基于CX3CL1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)研究淫羊藿苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓小鼠的作用

羅云梅，李銘銘, 3#，熊乙林，李利生

基于CX3CL1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)研究淫羊藿苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓小鼠的作用

羅云梅1, 2，李銘銘1, 2, 3#，熊乙林1, 2，李利生1, 2*

1. 遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000 2. 遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，貴州 遵義 563000 3. 遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（遵義市第一人民醫(yī)院）藥劑科，貴州 遵義 563000

研究淫羊藿苷改善缺氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）作用與趨化因子C-X3-C基元配體1（chemokine C-X3-C motif ligand 1，CX3CL1）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的關(guān)系。將40只C57BL/6J雄性野生型（wide type，WT）小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、WT模型組和WT＋淫羊藿苷（10、20 mg/kg）組，20只雄性CX3CL1?/?小鼠分為CX3CL1?/?模型組和CX3CL1?/?＋淫羊藿苷（20 mg/kg）組。除對(duì)照組外，各組均于含氧量為10%的低氧環(huán)境中連續(xù)飼養(yǎng)21 d，于低氧飼養(yǎng)7 d后ig淫羊藿苷2周。采用小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)小鼠肺動(dòng)脈血流速度和右心室血流動(dòng)力學(xué)，測(cè)量右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）；采用蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色觀察小鼠肺小動(dòng)脈重構(gòu)情況；采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平；采用Western blotting檢測(cè)小鼠肺組織CX3CL1和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。與對(duì)照組相比，WT模型組小鼠肺動(dòng)脈血流速度明顯降低（＜0.05），RVHI顯著增大（＜0.05），右心室收縮末期直徑、收縮末期容積和每博輸出量升高（＜0.05），右心室短軸縮短率和射血分?jǐn)?shù)降低（＜0.05），肺小動(dòng)脈重構(gòu)明顯。與WT模型組相比，淫羊藿苷能夠增加WT小鼠肺動(dòng)脈血流速度（＜0.05），降低RVHI、右心室收縮末期直徑、收縮末期容積和每博輸出量（＜0.05），升高右心室短軸縮短率和射血分?jǐn)?shù)（＜0.05），肺小動(dòng)脈重構(gòu)明顯改善，同時(shí)，淫羊藿苷降低血清IL-1β和TNF-α水平以及肺組織CX3CL1蛋白表達(dá)水平（＜0.05），抑制NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平（＜0.05）。與WT模型組相比，CX3CL1?/?模型組小鼠肺動(dòng)脈血流速度、肺小動(dòng)脈重構(gòu)、右心室血流動(dòng)力學(xué)均有改善（＜0.05），血清IL-1β和TNF-α水平降低（＜0.05）。敲除CX3CL1?/?后，淫羊藿苷（20 mg/kg）對(duì)HPH小鼠的改善作用減弱甚至消失。淫羊藿苷能夠通過(guò)抑制CX3CL1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善小鼠HPH。

淫羊藿苷；趨化因子C-X3-C基元配體1；炎癥；缺氧性肺動(dòng)脈高壓；小鼠

缺氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是由于肺泡廣泛缺氧引起的以肺小動(dòng)脈收縮、重構(gòu)為病理特征的肺循環(huán)疾病，HPH病程中伴有持續(xù)的炎癥反應(yīng)[1-3]。趨化因子C-X3-C基元配體1（chemokine C-X3-C motif ligand 1，CX3CL1）是CX3C亞族里的唯一成員，包括溶解型和膜結(jié)合型，既有趨化性蛋白的功能也有細(xì)胞黏附分子的功能，HPH患者和模型動(dòng)物血管內(nèi)皮細(xì)胞CX3CL1及趨化因子C-X3-C基元受體1（chemokine C-X3-C motif receptor 1，CX3CR1）表達(dá)上調(diào)，且伴隨巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)了HPH血管炎癥[4-5]；敲除CX3CR1可顯著改善HPH模型的炎癥反應(yīng)和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖[6]；在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型大鼠中，甾體類抗炎藥地塞米松可通過(guò)下調(diào)肺組織和mRNA的表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，改善肺動(dòng)脈重構(gòu)[7]，表明HPH與CX3CL1/CX3CR1有關(guān)。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，具有益精氣、堅(jiān)筋骨、補(bǔ)腰膝、強(qiáng)心力之功效[8]。本課題組前期研究證實(shí)淫羊藿苷能夠降低野百合堿誘導(dǎo)大鼠平均肺動(dòng)脈壓，改善小鼠HPH[9-10]，但作用機(jī)制仍未闡明。本研究采用缺氧誘導(dǎo)野生型（wild type，WT）和CX3CL1?/?小鼠建立HPH模型，探究淫羊藿苷抗HPH的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0002；雄性CX3CL1?/?小鼠（8周齡，體質(zhì)量20～25 g）由上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0010。所有小鼠均飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[使用許可證號(hào)SYXK（黔）2014-003]，小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)[2018]2-128）。

1.2 藥品與試劑

淫羊藿苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.6%）購(gòu)自南通飛宇生物科技有限公司；CX3CL1抗體、CX3CR1抗體、p65抗體、磷酸化p65（phosphorylated p65，p-p65）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；磷酸化核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制蛋白（phosphorylated inhibitor of NF-κB，p-IκB）抗體、IκB抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Masson染色試劑盒、牛血清白蛋白、山羊血清購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 儀器

Vevo 2100型小動(dòng)物超聲儀（加拿大Visualsonics公司）；Multiskan GO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Chemi Dos Xps型電泳儀凝膠成像分體系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；TE2000-S型顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)（日本Nikon公司）；GM-8000型低氧倉(cāng)（日本Tokaihit公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

將40只C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、WT模型組和WT＋淫羊藿苷（10、20 mg/kg）組，每組10只；20只雄性CX3CL1?/?小鼠分為CX3CL1?/?模型組和CX3CL1?/?＋淫羊藿苷（20 mg/kg）組，每組10只。所有小鼠同室飼養(yǎng)，對(duì)照組吸入空氣，其余各組小鼠置于氧濃度為10%的低氧倉(cāng)內(nèi)，以鈉石灰和無(wú)水氯化鈣吸收多余的CO2和水蒸氣，每天持續(xù)低氧24 h，連續(xù)3周。于低氧7 d后，各給藥組ig淫羊藿苷（20 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)14 d。

2.2 小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)肺動(dòng)脈血流速度與右心室血流動(dòng)力學(xué)

末次給藥2 h后，小鼠ip 10%水合氯醛（2 mg/kg）麻醉，脫毛，涂抹耦合劑，選擇MS400探頭（25～40 Hz），PW Mode檢測(cè)小鼠肺動(dòng)脈血流速度，M Mode檢測(cè)右心室短軸縮短率、射血分?jǐn)?shù)、每博輸出量、收縮末期容積和收縮末期直徑。

2.3 右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）的測(cè)定

分離心臟，去除心耳，分離右心室壁，分別稱定右心室壁、左心室與室間隔的質(zhì)量，計(jì)算RVHI。

RVHI＝右心室壁質(zhì)量/(左心室質(zhì)量＋室間隔質(zhì)量)

2.4 蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色檢測(cè)小鼠肺小血管病理變化

取小鼠右肺下葉肺組織，于4%多聚甲醛中固定后脫水，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、封片等步驟，倒置顯微鏡下觀察肺小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變并拍照。

切片經(jīng)蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、Masson藍(lán)化液返藍(lán)、麗春紅染色、弱酸處理、磷鉬酸清洗、苯胺藍(lán)染色、無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明、封片等步驟，于倒置顯微鏡下觀察肺小動(dòng)脈纖維化情況并拍照。采用ImageJ軟件計(jì)算管腔面積與血管截面積比值和膠原面積與血管截面積比值。

2.5 ELISA法檢測(cè)小鼠血清IL-1β和TNF-α含量

小動(dòng)物超聲檢測(cè)完成后，在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行小鼠眶靜脈采血，4 ℃、3000 r/min離心5 min，分離血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清IL-1β和TNF-α含量。

2.6 Western blotting法檢測(cè)小鼠肺組織CX3CL1和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

取各組肺組織，加入RAPI裂解液勻漿提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，95 ℃加熱5 min使蛋白變性，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別加入CX3CL1、CX3CR1、p65、p-p65、p-IκB、IκB和GADPH抗體，4 ℃孵育12 h；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG抗體，室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，采用Quantity One軟件分析條帶灰度。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿苷改善HPH小鼠肺動(dòng)脈血流速度和右心室血流動(dòng)力學(xué)異常

如圖1所示，WT小鼠于10%氧濃度環(huán)境下持續(xù)低氧21 d后，肺動(dòng)脈血流速度明顯降低（＜0.05），RVHI增加（＜0.05），右心室血流動(dòng)力學(xué)明顯異常，右心室短軸縮短率、射血分?jǐn)?shù)、每博輸出量顯著降低（＜0.05），收縮末期容積和收縮末期直徑增加（＜0.05）；與對(duì)照組相比，CX3CL1?/?模型組小鼠肺動(dòng)脈血流速度、RVHI以及右心室血流動(dòng)力學(xué)也明顯異常，但其嚴(yán)重程度顯著低于WT模型組；淫羊藿苷（10、20 mg/kg）可不同程度地緩解WT和CX3CL1?/?模型小鼠肺動(dòng)脈血流速度和右心室血流動(dòng)力學(xué)異常，但淫羊藿苷（20 mg/kg）對(duì)CX3CL1?/?模型小鼠各指標(biāo)均未見(jiàn)顯著影響，表明淫羊藿苷改善HPH呈CX3CL1相關(guān)性。

與對(duì)照組比較：▲P＜0.05；與WT模型組比較：*P＜0.05；與WT＋淫羊藿苷（20 mg?kg?1）組比較：#P＜0.05

3.2 淫羊藿苷改善HPH小鼠肺血管重構(gòu)

如圖2所示，WT和CX3CL1?/?模型組小鼠肺血管管壁顯著增厚、管腔變窄，并伴有大量膠原纖維沉積，但后者血管重構(gòu)程度明顯低于前者。淫羊藿苷能夠減少血管壁厚度，緩解管腔變窄，增大管腔面積與血管截面積比值，并能減少肺血管周圍膠原纖維的面積，減小膠原面積與血管截面積比值。但淫羊藿苷對(duì)CX3CL1?/?模型組小鼠改善效果不及WT模型組明顯，CXC3L1?/?模型組和CX3CL1?/?＋淫羊藿苷（20 mg/kg）組比較無(wú)顯著差異。

3.3 淫羊藿苷降低HPH小鼠血清IL-1β和TNF-α水平

如圖3所示，WT模型組小鼠血清IL-1β和TNF-α水平較對(duì)照組顯著增高（＜0.05），分別達(dá)11、14倍，CX3CL1敲除后IL-1β和TNF-α水平均顯著降低（＜0.05）；給予淫羊藿苷后，WT小鼠IL-1β和TNF-α水平顯著降低（＜0.05）。對(duì)比淫羊藿苷處理的CX3CL1?/?與WT小鼠發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷（20 mg/kg）能夠降低CX3CL1?/?小鼠血清IL-1β和TNF-α水平，但其降低幅度遠(yuǎn)小于WT小鼠。

3.4 淫羊藿苷降低HPH小鼠肺組織CX3CL1和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

如圖4所示，WT模型組小鼠肺組織CX3CL1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），淫羊藿苷在緩解HPH小鼠病理改變的同時(shí)可降低CX3CL1蛋白表達(dá)水平，淫羊藿苷（20 mg/kg）組具有顯著差異（＜0.05）。WT模型組小鼠肺組織p-p65和p-IκB蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），表明NF-κB信號(hào)通路被激活，敲除CX3CL1后顯著抑制了NF-κB信號(hào)通路的激活（＜0.05）。淫羊藿苷（10、20 mg/kg）對(duì)HPH小鼠肺組織p-p65和p-IκB蛋白表達(dá)水平具有抑制作用，但CXC3L1?/?模型組與CX3CL1?/?＋淫羊藿苷（20 mg/kg）組無(wú)顯著差異，表明淫羊藿苷可以抑制HPH小鼠NF-κB信號(hào)通路的激活，敲除CX3CL1后淫羊藿苷對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制作用減弱。

A-HE染色 B-Masson染色 C-HE染色統(tǒng)計(jì)圖 D-Masson染色統(tǒng)計(jì)圖 與對(duì)照組比較：▲P＜0.05；與WT模型組比較：*P＜0.05；與WT＋淫羊藿苷（20 mg?kg?1）組比較：#P＜0.05

與對(duì)照組比較：▲P＜0.05；與WT模型組比較：*P＜0.05；與WT＋淫羊藿苷（20 mg?kg?1）組比較：#P＜0.05；與CX3CL1?/?模型組比較：■P＜0.05

與對(duì)照組比較：▲P＜0.05；與WT模型組比較：*P＜0.05；與WT＋淫羊藿苷（20 mg?kg?1）組比較：#P＜0.05

4 討論

HPH是嚴(yán)重的肺循環(huán)疾病，肺動(dòng)脈緊張性的進(jìn)行性增高和肺動(dòng)脈重構(gòu)是其主要的病理基礎(chǔ)，進(jìn)行性增加的肺血管壓力可加重右心室負(fù)荷和心力衰竭，最終導(dǎo)致死亡[11]。右心導(dǎo)管檢查測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）≥25 mm Hg（1 mm Hg＝133 Pa）是診斷肺動(dòng)脈高壓的金標(biāo)準(zhǔn)，但采用右心導(dǎo)管術(shù)直接測(cè)定小鼠mPAP十分困難，本研究采用小動(dòng)物超聲儀檢測(cè)肺動(dòng)脈血流速度和右心室血流動(dòng)力學(xué)，并結(jié)合右心室肥厚情況對(duì)HPH成模情況進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)WT小鼠在含氧量為10%的低氧倉(cāng)連續(xù)飼養(yǎng)21 d后肺小動(dòng)脈管壁肥厚、管腔狹窄，肺動(dòng)脈血流速度顯著降低，表明肺動(dòng)脈阻力增高，受此影響，右心室每博輸出量、短軸縮短率和射血分?jǐn)?shù)均顯著降低，而右心室收縮末期直徑和收縮末期容積顯著增高，并導(dǎo)致了右心室壓力負(fù)荷性的肥厚，提示HPH模型建立成功。

淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分，藥動(dòng)學(xué)研究顯示大鼠單次給藥后1 h，肺組織淫羊藿苷含量最高（約為腦組織的5倍），其分布特點(diǎn)更適用于治療肺部疾病[12]。近年來(lái)，本課題組就淫羊藿苷抗肺動(dòng)脈高壓作用開(kāi)展了系列研究，證實(shí)淫羊藿苷能夠顯著改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓，淫羊藿苷給藥劑量為80 mg/kg時(shí)，mPAP由（53.5±6.7）mm Hg降低至（31.6±4.7）mm Hg，降幅達(dá)41%；模型大鼠的存活率顯著增高，同時(shí)肺動(dòng)脈重構(gòu)特別是血管中膜即平滑肌層也得到改善，管壁與血管截面積比值平均值由49.9%降低至26.5%[9]。本研究采用HPH模型對(duì)淫羊藿苷改善肺動(dòng)脈高壓作用進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，淫羊藿苷能夠改善HPH小鼠肺小動(dòng)脈重構(gòu)和右心室血流動(dòng)力學(xué)異常，增加肺動(dòng)脈血流速度，壓力負(fù)荷性的右心室肥厚也明顯緩解，進(jìn)一步說(shuō)明淫羊藿苷對(duì)HPH具有改善作用。

盡管肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制并未完全闡明，但已有大量研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致肺動(dòng)脈重構(gòu)的重要因素[13]。在HPH氧供應(yīng)不足導(dǎo)致受損的內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子和趨化因子入血或擴(kuò)散到周邊組織，與循環(huán)中的單核細(xì)胞或肺泡巨噬細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，將其募集到損傷部位，趨化因子CX3CL1及其受體CX3CR1在炎癥細(xì)胞募集過(guò)程發(fā)揮重要作用[14]。致炎因素或炎癥因子主要通過(guò)NF-κB信號(hào)通路上調(diào)CX3CL1的表達(dá)，同時(shí)，CX3CL1又是NF-κB信號(hào)通路的激活物，二者相互作用，迅速放大炎癥反應(yīng)[15]。CX3CL1是CX3C趨化因子亞家族的唯一成員，具有溶解型和膜結(jié)合型2種形式，當(dāng)受到致炎因素刺激時(shí)去整合素-金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）被誘導(dǎo)并催化生成大量的溶解型和膜結(jié)合型，二者通過(guò)其高親和受體CX3CR1相互作用發(fā)揮其生物學(xué)功能，膜結(jié)合型主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞黏附，溶解型具有強(qiáng)烈的趨化功能，介導(dǎo)CX3CR1陽(yáng)性細(xì)胞的趨化[16]。在肺動(dòng)脈高壓患者和模型動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞CX3CL1和巨噬細(xì)胞CX3CR1表達(dá)上調(diào)[17]。Perros等[18]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠ip野百合堿12 h后CX3CL1/CX3CR1表達(dá)便達(dá)到高峰，且始終維持在高表達(dá)狀態(tài)，CX3CL1?/?小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平明顯降低，且肺血管壁炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，表明CX3CL1介導(dǎo)炎癥反應(yīng)與肺動(dòng)脈高壓關(guān)系密切[14]。本研究發(fā)現(xiàn)敲除CX3CL1顯著改善缺氧所致的肺小動(dòng)脈重構(gòu)、肺動(dòng)脈血流速度和右心室血流動(dòng)力學(xué)異常，并且CX3CL1?/?小鼠血清IL-1β和TNF-α水平明顯低于WT小鼠，NF-κB活化被抑制，表明CX3CL1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了HPH的發(fā)展過(guò)程，與文獻(xiàn)報(bào)道[14]一致。

已有大量研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷具有較好的抗炎作用。淫羊藿苷能夠通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)、、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，）和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthetase，）mRNA表達(dá)，緩解脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥[8]，同時(shí)淫羊藿苷可抑制NF-κB活化和炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)改善缺血再灌注腦損傷模型和癡呆模型的炎癥反應(yīng)[19]，但淫羊藿苷改善HPH是否與CX3CL1有關(guān)尚不清楚。為此，本研究首先檢測(cè)了淫羊藿苷對(duì)WT小鼠炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能夠顯著降低血清中IL-1β和TNF-α水平和肺組織CX3CL1蛋白表達(dá)水平，抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，初步表明淫羊藿苷抗HPH與CX3CL1有關(guān)。然后比較了淫羊藿苷（20 mg/kg）對(duì)CX3CL1?/?小鼠和WT小鼠HPH模型改善作用的差異，一方面，CX3CL1敲除后淫羊藿苷改善HPH的作用基本消失；另一方面，與改善WT小鼠HPH模型作用相比，淫羊藿苷對(duì)CX3CL1?/?小鼠改善的幅度顯著降低，表明淫羊藿苷改善HPH與CX3CL1相關(guān)。綜上所述，淫羊藿苷改善HPH與抑制CX3CL1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of icariin on hypoxia-induced pulmonary hypertension in mice based on CX3CL1-mediated inflammation

LUO Yun-mei1, 2, LI Ming-ming1, 2, 3, XIONG Yi-lin1, 2, LI Li-sheng1, 2

1. Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and International Cooperarion Joint Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China 2. Guizhou Key Laboratory of Basic Pharmacology, Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China 3. Department of Pharmacy, The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University (The First People’s Hospital of Zunyi), Zunyi 563000, China

To study the relationship between ameliorative effect of icariin on hypoxic pulmonary hypertension (HPH) and inflammation mediated by chemokine chemokine C-X3-C motif ligand 1 (CX3CL1).Forty C57BL/6J male wild type (WT) mice were randomly divided into control group, WT model group and WT + icariin (10, 20 mg/kg) group; And twenty male CX3CL1?/?mice were divided into CX3CL1?/?model group and CX3CL1?/?+ icariin (20 mg/kg) group. Except for control group, mice were exposed to hypoxia environment with oxygen content of 10% for 21 d, and were ig icariin for two weeksafter 7 d of hypoxic feeding. Pulmonary artery blood flow velocity and right ventricular hemodynamics of mice were detected by ultrasound, and right ventricular hypertrophy index (RVHI) was measured; HE and Masson staining were used to observe the remodeling of pulmonary artery; Tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) levels in serum was detected by ELISA; Western blotting was used to detect CX3CL1 and nuclear factor-κB (NF-κB) pathway-related protein expressions in lung of mice.Compared with control group, pulmonary artery blood flow velocity of mice in WT model group was significantly decreased (< 0.05), RVHI was significantly increased (< 0.05), right ventricular end-systolic diameter, end-systolic volume and output per stroke were increased (< 0.05), right ventricular short axis shortening rate and ejection fraction were decreased (< 0.05), and pulmonary arteriole remodeling was obvious. Compared with WT model group, pulmonary artery blood flow velocity of mice was increased by icariin (< 0.05), RVHI, right ventricular end-systolic diameter, end-systolic volume and output per stroke were reduced (< 0.05), right ventricular short axis shortening rate and ejection fraction were increased (< 0.05), and pulmonary arteriole remodeling was significantly improved; IL-1β and TNF-α levels in serum and CX3CL1 protein expression in lung tissue were decreased by icariin (< 0.05), NF-κB pathway related protein expressions were inhibited (< 0.05). Compared with WT model group, pulmonary artery blood flow velocity, pulmonary arteriolar remodeling, and right ventricular hemodynamics in mice of CX3CL1?/?model group were improved (< 0.05), IL-1β and TNF-α levels in serum were decreased (< 0.05). After knockout of CX3CL1?/?, ameliorating effect of icariin (20 mg/kg) on ??HPH mice was attenuated or even disappeared.Icariin can improve HPH in mice through inhibiting inflammation mediated by CX3CL1.

icariin; chemokine C-X3-C motif ligand 1; inflammation; hypoxic pulmonary hypertension; mice

R285.5

A

0253 - 2670(2022)04 - 1068 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.013

2021-10-13

遵義醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（F-951）；遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（JCYL-K-015）；遵義市科技局與遵義醫(yī)學(xué)院聯(lián)合基金資助項(xiàng)目（遵市科合社字[2018]03號(hào)）

羅云梅（1990—），女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事心血管藥理學(xué)研究。E-mail: 15022335973@163.com

李利生（1979—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事心血管藥理學(xué)研究。E-mail: medlls@qq.com

#共同第一作者：李銘銘（1988—），男，主管藥師，主要從事心血管藥理學(xué)研究。E-mail: 315804727@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]