丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病db/db小鼠腎纖維化及炎癥的影響

胡 琳，葉巧玲，莊和思*，蔣劍平

丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病db/db小鼠腎纖維化及炎癥的影響

胡 琳1, 2，葉巧玲1, 2，莊和思1, 2*，蔣劍平3*

1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310009 2. 杭州市上城區(qū)人民醫(yī)院，浙江 杭州 310021 3. 浙大城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，浙江 杭州 310015

探討丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病db/db小鼠腎纖維化和炎癥的影響。60只雄性db/db小鼠喂食高熱量飼料1周后，給予丹酚酸B或厄貝沙坦干預(yù)8周，另取12只雄性db/m小鼠作為對(duì)照組。監(jiān)測(cè)各組小鼠空腹血糖和體質(zhì)量，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠尿微量白蛋白（urinary microalbumin，mAlb）、尿肌酐（urine creatinine，UCr）和血液尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、三酰甘油（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）含量；采用ELISA法檢測(cè)小鼠腎組織中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量；采用蘇木素-伊紅（HE）、Masson及PAS染色考察小鼠腎組織病理學(xué)變化；采用TUNEL染色觀察小鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況；采用免疫組化法檢測(cè)小鼠腎組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和IV型膠原（collagen type Ⅳ，Col-IV）蛋白表達(dá)情況；采用Western blotting法檢測(cè)小鼠腎組織TGF-β1/Smad和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。與模型組比較，丹酚酸B組小鼠空腹血糖和體質(zhì)量降低（＜0.05），尿液mAlb和血液BUN、TC、TG水平均明顯降低（＜0.05、0.01），尿液UCr水平明顯升高（＜0.05）；腎組織TNF-α和IL-6水平顯著降低（＜0.01）；腎組織病理損傷程度明顯改善，腎組織細(xì)胞凋亡減少，腎組織TGF-β1和Col-IV蛋白表達(dá)減少；腎組織p-Smad2/Smad2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-Smad3/Smad3和TGF-β1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。丹酚酸B能夠改善糖尿病腎病db/db小鼠的腎纖維化和炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1/Smad和NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

丹酚酸B；糖尿病腎??；腎纖維化；炎癥；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1/Smad；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

2型糖尿病是一種臨床常見、多發(fā)病，其患病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1]。糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，研究顯示，2型糖尿病患者在25年后患糖尿病腎病的概率高達(dá)57%[2]。而在引起終末期腎病的因素中，糖尿病腎病占51%[3]。腎纖維化則是伴隨著糖尿病腎病疾病進(jìn)展的典型病理生理改變，也是導(dǎo)致慢性腎病至終末期腎衰竭的常見途徑[4]。

炎癥與糖尿病腎病的發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是炎癥反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子，多種刺激激活NF-κB并促進(jìn)糖尿病腎病中炎癥因子表達(dá)[7]。隨著糖尿病腎病的發(fā)展，炎癥的持續(xù)作用導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的積累，最終導(dǎo)致腎纖維化[8]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）被認(rèn)為是腎纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)， TGF-β1及其下游的Smad信號(hào)通路可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在腎臟中異常積累，而這正是腎纖維化和瘢痕形成的特征[9]。在腎纖維化和炎癥中，Smad3具有致病性，而Smad2和Smad7具有保護(hù)作用[10]。Smad3和Smad7之間的平衡轉(zhuǎn)移導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積累[9,11]，Smad2通過反調(diào)節(jié)Smad3發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[12]。此外，Smads可與NF-κB通路相互作用，來調(diào)節(jié)腎臟炎癥和纖維化。研究表明，抑制TGF-β1可有效防止腎小球增大并減少纖維化[13]。敲除Smad3蛋白可以抑制db/db小鼠的腎臟炎癥和纖維化[14]。因此，TGF-β1/Smad途徑可能是治療糖尿病腎病腎纖維化的潛在靶點(diǎn)。

丹酚酸B是丹參中的活性成分之一，具有多種藥理活性[15]。研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路抑制心肌纖維化，可介導(dǎo)NF-κB改善肝纖維化，并通過作用于磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路抑制高糖誘導(dǎo)的腎纖維化[16-17]。但在糖尿病腎病導(dǎo)致的腎纖維化中，丹酚酸B對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的調(diào)控作用尚不明確。因此，本研究通過建立糖尿病腎病db/db小鼠模型，進(jìn)一步研究丹酚酸B對(duì)腎纖維化的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

db/db小鼠是Leptin受體點(diǎn)突變的2型糖尿病小鼠，出生后6周即可出現(xiàn)明顯的肥胖和高血糖等糖尿病癥狀，8～12周時(shí)最明顯，并可出現(xiàn)糖尿病腎病等并發(fā)癥。SPF級(jí)雄性4周齡db/db小鼠60只，SPF級(jí)雄性4周齡db/m小鼠12只，體質(zhì)量（25±5）g，購(gòu)自上海普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2020-0024。動(dòng)物飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動(dòng)物中心，溫度（21±1）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，12 h明暗交替，所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)杭州鷹旸生物醫(yī)藥研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)EYOUNG-20201117-10）。

1.2 藥品與試劑

高熱量飼料（由78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽組成）購(gòu)自北京博愛港生物技術(shù)有限公司；厄貝沙坦（批號(hào)B34627-100 mg）、丹酚酸B（批號(hào)B20261-20 mg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；TUNEL凋亡試劑盒（批號(hào)C1091）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Masson染色試劑盒（批號(hào)G1006）購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司；糖原PAS染色液試劑盒（批號(hào)G1281）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)pc0020）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)ml077385）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；伊紅染液（批號(hào)613101）購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；蘇木素染液（批號(hào)MD911467）、DAB試劑盒（批號(hào)MD912068）購(gòu)自北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；β-actin抗體（批號(hào)ab179467）、NF-κB p65抗體（批號(hào)ab207297）、TGF-β1抗體（批號(hào)ab215715）、Smad2抗體（批號(hào)ab33875）、Smad3抗體（批號(hào)ab40854）、IV型膠原（collagen type Ⅳ，Col-IV）抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）抗體（批號(hào)AF2006）、p-Smad2抗體（批號(hào)AF8314）、p-Smad3抗體（批號(hào)AF3362）購(gòu)自美國(guó)Affinity公司。

1.3 儀器

ASP200S型全自動(dòng)脫水機(jī)、DM3000型正置熒光顯微鏡型、RM2235型石蠟切片機(jī)、HI1220型烤片臺(tái)、HI1220型水浴缸、G1150 H型加熱石蠟包埋儀（德國(guó)Leica公司）；DS-U3型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；Micro17R型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；EPS300型電泳儀、VE180C型電泳槽、VE186型轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）；610020-9Q型化學(xué)發(fā)光儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；C16000型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)雅培公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

db/db小鼠喂食高熱量飼料，1周后小鼠尾靜脈采血，以空腹血糖＞11.1 mmol/L判定2型糖尿病小鼠模型制備成功。造模成功的db/db小鼠隨機(jī)分成5組，每組12只，分別為模型組及丹酚酸B低、中、高（50、100、150 mg/kg）[18]組和厄貝沙坦（16 mg/kg）組，同時(shí)將12只db/m小鼠作為對(duì)照組。每日8:30時(shí)各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)8周。

2.2 血糖監(jiān)測(cè)

每周監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量及血糖波動(dòng)情況，末次給藥后，禁食8 h后取尾靜脈血測(cè)定空腹血糖，用血糖試紙檢測(cè)血糖濃度。

2.3 常規(guī)生化指標(biāo)檢測(cè)

給藥結(jié)束后，將小鼠單獨(dú)安置在代謝籠中收集24 h的尿液；禁食12 h后，用毛細(xì)血管從眼球后靜脈叢中提取血樣。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)尿液中的尿微量白蛋白（microalbuminuria，mAlb）、尿肌酐（urine creatinine，UCr）及血液尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、三酰甘油（triglycerides，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）含量。

2.4 腎組織細(xì)胞因子檢測(cè)

小鼠脫頸椎處死，取腎組織，用PBS溶液沖洗，并在冰上勻漿，4 ℃、12 000×離心10 min，去除組織殘留物；用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定上清液總蛋白濃度，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)腎組織IL-6和TNF-α水平。

2.5 腎組織病理學(xué)檢測(cè)

取腎組織，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋制備腎組織切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色評(píng)估腎組織病理學(xué)改變，行PAS染色評(píng)估腎小球基底膜病理學(xué)改變，行Masson染色來評(píng)估腎組織纖維化程度。

2.6 TUNEL染色檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡情況

腎組織切片脫蠟和水合后，PBS溶液洗滌3次，每次3 min；加入0.3%過氧化氫處理15 min，猝滅內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS溶液沖洗3次；加入TdT酶反應(yīng)液，于37 ℃避光孵育1 h；用PBS溶液沖洗切片，加入Streptavadin-HRP，室溫反應(yīng)30 min；PBS溶液沖洗3次后，用DAB溶液進(jìn)行顯色，并用蒸餾水終止顯色反應(yīng)；用蘇木素染液復(fù)染，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 免疫組化法檢測(cè)腎組織TGF-β1和Col-IV蛋白表達(dá)情況

腎組織用二甲苯脫磷，梯度乙醇進(jìn)行再水化，加入3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，加入0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液熱回收抗原；加入含10%山羊血清的PBS溶液，室溫孵育30 min，阻斷非特異性抗體結(jié)合；分別加入TGF-β1、Col-IV抗體，4 ℃孵育過夜；PBS溶液漂洗后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體；用DAB顯色，并用蘇木素染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.8 Western blotting法檢測(cè)腎組織TGF-β1/Smad和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

取各組腎組織，加入RIPA裂解液勻漿，提取蛋白。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別加入TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3、p-NF-κB p65、NF-κB p65、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體，孵育2 h，加入顯影液顯色，用ECL化學(xué)發(fā)光儀顯影。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠體質(zhì)量及空腹血糖的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量和空腹血糖均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦和丹酚酸B高劑量組體質(zhì)量和空腹血糖降低（＜0.05、0.01），丹酚酸B中劑量組空腹血糖降低（＜0.05），但降幅不大。

3.2 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠尿液mAlb、UCr及血液BUN、TG、TC含量的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠尿液mAlb和血液BUN、TC、TG水平均明顯升高（＜0.01），尿液UCr水平明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦和丹酚酸B高劑量組小鼠尿液mAlb和血液BUN、TC、TG水平均明顯降低（＜0.05、0.01），尿液UCr水平明顯升高（＜0.05）；丹酚酸B中劑量組小鼠血液TG水平均明顯降低（＜0.05），尿液UCr水平明顯升高（＜0.05）；丹酚酸B低劑量組小鼠血液BUN水平明顯降低（＜0.05）。表明丹酚酸B可以改善糖尿病腎病小鼠的高脂血癥狀態(tài)。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖2、3、7同

圖2 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠尿液mAlb、UCr及血液BUN、TG、TC含量的影響(, n = 12)

3.3 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織IL-6和TNF-α水平的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織TNF-α和IL-6水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，丹酚酸B中、高劑量組小鼠腎組織TNF-α和IL-6水平顯著降低（＜0.01），厄貝沙坦組小鼠腎組織TNF-α水平顯著降低（＜0.05）。表明丹酚酸B可能通過減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來改善2型糖尿病腎病小鼠的腎功能。

3.4 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織病理變化的影響

如圖4所示，模型組小鼠腎臟組織在HE、PAS和Masson染色中均表現(xiàn)出明顯的間質(zhì)炎癥和腎間質(zhì)纖維化。HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)形態(tài)正常、清晰，基底膜光滑，腎小球形態(tài)規(guī)則，腎間質(zhì)無異常，腎小管排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與對(duì)照組相比，模型組小鼠腎小球體積增大，基底膜增厚，周圍可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)擴(kuò)張現(xiàn)象；與模型組相比，丹酚酸B低劑量組小鼠腎臟無明顯改善；厄貝沙坦組和丹酚酸B中、高劑量組小鼠腎小球體積明顯減小，基底膜厚度降低，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管恢復(fù)明顯，排列緊密，改善程度從高到低依次為厄貝沙坦組、丹酚酸B高劑量組及丹酚酸B中劑量組。

PAS染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)完整、清晰，基底膜光滑，腎小球形態(tài)規(guī)則，腎小管排列緊密整齊，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組可見腎小球毛細(xì)血管基膜增厚，囊腔狹窄，系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生硬化程度顯著；丹酚酸B低劑量組小鼠腎臟相較于模型組無明顯改善；厄貝沙坦組和丹酚酸B中、高劑量組腎小球結(jié)構(gòu)較正常，無囊腔狹窄，腎小球的病理損害程度可以得到一定程度的減輕，改善程度從高到低依次為厄貝沙坦組、丹酚酸B高劑量組及丹酚酸B中劑量組。

圖3 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織IL-6和TNF-α水平的影響(, n = 12)

箭頭為染色膠原

Masson染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠未見膠原纖維增殖，可見管狀基底膜；模型組小鼠的腎間質(zhì)組織中可見大量染色膠原，間質(zhì)纖維組織呈束狀和網(wǎng)狀增生；厄貝沙坦和丹酚酸B中、高劑量組小鼠的腎小球體積明顯減小，纖維組織增生癥狀明顯減輕，改善程度從高到低依次為厄貝沙坦組、丹酚酸B高劑量組及丹酚酸B中劑量組；丹酚酸B低劑量組小鼠的腎組織病變無明顯改善。表明丹酚酸B能夠減輕糖尿病腎病小鼠腎小球的病理損害程度。

3.5 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響

如圖5所示，對(duì)照組腎組織未見明顯陽性細(xì)胞，細(xì)胞凋亡較少；模型組小鼠腎組織可見大量具有凋亡特征的陽性細(xì)胞，表明腎組織細(xì)胞存在大量凋亡；與模型組比較，丹酚酸B中、高劑量組和厄貝沙坦組腎組織陽性細(xì)胞數(shù)減少且著色較淺，表明細(xì)胞凋亡程度明顯改善，而丹酚酸B低劑量組無明顯改善作用。

3.6 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織TGF-β1和Col-IV蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，模型組小鼠腎組織TGF-β1和Col-IV蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，丹酚酸B組和厄貝沙坦組腎組織TGF-β1和Col-IV蛋白表達(dá)明顯降低。

3.7 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織TGF-β1/Smad和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織p-Smad2/Smad2蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-Smad3/Smad3和TGF-β1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，丹酚酸B各劑量組和厄貝沙坦組小鼠腎組織p-Smad2/Smad2蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），丹酚酸B中、高劑量組和厄貝沙坦組小鼠腎組織p-Smad3/Smad3和TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01），丹酚酸B高劑量組和厄貝沙坦組腎組織p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

4 討論

糖尿病腎病是糖尿病一種常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，在2型糖尿病患者中發(fā)病率很高。對(duì)糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制的不完全清楚導(dǎo)致了治療的局限性。目前的糖尿病治療仍然是保守治療，包括血糖和血壓控制、基于腎素-血管緊張素系統(tǒng)阻斷與低蛋白飲食和調(diào)脂劑。丹酚酸B是丹參的水溶性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和腎臟保護(hù)等多種生物活性[19-21]。尿蛋白是診斷糖尿病腎病的關(guān)鍵[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B降低糖尿病腎病小鼠mAlb和BUN水平，減輕了小鼠的腎功能損傷，改善了UCr水平，表明丹酚酸B對(duì)糖尿病小鼠腎臟有保護(hù)作用。此外，丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠的血糖影響較小，能夠減緩小鼠體質(zhì)量增加，作用較溫和，有利于糖尿病腎病的治療。

圖5 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響(×400)

圖6 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織TGF-β1和Col-IV蛋白表達(dá)的影響(×400)

圖7 丹酚酸B對(duì)糖尿病腎病小鼠腎組織TGF-β1/Smad和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

糖尿病腎病的主要病理特征為腎小球基底膜增厚、腎小球系膜擴(kuò)張、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[23]。在模型組小鼠腎組織HE、Masson和PAS染色結(jié)果中可見明顯的系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)過度產(chǎn)生和基底膜增厚，多糖沉積增加；經(jīng)丹酚酸B和厄貝沙坦干預(yù)后能明顯減輕小鼠的病理性腎損傷，多糖沉積減少，同時(shí)還可以減輕腎組織細(xì)胞凋亡。炎癥因子與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。TNF-α的合成和釋放影響早期糖尿病腎病的病理發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B和厄貝沙坦能降低糖尿病腎病小鼠腎組織中IL-6和TNF-α水平，且丹酚酸B的效果優(yōu)于厄貝沙坦，表明丹酚酸B能夠通過調(diào)節(jié)腎臟組織中的炎癥因子來減輕糖尿病腎病小鼠的腎臟損傷。

為了進(jìn)一步明確丹酚酸B抑制糖尿病腎病炎癥的機(jī)制，對(duì)NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行考察。NF-κB是糖尿病腎病進(jìn)展中的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞中通常以不活躍的狀態(tài)存在，當(dāng)細(xì)胞受到特定條件的刺激后下游通路被激活[7]。抑制NF-κB可以抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減輕腎損傷[24]。結(jié)果顯示，模型組小鼠腎組織中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高，丹酚酸B和厄貝沙坦能明顯降低p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平，表明丹酚酸B通過作用于NF-κB通路抑制糖尿病腎病小鼠的炎癥反應(yīng)。

TGF-β1被認(rèn)為是糖尿病腎病的主要致病因素，影響腎纖維化的進(jìn)程[25]?；罨腡GF-β1受體與Smad2和Smad3相互作用，與Co-Smad4形成異二聚體復(fù)合物，刺激細(xì)胞核啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)，增加膠原和纖維連接蛋白的表達(dá)[26]。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠腎組織中p-Smad2蛋白表達(dá)水平顯著降低，而TGF-β1和p-Smad3蛋白表達(dá)水平顯著升高；丹酚酸B和厄貝沙坦能夠上調(diào)p-Smad2蛋白表達(dá)，下調(diào)TGF-β1和p-Smad3蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明丹酚酸B能夠通過TGF-β1/Smad通路減輕糖尿病腎病的腎纖維化。本研究結(jié)果還表明，丹酚酸B能夠下調(diào)糖尿病腎病小鼠腎組織TGF-β1和Col-IV蛋白表達(dá)，從而保護(hù)腎組織。

越來越多的證據(jù)表明炎癥與纖維化之間存在一定的關(guān)系，纖維化可能是持續(xù)炎癥的最終結(jié)果。TGF-β1升高導(dǎo)致炎癥加重，并進(jìn)一步誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的聚集和激活[27]。此外，腎組織中促炎癥因子的侵襲與細(xì)胞外基質(zhì)的積累有關(guān)，并最終影響腎纖維化的進(jìn)程[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過抑制NF-κB和TGF-β1/Smad信號(hào)通路，對(duì)糖尿病腎病小鼠發(fā)揮抗炎和抗纖維化作用。NF-κB和TGF-β1/Smad信號(hào)通路可能是2型糖尿病腎病的潛在治療靶點(diǎn)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of salvianolic acid B on renal fibrosis and inflammation in diabetic nephropathy db/db mice

HU Lin1, 2, YE Qiao-ling1, 2, ZHUANG He-si1, 2, JIANG Jian-ping3

1. The Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China 2. Hangzhou Shangcheng District People’s Hospital, Hangzhou 310021, China 3. Department of Pharmacy, School of Medicine, Zhejiang University City College, Hangzhou 310015, China

To investigate the effect of salvianolic acid B on renal fibrosis and inflammation in diabetic nephropathy db/db mice.Sixty male db/db mice were given salvianolic acid B or irbesartan for eight weeks of intervention after being fed a high-calorie diet for one week, and another 12 male db/m mice were selected as control group. Fasting blood glucose and body weight of mice in each group were monitored, automatic biochemical analyzer was used to detect the contents of urine microalbumin (mAlb), urine creatinine (UCr) and blood urea nitrogen (BUN), triglycerides (TG), total cholesterol (TC) in rats; ELISA method was used to detect interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) contents in kidney tissue; Hematoxylin-eosin (HE), Masson and PAS staining were used to observe the pathological changes of kidney tissue in mice; TUNEL staining was used to observe the apoptosis of kidney tissue in mice; Protein expressions of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and collagen type IV (Col-IV) in kidney tissue of mice were detected by immunohistochemistry; Western blotting was used to detect TGF-β1/Smad and nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathways related protein expressions of kidney tissue in mice.Compared with model group, fasting blood glucose and body weight of mice in salvianolic acid B group were decreased (< 0.05), mAlb and BUN, TC, TG levels were significantly decreased (< 0.05, 0.01), and UCr level in urine was significantly increased (< 0.05); TNF-α and IL-6 levels in renal tissue were significantly decreased (< 0.01); Degree of pathological damage in renal tissue was significantly improved, cell apoptosis of renal tissue and protein expressions of TGF-β1 and Col-IV in renal tissue were reduced; p-Smad2/Smad2 protein expression in kidney tissue was significantly increased (< 0.05, 0.01), p-NF-κB p65/NF-κB p65, p-Smad3/Smad3 and TGF-β1 protein expressions were significantly decreased (< 0.05, 0.01).Salvianolic acid B can improve renal fibrosis and inflammation in diabetic nephropathy db/db mice, and its mechanism may be related to the regulation of TGF-β1/Smad and NF-κB signaling pathways.

salvianolic acid B; diabetic nephropathy; renal fibrosis; inflammation; transforming growth factor-β1/Smad; nuclear factor-κB

R285.5

A

0253 - 2670(2022)04 - 1084 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.015

2021-11-03

胡 琳（1976—），女，本科，主管藥師，從事藥學(xué)研究。Tel: 13858063959 E-mail: zhs9982@163.com

莊和思（1982—），男，碩士，主管藥師，從事藥學(xué)研究。Tel: 18969116123 E-mail: 18969116123@163.com

蔣劍平（1977—），男，博士，副主任藥師，從事藥學(xué)研究。Tel: (0571)86611022 E-mail: 47985715@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]