基于NOX4/ROS/p38信號通路探討三焦祛濕方對膜性腎病小鼠的抗氧化應激作用

趙亞云，方 敬，劉海平, 3，陳靜潔, 3，楊 帆, 3，陳志強

基于NOX4/ROS/p38信號通路探討三焦祛濕方對膜性腎病小鼠的抗氧化應激作用

趙亞云1, 2, 3，方 敬1，劉海平1, 3，陳靜潔1, 3，楊 帆1, 3，陳志強2*

1. 河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050091 2. 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011 3. 河北中醫(yī)學院 河北省中西醫(yī)結合肝腎病證研究重點實驗室，河北 石家莊 050091

研究三焦祛濕方對陽離子化牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA）誘導的膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）小鼠的作用及其對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）/活性氧（reactive oxygen species，ROS）/p38信號通路的影響，以闡明其抗氧化應激的作用機制。將60只小鼠隨機分為對照組10只和造模組50只，造模組尾iv 6.5 mg/kg C-BSA建立MN小鼠模型，隨機分為模型組及三焦祛濕方低、高劑量（3.71、7.42 g/kg）組和鹽酸貝那普利（1.3 mg/kg）組，各給藥組ig相應藥物干預4周，檢測各組小鼠24 h尿蛋白；腹主動脈取血，檢測血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；取腎組織進行蘇木素-伊紅（HE）、Masson、過碘酸-六胺銀（PASM）染色及透射電鏡（TEM），觀察腎組織病理形態(tài)變化，采用免疫熒光法檢測腎組織免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）沉積和ROS表達情況；采用Western blotting法檢測腎組織NOX4、p38和磷酸化p38（p-p38）蛋白表達情況。與對照組相比，模型組小鼠24 h尿蛋白顯著升高（＜0.01）；血清SOD活性顯著降低，MDA水平顯著升高（＜0.01）；腎臟病理改變明顯，可見腎小球體積增大，基底膜增厚，嗜復紅蛋白沉積，“釘突”形成，上皮下可見電子致密物沉積，足突融合，IgG沿毛細血管襻顆粒狀沉積；腎組織ROS表達顯著增多（＜0.01），NOX4、p-p38蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）。與模型組相比，各給藥組小鼠24 h尿蛋白顯著降低（＜0.01）；血清SOD活性明顯增強，MDA水平顯著降低（＜0.05、0.01）；腎組織病理損害明顯改善；腎組織ROS表達顯著減少（＜0.01），NOX4和p-p38蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）。三焦祛濕方能夠減少尿蛋白，減輕腎臟病理損傷，緩解腎組織氧化應激，其作用機制可能與調控NOX4/ROS/p38信號通路有關。

三焦祛濕方；膜性腎??；氧化應激；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4；活性氧；p38

膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）是一種免疫介導的腎小球疾病，也是成人腎病綜合征最常見的病理類型，其病理特征以免疫復合物沿毛細血管襻顆粒狀沉積為主。發(fā)病年齡高峰在40～60歲，男女比例約2∶1，兒童少見。近10年來，我國MN患病率逐年上升，調查顯示，我國三級醫(yī)院原發(fā)性腎小球病患者中，MN的比例從2010年的4.5%上升至2015年的8.8%[1]。治療方案以激素聯(lián)合烷化劑為主，2021年改善全球腎臟病預后組織[2]頒布的最新指南將利妥昔單抗列入一線治療用藥，伴隨著治療效果，骨髓抑制、感染、腫瘤及心血管疾病等不良反應也逐漸顯現(xiàn)。因此，探索更安全有效的治療方法勢在必行。

MN發(fā)病機制以上皮下免疫復合物沉積為核心環(huán)節(jié)，沉積的免疫復合物激活補體，引起足細胞損傷和基底膜改變，隨后引發(fā)腎小球損傷、腎小管萎縮以及腎間質炎癥細胞浸潤、纖維化，最終導致整個腎臟受損。機體受到嚴重損傷時，氧化應激普遍參與其中，研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激在MN的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[3]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是機體氧化應激損傷過程中生成的最主要物質之一。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）是催化生成ROS的關鍵酶，在ROS刺激下，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）被激活，使p38磷酸化，進一步引發(fā)腎臟氧化損傷[4]。

MN以水腫、蛋白尿等為主要臨床表現(xiàn)，中醫(yī)理論中沒有MN的概念，常將本病歸為“水腫”“尿濁”的范疇，病位在腎，與肺、脾、三焦相關，《景岳全書·腫脹》指出：“凡水腫等證，乃肺脾腎三臟相干之病”。因三焦氣化功能在水液代謝中至關重要，所以本病病位與三焦密不可分。本課題組認為本病基本病機為脾腎陽虛為本，水濕痰瘀為標，病機關鍵在于三焦氣化，本病以水腫為主要癥狀，濕是主要致病因素，治當化濕利水消腫，化濕利水基于氣化，故提出三焦祛濕方。本方在前期臨床研究中收效顯著[5]，但其對MN病理模型的作用機制尚不清楚。三焦祛濕方中藿香宣通上焦，陳皮、白術、豆蔻轉運中焦，茯苓、積雪草通利下焦，黃芪、淫羊藿健脾溫腎，川芎、丹參、紅花、水蛭活血化瘀通絡，共奏宣通三焦、健脾補腎、活血通絡之功?，F(xiàn)代藥理學研究表明，黃芪提取物通過抑制核轉錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）的表達，升高NF-κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB）的表達，進而減少NF-κB通路介導的炎癥介質及細胞因子的釋放，以延緩系膜增生性腎小球腎炎病程[6]；黃芪甲苷還可以抑制高糖誘導的足細胞氧化應激及凋亡[7]；淫羊藿苷通過調節(jié)核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor-2，Nrf2）/血紅素加氧酶（heme oxygenase-1，HO-1）/醌氧化還原酶1（NADPH quinone acceptor oxidoreductase 1，NQO1）信號通路減輕腎缺血再灌注損傷引起的炎癥和氧化應激，并能抑制細胞凋亡[8]；積雪草提取物可能是通過清除細胞內ROS實現(xiàn)對淋巴細胞的免疫抑制作用[9]；廣藿香提取物可以有效改善機體的氧化應激狀態(tài)，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性[10]；水蛭凍干粉可通過Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉導及轉錄活化因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）/STAT3信號通路抑制糖尿病腎病引起的氧化應激及炎癥反應[11]?；谝陨现嗅t(yī)傳統(tǒng)理論及現(xiàn)代藥理學研究，三焦祛濕方對MN動物模型的作用效果可能是通過抗氧化應激實現(xiàn)的。因此，本研究旨在探討三焦祛濕方是否通過NOX4/ROS/p38信號通路改善MN小鼠的腎臟氧化應激損傷，延緩疾病進展。

1 材料

1.1 動物

SPF級雌性BALB/c小鼠（6～8周齡）60只，體質量16～19 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006，實驗動物質量合格證號110011200109599757，飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學院實驗動物中心標準化潔凈動物房，溫度（23±2）℃，相對濕度50%～70%，12 h光照/12 h黑暗交替，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。所有動物實驗操作均在河北中醫(yī)學院動物倫理委員會批準下進行（編號DWLL2019020）。

1.2 藥物

三焦祛濕方各組成藥物顆粒劑購自廣東一方制藥有限公司，規(guī)格如下：黃芪30 g（批號012263，每袋2.0 g，相當于飲片10 g）、淫羊藿15 g（批號010049，每袋0.5 g，相當于飲片10 g）、丹參15 g（批號101123，每袋1.8 g，相當于飲片10 g）、川芎12 g（批號101149，每袋1.3 g，相當于飲片6 g）、紅花10 g（批號101149，每袋0.8 g，相當于飲片5 g）、水蛭6 g（批號012028，每袋1.5 g，相當于飲片3 g）、廣藿香10 g（批號004636，每袋0.5 g，相當于飲片10 g）、陳皮15 g（批號012165，每袋3.0 g，相當于飲片18 g）、白豆蔻10 g（批號009644，每袋0.5 g，相當于飲片6 g）、積雪草30 g（批號011590，每袋1.4 g，相當于飲片15 g）、炒白術15 g（批號011271，每袋3.0 g，相當于飲片10 g）、茯苓15 g（批號012347，每袋0.5 g，相當于飲片10 g）。

1.3 試劑

鹽酸貝那普利片（批號H20054771）購自深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司；陽離子化牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA，批號9058）購自美國Chondrex公司；弗氏完全佐劑（批號F5881）購自美國Sigma公司；SOD、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號分別為A0001-3、A003-2-2；NOX4抗體（批號14347-1-AP）購自美國Proteintech公司；p38抗體（批號A14401）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；磷酸化p38（p-p38）抗體（批號bs-5476R）購自北京博奧森生物技術有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、HRP標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體、電鏡固定液購自武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為GB12002、GB23303、G1102；FITC標記的小鼠免疫球蛋白IgG抗體（批號02-18-06）購自美國SeraCare Life Sciences公司；ROS染液（批號D7008）購自美國Sigma公司；鋨酸（批號18456）購自美國Ted Pella公司。

1.4 儀器

HT7700型透射電子顯微鏡（TEM）、7170A型全自動生化分析儀（日本Hitachi公司）；BX43型免疫熒光顯微鏡、BX51型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；正置熒光拍照顯微鏡（日本Nikon公司）；PowerPac型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Image Quant LAS4000化學發(fā)光成像分析儀（美國GE Healthcare公司）；Image-Pro Plus 6.0分析軟件（美國Media Cybemetics公司）；UC7型超薄切片機（德國Leica公司）。

2 方法

2.1 三焦祛濕方的制備

將黃芪、淫羊藿、丹參、川芎、紅花、水蛭、廣藿香、陳皮、白豆蔻、積雪草、炒白術和茯苓按原方配比混合，為控制其質量，采用薄層色譜法對顆粒劑與對照品進行定性鑒別，并采用高效液相色譜法對主要有效成分黃芪甲苷、丹酚酸B、橙皮苷進行測定，其質量分數(shù)分別為0.5、15.0、6.0 mg/g。

2.2 模型建立、分組及給藥

實驗小鼠共60只，適應性喂養(yǎng)1周，檢測尿蛋白均為陰性。隨機分為對照組10只和造模組50只。首先進行預免疫，0.2 mg C-BSA（2 mg/mL）加入等體積完全弗氏佐劑充分乳化制成乳化劑，造模組小鼠sc乳化劑，對照組小鼠sc等體積的完全弗氏佐劑，2周后正式免疫，造模組小鼠隔天尾iv C-BSA（6.5 mg/kg），每周3次，對照組尾iv等體積0.9%氯化鈉溶液，持續(xù)6周后，測定24 h尿蛋白＞60 μg提示出現(xiàn)異常范圍蛋白尿[5]，隨機選取4只行腎臟免疫熒光檢測，均可見IgG沿毛細血管壁顆粒樣沉積，證實MN病理模型成功建立。模型建立過程中，3只小鼠死亡，3只小鼠尿蛋白陰性予以剔除，將剩余40只小鼠隨機分為模型組及三焦祛濕方低、高劑量（3.71、7.42 g/kg）組和鹽酸貝那普利（1.3 mg/kg）組，每組10只。三焦祛濕方中藥顆粒加入熱蒸餾水中溶解，分別配制成含生藥量2.379、4.758 g/mL的混懸液。各給藥組ig 0.2 mL相應藥物，對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)4周。

2.3 24 h尿蛋白定量的檢測

給藥結束后，將小鼠置于代謝籠中24 h后收集尿液，4000 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書測定24 h尿蛋白水平。

2.4 血清SOD活性和MDA水平檢測

給藥結束后，小鼠吸入異氟烷麻醉，腹主動脈取血，取血后15 000 r/min離心10 min收集血清，按試劑盒說明書檢測血清SOD活性和MDA水平。

2.5 腎臟組織病理學變化觀察

小鼠麻醉取血后，打開腹腔，剖取右腎，切取1/2放入4%多聚甲醛中，室溫固定24 h，脫水、透明、浸蠟后，制作石蠟切片，分別進行蘇木素-伊紅（HE）、Masson、過碘酸-六胺銀（PASM）染色，于顯微鏡下觀察腎組織。

另取大米粒大小新鮮腎皮質，OCT包埋，冷凍切片，丙酮固定，PBS溶液浸洗，加入FITC標記的小鼠免疫球蛋白IgG抗體，室溫孵育，再次浸洗，置于熒光顯微鏡下觀察。

另切取2 mm×2 mm×2 mm新鮮腎組織，迅速投入電鏡固定液中，4 ℃固定2～4 h，1%鋨酸固定，丙酮脫水，滲透，包埋，聚合，超薄切片，鈾鉛雙染色，于TEM下觀察。

2.6 免疫熒光法檢測腎組織ROS的表達

快速取出左腎，投入液氮中，后放入?80 ℃冰箱中。將腎組織制成冰凍切片，組化筆畫圈，圈內滴入ROS染液，避光孵育30 min，DAPI復染細胞核，避光孵育10 min，封片，于熒光顯微鏡下觀察圖像。

2.7 Western blotting檢測腎組織NOX4、p38和p-p38蛋白表達

從?80 ℃冰箱中取出腎組織，放入RIPA裂解液中，勻漿后離心，取上清。檢測蛋白濃度，蛋白稀釋、煮沸備用。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于脫脂牛奶中封閉，分別加入NOX4、p38、p-p38和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1 h，加入ECL試劑顯影，并用ImageQuant LAS4000成像系統(tǒng)拍照。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 三焦祛濕方對MN小鼠24 h尿蛋白的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠24 h尿蛋白顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠24 h尿蛋白明顯降低（＜0.01）。

3.2 三焦祛濕方對MN小鼠血清SOD活性和MDA水平的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠血清SOD活性顯著降低（＜0.01），MDA水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清SOD活性明顯增強（＜0.05），MDA水平明顯降低（＜0.05、0.01）。

表1 三焦祛濕方對MN小鼠24 h尿蛋白及血清SOD活性和MDA水平的影響(, n = 10)

Table 1 Effect of Sanjiao Qushi Prescription on 24 h urinary protein quantity, SOD activity and MDA level in serum of MN mice (, n = 10)

組別劑量/(g?kg?1)24 h尿蛋白/μgSOD/(U?mL?1)MDA/(nmol?mL?1) 對照—13.71±3.11138.61±19.657.22±3.01 模型—114.69±16.14##101.80±13.12##14.89±2.85## 三焦祛濕方3.7174.80±10.41**122.97±15.66*11.46±2.63* 7.4267.78±7.53**124.46±15.10*10.95±1.47** 鹽酸貝那普利0.001 368.26±11.51**125.15±13.06*10.89±2.13**

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##<0.01control group;*<0.05**<0.01model group, same as below tables

3.3 三焦祛濕方對MN小鼠腎組織病理學變化的影響

如圖1所示，對照組小鼠腎小球結構正常，腎小球、腎小管無異常；與對照組相比，模型組小鼠腎小球體積增大、結構紊亂，上皮下可見嗜復紅蛋白沉積，基底膜呈不同程度增厚，可見“釘突”形成。與模型組比較，各給藥組小鼠腎小球結構改善，偶見嗜復紅蛋白，基底膜增厚程度減輕。

如圖2和表2所示，免疫熒光染色下，對照組小鼠腎小球未見IgG沉積；模型組小鼠腎小球可見IgG沿毛細血管襻彌漫性顆粒狀沉積，較對照組腎組織IgG沉積顯著增多（＜0.01）；各給藥組小鼠腎小球可見IgG沿毛細血管襻少量沉積，熒光強度較模型組均有不同程度減弱（＜0.01）。

如圖3所示，電鏡下，與對照組相比，模型組小鼠基底膜顯著增厚，可見電子致密物沉積，足突廣泛融合，為30%～40%；與模型組相比，各給藥組小鼠基底膜增厚程度較模型組減輕，足突排列較整齊，少量融合，為10%～20%，偶見電子致密物沉積。

綠色箭頭為基底膜增厚，藍色箭頭為嗜復紅蛋白沉積，白色箭頭為“釘突”形成

圖2 三焦祛濕方對MN小鼠腎組織IgG沉積的影響(×400)

表2 三焦祛濕方對MN小鼠腎組織IgG沉積的影響(, n = 3)

Table 2 Effect of Sanjiao Qushi Prescription on IgG deposition in kidney of MN mice(, n = 3)

組別劑量/(g?kg?1)IgG熒光強度 對照—0.009±0.001 模型—0.085±0.004## 三焦祛濕方3.710.053±0.002** 7.420.044±0.007** 鹽酸貝那普利0.001 30.047±0.025**

3.4 三焦祛濕方對MN小鼠腎組織ROS表達的影響

如圖4和表3所示，對照組小鼠腎組織ROS表達較少，模型組較對照組腎組織ROS表達顯著增多（＜0.01）；各給藥組腎組織ROS表達水平顯著減少（＜0.01）。

綠色箭頭為電子致密物沉積，黃色箭頭為足突融合

圖4 三焦祛濕方對MN小鼠腎組織ROS表達的影響(×200)

表3 三焦祛濕方對MN小鼠腎組織ROS水平的影響(, n = 3)

Table 3 Effect of Sanjiao Qushi Prescription on ROS level in kidney of MN mice(, n = 3)

組別劑量/(g?kg?1)ROS熒光強度 正常—0.02±0.01 模型—0.89±0.06## 三焦祛濕方3.710.57±0.07** 7.420.39±0.04** 鹽酸貝那普利0.001 30.44±0.06**

3.5 三焦祛濕方對MN小鼠腎組織NOX4、p38和p-p38蛋白表達的影響

如圖5所示，與對照組相比，模型組小鼠腎組織NOX4、p-p38蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠腎組織NOX4、p-p38蛋白表達水平明顯降低（＜0.05、0.01）。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學對MN發(fā)病機制的認識尚不明確，補體激活、免疫復合物沉積等觀點得到普遍認可，隨后引發(fā)氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等一系列反應。氧化應激是指機體內的氧化及抗氧化功能失調，機體內以氧化反應為主，ROS生成量超出被清理量，體內過量的ROS引發(fā)的一系列生物反應。NOX是過量ROS介導的氧化應激的重要來源酶，它將胞內電子傳遞給氧分子以生成ROS，其中NOX4屬于NOX家族，廣泛表達于腎組織，介導腎組織內的氧化應激。生理狀態(tài)下，NOX4維持低水平ROS生成，機體發(fā)生缺氧、高糖時，NOX4表達上調，進而產(chǎn)生大量的ROS[13]。過多的ROS一方面可直接導致組織氧化損傷，另一方面可激活多個信號通路，如膜結合轉運蛋白MAPK[14]，作用于p38殘基，使其發(fā)生磷酸化產(chǎn)生p-p38，p-p38作為p38通路中的關鍵信號分子，其表達增強是該信號通路激活的標志之一。有研究表明，蘆薈苷可能通過抑制NOX4/ROS/p38信號通路發(fā)揮抗氧化應激和足細胞保護作用[15]。在本研究中，模型組小鼠腎組織內NOX4蛋白表達水平升高，ROS表達上調，p-p38蛋白表達水平升高，表明體內發(fā)生了氧化應激反應；給予三焦祛濕方干預后，腎組織內NOX4蛋白表達水平降低，ROS表達下調，p-p38蛋白表達水平降低，說明機體啟動了抗氧化應激過程。SOD是細胞中的主要抗氧化酶，可以清除氧自由基，使機體免受氧化損傷侵害，其水平可以一定程度反映機體去除氧自由基的能力。MDA是ROS與其他物質發(fā)生氧化反應時脂質過氧化的產(chǎn)物，其水平可以一定程度反映氧化應激引起的細胞損傷程度[16]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清SOD活性顯著減低，MDA水平顯著升高，進一步證實機體內發(fā)生了氧化應激反應；給予三焦祛濕方干預后，小鼠血清SOD活性明顯增強，MDA水平顯著降低，表明三焦祛濕方推動了機體的抗氧化反應。由此可推斷，三焦祛濕方干預MN小鼠模型可能是通過NOX4/ROS/p38信號通路實現(xiàn)其抗氧化應激作用的。

本研究采用尾iv C-BSA建立小鼠MN模型，根據(jù)文獻報道[17]及預實驗結果，發(fā)現(xiàn)預免疫后給予C-BSA 6.5 mg/kg，每周3次，持續(xù)6周，可以建立穩(wěn)健的MN模型。小鼠的基因和人類相似達95%，同時人類MN以輔助T細胞2（T helper 2，Th2）介導的免疫應答為主[18]，而BALB/c小鼠誘導的MN模型也是以Th2免疫應答為主[19]，這為小鼠MN模型與人類MN疾病的高度相似提供了有力證據(jù)。實驗證實[20-21]，不同性別小鼠其生化指標、病理狀態(tài)表現(xiàn)出較明顯差異，基于本病理模型的原始文獻選用雌性小鼠，故本研究也選用了雌性小鼠建立病理模型，以保證病理模型的穩(wěn)定性。結果顯示，模型組小鼠24 h尿蛋白明顯升高，腎臟病理損害明顯；給予三焦祛濕方干預后，小鼠24 h尿蛋白明顯降低，腎臟病理損害呈現(xiàn)不同程度的減輕。

綜上所述，三焦祛濕方對MN小鼠干預后效果明顯，通過減少NOX4表達，使ROS產(chǎn)生減少，降低p38磷酸化水平，改善氧化應激程度，進而減緩腎臟組織損害，減少蛋白尿，從而發(fā)揮腎臟保護作用，延緩疾病進展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Sanjiao Qushi Prescription on anti-oxidative sress of mice with membranous nephropathy based on NOX4/ROS/p38 signaling pathway

ZHAO Ya-yun1, 2, 3, FANG Jing1, LIU Hai-ping1, 3, CHEN Jing-jie1, 3, YANG Fan1, 3, CHEN Zhi-qiang2

1. Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050091, China 2. Hebei Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, China 3. Hebei Key Laboratory of Integrative Medicine of Liver-Kidney Patterns, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050091, China

To study the effects of Sanjiao Qushi Prescription (三焦祛濕方) on cationic bovine serum albumin (C-BSA) induced membranous nephropathy (MN) mice model and nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase4 (NOX4)/reactive oxygen species (ROS)/p38 signaling pathway, and elucidate the mechanism of anti-oxidative stress.Sixty mice were randomly divided into control group (= 10) and model group (= 50), mice were iv C-BSA (6.5 mg/kg) by tail to establish MN model, which were randomly divided into model group, low-, high-dose Sanjiao Qushi Prescription (3.71, 7.42 g/kg) groups and benazepril hydrochloride (1.3 mg/kg) group. Mice were ig corresponding drugs for four weeks, 24 h urine protein were detected. Serum was collected, superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) level were measured. Renal tissue was collected, pathological morphology changes were observed by light microscope with hematoxylineosin (HE), Masson and periodic acid-silver metheramine (PASM) staining and transmission electron microscope (TEM). Deposition of immunoglobulin G (IgG) and ROS expression in renal tissue was observed by fluorescence immunoassay. Western blotting was used to detect NOX4, p38 and p-p38 protein expressions in renal tissue.Compared with control group, 24 h urine protein of mice in model group was significantly increased (< 0.01), SOD activity was decreased and MDA level was increased (< 0.01) in model group; Kidney exhibited enlarged volume of glomerular, significantly thickened glomerular basement membrane, polymyoglobin deposition and spike formation from the light microscope, epithelium deposition of electron dense, foot process fusion were observed from transmission electron microscope; Granular deposition of IgG along the capillary wall was observed by immunofluorescence staining; ROS expression in kidney was significantly increased (< 0.01); NOX4 and p-p38 protein expressions were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, 24 h urine protein in each administration group was significantly decreased (< 0.01), SOD activity was obviously increased and MDA level was decreased (< 0.05, 0.01); pathological damages of renal were alleviated; ROS expression in renal tissue was significantly decreased (< 0.01); NOX4 and p-p38 protein expressions in renal tissue were significantly decreased (< 0.05, 0.01).Sanjiao Qushi Prescription can decrease 24 h urine protein, ameliorate renal pathological damages, alleviate oxidative stress in kidney, its mechanism may be possibly related to the regulation of NOX4/ROS/p38 signaling pathway.

Sanjiao Qushi Prescription; membranous nephropathy; oxidative stress; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4; reactive oxygen species; p38

R285.5

A

0253 - 2670(2022)04 - 1076 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.014

2021-11-03

河北省政府資助省級臨床醫(yī)學優(yōu)秀人才項目（2016034829）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目（2021039）；河北省研究生創(chuàng)新資助項目（XCXZZBS2021021）

趙亞云（1989—），女，主治醫(yī)師，博士研究生，從事慢性腎臟病的中醫(yī)藥治療及機制研究。E-mail: DoctorCindy2020@126.com

陳志強（1962—），男，教授，博士生導師，從事慢性腎臟病的中醫(yī)藥治療及機制研究。E-mail: chenzhqiang2011@163.com

[責任編輯 李亞楠]