沉香提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

馬家樂(lè)，符昭君，王鑫玉，靳鳳玉，趙一慕，孟英心，王凌瀟，李 軍，鄭 姣

沉香提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

馬家樂(lè)，符昭君，王鑫玉，靳鳳玉，趙一慕，孟英心，王凌瀟，李 軍*，鄭 姣*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029

利用皮質(zhì)酮誘導(dǎo)大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株P(guān)C12損傷，模擬糖皮質(zhì)激素誘發(fā)神經(jīng)功能障礙的病理過(guò)程，探討沉香提取物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。采用400 μmol/L皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞作為神經(jīng)元損傷模型，給予沉香提取物（5、10、20 μg/mL）干預(yù)細(xì)胞24 h后，利用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率；采用Hoechst 33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；通過(guò)Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、cleaved Caspase-3、聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]、cleaved PARP表達(dá)情況。與對(duì)照組比較，皮質(zhì)酮處理PC12細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.01），細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01），cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，給予沉香提取物24 h后細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.05、0.01），凋亡率顯著降低（＜0.01），cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。沉香提取物通過(guò)調(diào)控Caspase-3/PARP通路改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)元。

沉香；PC12細(xì)胞；神經(jīng)損傷；皮質(zhì)酮；凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是一種常見(jiàn)的致殘性精神障礙疾病，影響著全世界約3.5億人[1-2]。當(dāng)抑郁癥發(fā)生時(shí)，機(jī)體感受到應(yīng)激源激活下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary- adrenal，HPA）軸，從而導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)合成糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）。GCs在機(jī)體代謝、免疫功能等多種生命活動(dòng)過(guò)程的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。GCs的分泌和血液中GCs的水平可通過(guò)HPA軸的負(fù)反饋抑制來(lái)調(diào)節(jié)[3]。由于極端或慢性壓力，持續(xù)暴露于血液中高濃度的GCs會(huì)導(dǎo)致HPA軸和負(fù)反饋機(jī)制的功能障礙，導(dǎo)致GCs過(guò)度分泌，從而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損害[4]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡是神經(jīng)功能障礙的原因之一，包括記憶喪失、學(xué)習(xí)障礙和認(rèn)知障礙，還可能引發(fā)焦慮和抑郁等精神障礙[5]。嚙齒動(dòng)物體內(nèi)的GCs主要是皮質(zhì)酮，由于HPA反饋功能障礙，持續(xù)暴露于高濃度皮質(zhì)酮可引起病理性海馬神經(jīng)元損傷，誘發(fā)抑郁樣行為[6]。因此，改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷已成為治療焦慮和抑郁的潛在靶標(biāo)。

沉香為瑞香科沉香屬植物白木香(Lour.) Gilg含樹(shù)脂的木材，是沉香四味散、八味沉香散、沉香化氣丸等經(jīng)典名方的主要組成藥味。沉香作為名貴中藥材已有千年應(yīng)用歷史，被列為“沉檀龍麝”四香之首，具有非常寶貴的藥用價(jià)值。沉香作為藥物始載于梁代陶弘景的《名醫(yī)別錄》，名列上品，曰：“沉香、薰陸香、雞舌香、藿香、詹糖香、楓香并微溫。悉治風(fēng)水毒腫，去惡氣”。在《本草綱目》中，李時(shí)珍就用“去惡氣，清人神”來(lái)描述沉香的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，沉香具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁的作用，但僅為活性篩選和藥效評(píng)價(jià)，尚未深入闡明沉香鎮(zhèn)靜安神的作用機(jī)制[7-10]。大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株P(guān)C12是一種具有典型神經(jīng)元特征并具有高水平GCs受體的細(xì)胞系，已被用作模擬高濃度皮質(zhì)酮刺激時(shí)海馬神經(jīng)元損傷的經(jīng)典模型。因此本研究利用皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型，初步探究沉香提取物的神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制，為沉香防治抑郁癥提供研究基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

PC12細(xì)胞由北京大學(xué)曾克武教授贈(zèng)予。

1.2 藥材

沉香購(gòu)自海南，經(jīng)北京大學(xué)屠鵬飛教授鑒定為瑞香科植物白木香(Lour.) Gilg含樹(shù)脂的木材。

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)11965092）、青霉素-鏈霉素雙抗（批號(hào)15140163）、胎牛血清（批號(hào)12483020）、PBS溶液（批號(hào)20012050）、胰酶（批號(hào)25200072）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)BN15201）購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；皮質(zhì)酮（批號(hào)S30265）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；Hoechst 33258（批號(hào)23491-45-4）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）雙染細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)556547）購(gòu)自美國(guó)BD公司；RIPA裂解液（批號(hào)P0013B）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號(hào)14220S）、聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]抗體（批號(hào)9532T）、β-actin抗體（批號(hào)3700T）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體（批號(hào)7074P2）均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.4 儀器

多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer公司）；冷凍離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf公司）；CriterionTM型電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；DYY-6D型電泳儀（北京六一儀器廠）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；分析型高效液相色譜儀（HPLC，日本島津公司）。

2 方法

2.1 沉香提取物的制備

取沉香藥材粉末10 kg，分別用10、8、8倍量95%乙醇回流提取3次，每次2 h，共得到3 kg浸膏，即為沉香提取物（由北京中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代研究中心化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）。經(jīng)HPLC檢測(cè)沉香提取物中沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.89%。

2.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待2～3 d細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用0.125%的胰酶消化，進(jìn)行傳代處理。

2.3 皮質(zhì)酮對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以4×104/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。空白組不加入細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基后不做任何處理；對(duì)照組用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組分別加入100 μL終濃度為200、400、600、800、1000 μmol/L的皮質(zhì)酮處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃孵育1 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)－空白)/(對(duì)照－空白)

2.4 沉香提取物對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以4×104/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。空白組不加入細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基后不做任何處理；對(duì)照組用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組分別加入100 μL終質(zhì)量濃度為10、50、100、200 μg/mL的沉香提取物處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

2.5 沉香提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型細(xì)胞存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以4×104/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白組、對(duì)照組、模型和給藥組?？瞻捉M不加入細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基后不做任何處理；對(duì)照組用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞；模型組和給藥組加入終濃度為400 μmol/L的皮質(zhì)酮；給藥組再分別加入終質(zhì)量濃度為5、10、20 μg/mL的沉香提取物處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

2.6 Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以8×104/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。按“2.5”項(xiàng)下方法分組及給藥，吸去培養(yǎng)液，加入0.5 mL 4%多聚甲醛組織固定液，固定20 min；PBS溶液洗滌2次，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，37 ℃避光染色20 min；PBS溶液洗滌2次，于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

按“2.6”項(xiàng)下方法分組及給藥，用0.125%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞；PBS溶液洗滌2次，1000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；加入190 μL 1×Binding Buffer混懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，避光室溫放置10 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.8 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

按“2.6”項(xiàng)下方法分組及給藥，PBS溶液洗滌2次，于冰上用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，99 ℃加熱10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別加入Caspase-3、PARP、β-actin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體，4 ℃孵育4 h；TBST洗滌3次后顯影成像，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用表示，兩組之間比較采用檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 皮質(zhì)酮對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，皮質(zhì)酮（200、400、600、800、1000 μmol/L）刺激PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率均顯著降低（＜0.01），表明皮質(zhì)酮能抑制PC12細(xì)胞生長(zhǎng)，且呈劑量相關(guān)性。400 μmol/L皮質(zhì)酮刺激PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為50%，因此選擇400 μmol/L皮質(zhì)酮刺激PC12細(xì)胞24 h作為神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型的實(shí)驗(yàn)條件。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01，圖2同

3.2 沉香提取物對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，沉香提取物（10、50、100 μg/mL）對(duì)PC12細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響，沉香提取物（200 μg/mL）組PC12細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.01）。因此后續(xù)沉香提取物給藥質(zhì)量濃度控制100 μg/mL以內(nèi)。

3.3 沉香提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型細(xì)胞存活率的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組PC12細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，沉香提取物組細(xì)胞存活率均顯著升高（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。提示沉香提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷有良好的保護(hù)作用。

圖2 沉香提取物對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響(, n = 3)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.4 沉香提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33258染色劑是一種核酸染料，能將凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核標(biāo)記為亮藍(lán)色熒光。Hoechst染色結(jié)果見(jiàn)圖4，其中箭頭所指向?yàn)榈蛲黾?xì)胞，與對(duì)照組對(duì)比，模型組發(fā)出亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，表明皮質(zhì)酮能夠?qū)е翽C12細(xì)胞損傷并誘發(fā)細(xì)胞凋亡；沉香提取物組發(fā)出亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且呈劑量相關(guān)性，表明沉香提取物能夠抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)是一種極為靈敏的細(xì)胞凋亡檢測(cè)手段。采用Annexin V-FITC/PI雙染法對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行染色后，利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于不同階段的細(xì)胞進(jìn)行分選。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，模型組Q2象限晚期凋亡和Q4象限早期凋亡細(xì)胞均明顯增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01），表明皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡；與模型組比較，沉香提取物組Q2和Q4象限細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡率降低，呈劑量相關(guān)性，其中沉香提取物（20 μg/mL）組具有顯著性差異（＜0.01），表明沉香提取物可通過(guò)抑制PC12細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。

箭頭所指為凋亡細(xì)胞

3.5 沉香提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型凋亡相關(guān)蛋白的影響

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Caspase-3發(fā)生剪切變成cleaved Caspase-3，同時(shí)激活PARP，誘導(dǎo)PARP蛋白發(fā)生剪切化，因此檢測(cè)Caspase-3和PARP以及相應(yīng)的剪切態(tài)的蛋白表達(dá)，進(jìn)而探究沉香提取物調(diào)控PC12細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)。如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，沉香提取物組細(xì)胞cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），表明沉香提取物可以通過(guò)調(diào)控Caspase-3/PARP抑制PC12細(xì)胞凋亡，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。

4 討論

MDD是一種精神健康障礙，是造成全球疾病負(fù)擔(dān)的主要因素，其特征為普遍且持續(xù)的情緒低落，目前已經(jīng)成為普遍關(guān)注的熱點(diǎn)[11]。然而，由于其發(fā)病機(jī)制不明、致病因素復(fù)雜，臨床上使用的經(jīng)典抗抑郁藥的療效并不理想[12]。苯二氮類藥物的長(zhǎng)期使用或聯(lián)合使用藥物可能會(huì)導(dǎo)致藥物成癮、嗜睡、運(yùn)動(dòng)障礙等嚴(yán)重的不良反應(yīng)[13]。因此，尋找長(zhǎng)期使用安全且不會(huì)造成嚴(yán)重不良反應(yīng)的天然藥物十分必要。中藥沉香作為傳統(tǒng)的理氣藥，其化學(xué)成分和活性已被廣泛報(bào)道[14-15]。Wang等[16]通過(guò)動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，證明了沉香揮發(fā)油具有抗焦慮和抗抑郁作用；王燦紅等[17]通過(guò)化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)沉香有抗焦慮和抗抑郁的“雙重調(diào)節(jié)”作用。然而，目前還沒(méi)有關(guān)于沉香對(duì)于GCs誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其潛在機(jī)制的研究。

本課題組前期研究表明，持續(xù)暴露于高濃度GCs可抑制神經(jīng)元生長(zhǎng)和分化，導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]。用高濃度的皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞已被用作模擬神經(jīng)元損傷的體外經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本研究通過(guò)不同濃度的皮質(zhì)酮處理PC12細(xì)胞建立神經(jīng)元損傷細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)酮顯著降低PC12細(xì)胞存活率，并以劑量相關(guān)性方式加劇細(xì)胞死亡，故選擇400 μmol/L皮質(zhì)酮刺激PC12細(xì)胞24 h作為神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型的實(shí)驗(yàn)條件。如果能保護(hù)神經(jīng)元免受皮質(zhì)酮的損傷，慢性應(yīng)激引起的神經(jīng)功能障礙可能會(huì)減少。因此從神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)的角度，探究沉香提取物的抗抑郁作用。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)給予沉香提取物后，細(xì)胞存活率呈劑量相關(guān)性升高，提示沉香提取物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷有良好的保護(hù)作用。通過(guò)Hoechst 33258染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]，皮質(zhì)酮能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡，沉香提取物可以劑量相關(guān)性地抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

為了探究沉香提取物抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，考察細(xì)胞程序性凋亡途徑相關(guān)蛋白Caspase-3/PARP以及對(duì)應(yīng)剪切態(tài)蛋白的表達(dá)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，部分或全部負(fù)責(zé)許多關(guān)鍵蛋白質(zhì)的蛋白水解裂解。Caspase-3激活后進(jìn)一步切割PARP并觸發(fā)染色體DNA斷裂和片段化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20]。Western blotting結(jié)果顯示，皮質(zhì)酮處理后能激活Caspase-3和PARP的剪切，而沉香提取物以劑量相關(guān)性方式降低了cleaved PARP和cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)水平。表明皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞DNA片段化并觸發(fā)細(xì)胞凋亡，沉香提取物能有效地抑制細(xì)胞凋亡，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)沉香提取物能夠通過(guò)調(diào)控Caspase-3/PARP蛋白，抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，沉香提取物可以作為一種神經(jīng)保護(hù)劑用于受到皮質(zhì)酮損傷的神經(jīng)細(xì)胞，為沉香治療焦慮與抑郁的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect and mechanism ofextract on corticosterone induced PC12 cells injury

MA Jia-le, FU Zhao-jun, WANG Xin-yu, JIN Feng-yu, ZHAO Yi-mu, MENG Ying-xin, WANG Ling-xiao, LI Jun, ZHENG Jiao

Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

Corticosterone was used to induce the injury of rat adrenal medulla pheochromocytoma cell line PC12 to simulate the pathological process of glucocorticoid-induced neurological dysfunction, so as to explore the protective effect and mechanism of Chenxiang () extract on nerve cells.PC12 cells induced by 400 μmol/L corticosterone were used as neuron injury model. After 24 h of intervention withextract (5, 10, 20 μg/mL), cell survival rate was detected by CCK-8 kit; Hoechst 33258 staining and flow cytometry were used to detect cell apoptosis rate; Western blotting was used to detect apoptosis-related proteins cystein-asparate protease-3 (Caspase-3), cleaved Caspase-3, poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) and cleaved PARP expressions.Compared with control group, survival rate of PC12 cells treated with corticosterone for 24 h was significantly decreased (< 0.01), apoptosis rate was significantly increased (< 0.01), cleaved PARP/PARP and cleaved Caspase-3/Caspase-3 protein expressions were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, survival rate of P12 cells treated withextract for 24 h was significantly increased (< 0.05, 0.01), apoptosis rate was significantly decreased (< 0.01), cleaved PARP/PARP and cleaved Caspase-3/Caspase-3 protein expressions were significantly decreased (< 0.01).extract improves corticosterone-induced apoptosis of PC12 cells by regulating PARP/Caspase-3 pathway, thereby protecting neurons.

; PC12 cells; nerve injury; corticosterone; apoptosis; Caspase-3; poly(ADP-ribose)polymerase

R285.5

A

0253 - 2670(2022)04 - 1093 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.016

2021-11-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82003912）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2018YFC1706400）

馬家樂(lè)（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。Tel: 17864191175 E-mail: 17864191175@163.com

李 軍，博士生導(dǎo)師，研究員，主要從事中藥藥效物質(zhì)及作用機(jī)制研究。E-mail: drlj666@163.com

鄭 姣，碩士生導(dǎo)師，副研究員，主要從事中藥藥理研究。E-mail: zj98v2@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]