰澤瀉醇B?30.254.99 16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B?24.3554.3 澤瀉醇C?23.8566.54 乙酰澤瀉醇C?22.30123.28 BYM（unique ligands）?27.0717.97 MAPK84QTD乙酰澤瀉醇B?32.551.99 16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B?31.712.78 澤瀉醇C?33.051.62 乙酰澤瀉醇C?30.175.18 38Z（unique ligands）?43.810.021 25

圖7 澤瀉三萜主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

3.9 乙酰澤瀉醇C對(duì)NCTC-1469細(xì)胞上清液NO水平的影響

為了研究乙酰澤瀉醇C對(duì)炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響，檢測(cè)乙酰澤瀉醇C對(duì)油酸和棕櫚酸誘導(dǎo)的NCTC-1469細(xì)胞上清液NO水平，結(jié)果如圖8所示，NCTC-1469細(xì)胞經(jīng)油酸和棕櫚酸處理后，細(xì)胞上清液NO水平顯著高于對(duì)照組（＜0.01）；經(jīng)乙酰澤瀉醇C（32 μmol/L）處理24 h后，細(xì)胞上清液NO水平顯著降低（＜0.05）。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05

4 討論

澤瀉具有調(diào)血脂和降血糖等多種藥理作用，常被用于治療脂肪肝、高脂血癥等。近年來(lái)，有大量研究發(fā)現(xiàn)澤瀉三萜成分具有良好的肝保護(hù)作用，尤其是對(duì)非酒精性脂肪性肝臟損傷具有較好的保護(hù)作用，而肝纖維化則是這類(lèi)慢性肝損傷所導(dǎo)致的肝臟細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積產(chǎn)生的綜合效應(yīng)，其作用機(jī)制仍未明確。因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)[33]篩選了澤瀉三萜成分抗肝纖維化的主要活性成分及潛在作用靶點(diǎn)，探討其抗肝纖維化可能的作用機(jī)制。

本研究共篩選出8個(gè)澤瀉三萜類(lèi)活性化學(xué)成分，包括24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B、乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C、澤瀉內(nèi)酯D、25-甲氧基澤瀉醇F。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，澤瀉三萜單體化合物24-乙酰澤瀉醇A可降低NASH小鼠模型中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[17]。23-乙酰澤瀉醇B可通過(guò)激活FXR信號(hào)通路，降低蛋氨酸及膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟炎癥標(biāo)志物及纖維化標(biāo)志物的mRNA水平，從而降低肝臟脂質(zhì)積聚、肝小葉炎癥和細(xì)胞外纖維化水平[18]，Huo等[34]研究表明23-乙酰澤瀉醇B能激活FXR保護(hù)對(duì)α-萘異硫氰酸鹽或雌激素所致肝損傷，對(duì)III型炎癥反應(yīng)有一定的抑制活性，還能改善炎細(xì)胞浸潤(rùn)及肝纖維化。李小艷等[35]發(fā)現(xiàn)澤瀉醇C、23-乙酰澤瀉醇C表現(xiàn)出一定的促進(jìn)小鼠胚胎成纖維3T3-L1細(xì)胞葡萄糖攝取作用，有一定的降血糖功效。此外，Jin等[32]從澤瀉中分離得到的6個(gè)四環(huán)三萜類(lèi)新化合物alisolides A～F均能不同程度地抑制脂多糖誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌Caco2細(xì)胞NO生成，緩解炎癥反應(yīng)。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)澤瀉三萜主要成分進(jìn)行了相關(guān)活性預(yù)測(cè)，以期篩選到具有一定抗NASH肝纖維化活性的澤瀉單體化合物。其中乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C在網(wǎng)絡(luò)中度值較大，可能為主要的活性成分。根據(jù)GO功能和KEGG通路富集分析，進(jìn)一步表明澤瀉三萜成分抗肝纖維化作用可能與TNF信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、炎癥介質(zhì)對(duì)TRP通道的調(diào)節(jié)、胰島素抵抗、FoxO信號(hào)通路等有關(guān)。其中顯著性最高的TNF信號(hào)通路，被報(bào)道可誘導(dǎo)激活下游核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），抑制基因的表達(dá)，刺激HSC增殖和膠原合成，加重肝纖維化的病理進(jìn)程[36]；也有研究認(rèn)為T(mén)NF是炎癥反應(yīng)和肝纖維化的調(diào)節(jié)分子，可激活NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）阻止肝臟損傷和纖維化進(jìn)展[37]。此外成功構(gòu)建了“活性成分-潛在靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，潛在作用靶點(diǎn)中RRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8顯示出較高的關(guān)聯(lián)度，是該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。提示澤瀉三萜活性成分治療肝纖維化與RRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8靶點(diǎn)密切相關(guān)。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，澤瀉三萜成分中度值較高的4種核心成分乙酰澤瀉醇B、16β-甲氧基乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇C、乙酰澤瀉醇C與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)蛋白R(shí)RKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8結(jié)合能均≤?17.78 kJ/mol，并且這4種核心成分與MAPK8的結(jié)合能均≤?20.92 kJ/mol，表明澤瀉活性成分與潛在靶點(diǎn)分子生物親和力高，具有較高的藥效活性，其中乙酰澤瀉醇C與MAPK1靶點(diǎn)結(jié)合能力最好。PRKCA是一種蛋白質(zhì)編碼基因，其相關(guān)通路包括MAPK通路，Pan等[38]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PRKCA可作為促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）、MAPK/ERK等信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，調(diào)節(jié)miR-16從而抑制HSC活化，降低肝纖維化的程度。MAPK1稱(chēng)為ERK2，在細(xì)胞的增殖分化中起著重要的調(diào)控作用[39]。Jeng等[40]發(fā)現(xiàn)ERK2信號(hào)通路通過(guò)FOXM1、MMP9、CD133等多種肝細(xì)胞癌相關(guān)生物標(biāo)志物調(diào)控肝纖維化進(jìn)程，同時(shí)在肝纖維化小鼠模型中，ERK2?/?通過(guò)調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路使肝纖維化細(xì)胞增殖減少、α-SMA蛋白水平降低、肝纖維化程度降低、炎癥反應(yīng)減少。PIK3CG又被稱(chēng)為PI3K，是肌醇磷脂的磷酸化產(chǎn)物，其相關(guān)通路有MAPK通路和2型糖尿病，Lei等[41]發(fā)現(xiàn)miR-101可通過(guò)靶向雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來(lái)減少ECM積累，逆轉(zhuǎn)肝纖維化。MAPK8被稱(chēng)為c-Jun氨基末端激酶1（c-Jun-terminal kinase 1，JNK1），參與炎癥等病理過(guò)程中的調(diào)控[42]。有文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β和血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）均可通過(guò)JNKs激活Smad2和Smad3，導(dǎo)致HSC遷移，其中JNK1?/?小鼠中α-SMA蛋白水平降低，對(duì)肝纖維化有保護(hù)作用[43]。上述文獻(xiàn)研究結(jié)果表明，PRKCA、MAPK1、PIK3CG、MAPK8均與MAPK信號(hào)通路存在一定相關(guān)性。MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路是經(jīng)典的有絲分裂通路，是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)的重要傳遞者。近期的研究表明，MAPK信號(hào)通路與人體多種臟器纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[44]。MAPK信號(hào)通路可以通過(guò)對(duì)HSC活化、增殖、凋亡的調(diào)控參與肝纖維化的形成[45]。NO水平隨肝纖維化程度加深而逐漸升高，可能成為反映肝纖維化及其活動(dòng)性的指標(biāo)之一[46-47]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乙酰澤瀉醇C處理后能降低脂變性細(xì)胞的NO含量。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)乙酰澤瀉醇C可能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路，減少肝細(xì)胞NO的生成，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

綜上所述，本研究系統(tǒng)揭示了澤瀉三萜成分能通過(guò)多靶點(diǎn)-多途徑共同調(diào)控肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為澤瀉的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism oftriterpenes on anti-liver fibrosis effect based on network pharmacology and molecular docking

JIANG Wen, YE Chen, HU Man, LIU Yu-cai, ZHANG Yan, LIANG Ji-chao, CHEN Yong

National & Local Joint Engineering Resarch Center of High-throughput Drug Screening Technology, Hubei Key Laboratory of Biotechnology of Chinese Traditional Medicine, State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, China

To explore the potential mechanism of triterpenoids fromagainst liver fibrosis based on network pharmacology and molecular docking method.According to database screening and literature investigation, eight active components fromtriterpenes were selected as research objects, and their action targets were predicted by Swiss Target Prediction network platform, targets related to liver fibrosis were obtained through GeneCards and OMIM databases, and “active ingredients-anti-liver fibrosis targets” network was constructed by Cytoscape 3.7.2 software; Protein-protein interaction (PPI) analysis was carried out by String platform, PPI network diagram was constructed by Cytoscape 3.7.2 software, key targets were screened by degree value, node tightness and node degree. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on anti-liver fibrosis targets oftriterpenes were carried out by DAVID database; AutoDock software was used for molecular docking between core components and key targets; Effect of acetyl alisol C on nitric oxide (NO) levels in supernatant of NCTC-1469 cells induced by oleic acid and palmitic acid was investigated.Eight active components oftriterpenes including alisol A 24-acetate, alisol B, alisol B monoacetate, 16β-methoxyalisol B monoacetate, alisol C, alisol C monoacetate, alisolides D and 25--methyalisol F were obtained. Thirty-five anti-liver fibrosis targets were predicted, four core components including alisol B monoacetate, 16β-methoxy alisol B monoacetate, alisol C and alisol C monoacetate and four key targets including protein kinase Cα (PRKCA), mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit γ (PIK3CG) and MAPK8 were selected. GO enrichment analysis revealed 142 GO functional entries and 69 pathways (< 0.05). Results of molecular docking showed that core components displayed strong binding abilities with key targets respectively. Network pharmacological analysis showed thattriterpenoids played an anti-hepatic fibrosis role through lipopolysaccharide reaction, apoptosis and other biological processes, as well as tumor necrosis factor (TNF), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt), MAPK and other signal pathways. Results of cell experimentsshowed that NO content in liver injury cell model was decreased after treatment with alisol C monoacetate (< 0.05).Active components oftriterpenes such as alisol B monoacetate, 16β-methoxy alisol B monoacetate, alisol C and alisol C monoacetate may play an anti-liver fibrosis effect by regulating MAPK, PI3K/Akt and other signaling pathways.

triterpenes; liver fibrosis; network pharmacology; alisol B monoacetate; 16β-methoxy alisol B monoacetate; alisol C; alisol C monoacetate

R285.5

A

0253 - 2670(2022)04 - 1100 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.017

2021-10-20

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（X202010512076，X202010512072）

江 雯，女，博士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锱c生化藥學(xué)。Tel: 15972013245 E-mail: jiangwenhubu@gmail.com

梁繼超，男，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事分子藥理學(xué)研究。Tel: (027)88663882 E-mail: liang529114@163.com

陳 勇，男，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事分子藥理學(xué)和藥動(dòng)學(xué)研究。Tel: (027)88663590 E-mail: cy101610@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]