基于“炒炭存性”理論研究炮制工藝對(duì)地榆抑菌功效的影響

顧 薇，姚俊宏，陸夢(mèng)夢(mèng)，蘇 曼，鄒俊清，蔡徐藝，趙宏宇，宋金云，葛 暢，李 健，童黃錦，陳 軍1, *

基于“炒炭存性”理論研究炮制工藝對(duì)地榆抑菌功效的影響

顧 薇1, 2, 3，姚俊宏1, 4，陸夢(mèng)夢(mèng)2，蘇 曼5，鄒俊清2，蔡徐藝2，趙宏宇6，宋金云6，葛 暢7，李 健2，童黃錦8*，陳 軍1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中醫(yī)外用藥開發(fā)與應(yīng)用工程研究中心，江蘇 南京 210023 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 3. 江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023 4. 南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇 南京 210023 5. 連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222000 6. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第二醫(yī)院）臨床科研中心，江蘇 南京 210009 7. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023 8. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210028

從藥效與灰化2個(gè)角度闡釋“炒炭存性”原理，并優(yōu)選地榆炒炭工藝及探討炮制質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）與灰化臨界點(diǎn)參數(shù)。考察炒炭溫度、時(shí)間對(duì)地榆炮制品外觀性狀、提取物得率、指標(biāo)性成分、金黃色葡萄球菌抑制效果的影響，以此優(yōu)選炮制工藝。隨炒炭程度增加，地榆炭提取物中沒(méi)食子酸含量先增后減，鞣花酸一直增加。地榆在抗菌效果方面炮制增效，從而闡釋“炒炭存性”；地榆炭對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果與提取物中沒(méi)食子酸的含量呈較強(qiáng)正向相關(guān)性。地榆炭提取物得率與提取物中鞣花酸含量呈極強(qiáng)的反向相關(guān)性（＝?0.964 03），地榆炭提取物得率突然下降時(shí)，飲片質(zhì)地開始出現(xiàn)脆化、灰化現(xiàn)象。獲得的最優(yōu)地榆炒炭工藝：在250 ℃溫度條件下炒炭6 min，此時(shí)提取物得率約30%，沒(méi)食子酸在提取物［（46.41±0.06）μg/mg］和飲片中［（14.20±0.02）μg/mg］含量相較于其他炮制條件最高。提出用沒(méi)食子酸含量指導(dǎo)地榆炒炭工藝，用提取物得率控制灰化臨界點(diǎn)的研究思路，并優(yōu)化了基于抑菌效應(yīng)的地榆炮制工藝。

地榆；炮制；炒炭存性；抑菌；質(zhì)量標(biāo)志物；沒(méi)食子酸；鞣花酸；藥效；灰化

地榆為薔薇科地榆屬植物地榆L.或長(zhǎng)葉地榆L. var.(Bert.) Yü et Li的干燥根。地榆炭為地榆照炒炭法炮制所得的炮制品，其性微寒，味苦、酸、澀，歸肝、大腸經(jīng)，具涼血止血、解毒斂瘡的功效[1]?！吨袊?guó)藥典》2020年版對(duì)地榆炒炭程度的要求為“表面焦黑色、內(nèi)部棕褐色”，尚無(wú)量化指標(biāo)、炮制參數(shù)的限定，這就難以保證炭藥質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，經(jīng)常出現(xiàn)同一種炭藥的臨床療效或研究結(jié)果有差異甚至截然不同，如地榆炒炭后鞣質(zhì)含量增加[2-4]或減少[5]，能促進(jìn)血液凝固的Ca+濃度增加[6]或減少[7]，炒炭后止血作用增強(qiáng)[3]或沒(méi)有影響[8]都有報(bào)道。由此，根據(jù)藥效優(yōu)化地榆炒炭工藝，建立藥效相關(guān)炮制指標(biāo)，為臨床提供優(yōu)質(zhì)且穩(wěn)定的地榆炭飲片成為了亟待解決的問(wèn)題。

地榆炒炭能顯著增強(qiáng)止血功效[3]，然而傳統(tǒng)炮制理論要求“炒炭存性”，所存之性即為原藥材的固有特性，現(xiàn)代研究表明地榆可用于治療多種過(guò)敏性皮膚病[9]，具有抗炎、抗菌[10]活性，其對(duì)金黃色葡萄球菌[11-13]、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[14-16]、白色念珠菌[11,13]、大腸桿菌[11-13,17]、綠膿桿菌[11]、銅綠假單胞菌[12-13]、枯草芽孢桿菌[12]、蠟狀芽孢桿菌[13]、紅色毛癬菌[18]、嗜水氣單胞菌[19]的抗菌活性在幾十味抗菌中藥中處于前列，與公認(rèn)的抑菌中藥苦參相當(dāng)或更優(yōu)[11,17]。同時(shí)，地榆具有極為廣譜的抑菌譜[10,15,20-29]，包括對(duì)多種臨床耐藥菌株的抗菌活性[14-16,30]。根據(jù)“炒炭存性”理論，地榆炭同樣可能是一類廣譜且顯著的抗菌中藥，但鮮有這方面的研究報(bào)道[31]。

有研究指出地榆炭對(duì)大腸桿菌和痢疾桿菌的抑制作用強(qiáng)于生地榆[32]；課題組前期研究結(jié)果也表明，地榆炭對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、紅色毛癬菌均具顯著的抑制作用，且優(yōu)于生地榆[18,33]。然而，地榆“炒炭存性”所存之性是否包括其優(yōu)異的抗菌表現(xiàn)？為存性服務(wù)的炒炭工藝是什么？反映炮制工藝的質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）是什么？同時(shí)，張仲景在《傷寒雜病論》中首次提出炭藥“燒灰存性，勿令太過(guò)”，表明了中藥制炭的限度，即要存性，“勿令太過(guò)”的限度如何體現(xiàn)？這些問(wèn)題依然亟待解決。

基于此，本研究根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，選取在地榆中含量較高且炒炭過(guò)程中變化較大的沒(méi)食子酸與鞣花酸作為指標(biāo)性成分，以抑菌功效為導(dǎo)向，優(yōu)化地榆炒炭工藝，包括炒炭時(shí)間與溫度，初步探尋地榆炒炭程度的Q-Marker，并對(duì)炒炭過(guò)程中的“存性”問(wèn)題從藥效和灰化2個(gè)上下限度提出思考。

1 儀器與材料

PTHW型調(diào)溫電熱套，南通市通州申通電熱器廠；Waters 2695型高效液相色譜儀，沃特世科技（上海）有限公司；Hadera ODS-2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，江蘇漢邦科技有限公司；TGL-16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；MS105DU型梅特勒-托利多電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)，南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵，南京文爾儀器設(shè)備有限公司；RE-1000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；MSDC-5型自動(dòng)炒貨機(jī)，常州市金壇邁斯機(jī)械有限公司；Ultrospec 10細(xì)胞密度儀，美國(guó)哈佛儀器公司；BSC-1604 IIA2型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；B6120型培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司；Epoch2 TC型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；DKZ-2型電熱恒溫震蕩水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

地榆飲片（批號(hào)20160240）購(gòu)自于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，為薔薇科地榆屬植物地榆L.的干燥根，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陸兔林教授鑒定，符合《中國(guó)藥典》2020年版一部要求。金黃色葡萄球菌亞種BNCC337371購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

哌拉西林鈉他唑巴坦鈉（批號(hào)C11334141）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；對(duì)照品鞣花酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%，批號(hào)817C024，購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；對(duì)照品沒(méi)食子酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%，批號(hào)C13O9C72105，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；11 cm中速定性濾紙，貨號(hào)92410432S，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲酸為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定地榆、地榆炭中沒(méi)食子酸、鞣花酸含量

2.1.1 地榆、地榆炭供試品溶液的制備 精密稱取地榆、地榆炭提取物（提取物制備方法見“2.2.2”項(xiàng)）3.75 mg，溶于3.75 mL甲醇中，12 000 r/min（離心半徑5.94 cm）離心10 min后，觀察有無(wú)沉淀，若有沉淀，繼續(xù)加甲醇稀釋至離心無(wú)沉淀，記錄甲醇用量，備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品2.17 mg、鞣花酸對(duì)照品2.03 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲溶解，制備成含沒(méi)食子酸217 μg/mL、鞣花酸203 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為Hedera C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液（20∶80）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：沒(méi)食子酸為272 nm，鞣花酸為254 nm；進(jìn)樣量10 μL；圖譜采集時(shí)間16 min，所得高效液相色譜圖（圖1）中沒(méi)食子酸和鞣花酸的理論塔板數(shù)分別為40 900和16 300。

2.1.4 系統(tǒng)適用性考察 將“2.1.1”項(xiàng)下制備所得地榆、地榆炭供試品溶液按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，HPLC圖見圖1，結(jié)果可見地榆、地榆炭提取物中共存組分對(duì)沒(méi)食子酸峰、鞣花酸峰無(wú)干擾，分離度良好，說(shuō)明方法專屬性良好。

2.1.5 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下制備所得沒(méi)食子酸、鞣花酸對(duì)照品溶液混合制成100 μg/mL的對(duì)照品混合溶液作為母液，然后將母液用甲醇稀釋得到100、75、50、25、10、5、1 μg/mL的對(duì)照品混合溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行高效液相色譜分析，通過(guò)峰面積-濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為沒(méi)食子＝2893＋2018，＝0.998；鞣花酸＝9857＋614.2，＝0.996，線性范圍均為1～100 μg/mL，二者在標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度考察 取地榆炭供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，記錄其峰面積并計(jì)算其RSD值，結(jié)果沒(méi)食子酸RSD為1.35%，鞣花酸RSD為1.96%，表明儀器精密度較好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 取地榆炭供試品溶液，在24 h內(nèi)每隔4 h測(cè)定1次，共測(cè)定6次，記錄其峰面積并計(jì)算其RSD值，結(jié)果沒(méi)食子酸RSD為1.54%，鞣花酸RSD為0.59%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性考察 連續(xù)制備6份相同質(zhì)量濃度的地榆炭供試品溶液，記錄峰面積并計(jì)算沒(méi)食子酸和鞣花酸的質(zhì)量濃度，結(jié)果沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為（21.97±0.84）μg/mL，RSD為3.84%，鞣花酸質(zhì)量濃度為（64.26±2.10）μg/mL，RSD為3.27%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率考察 精密稱取已測(cè)定沒(méi)食子酸和鞣花酸含量的地榆炭樣品6份，每份5 g，分別加入沒(méi)食子酸和鞣花酸對(duì)照品溶液適量（與樣品中沒(méi)食子酸和鞣花酸等量，分別為1 μg/mg與2.8 μg/mg），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定峰面積并計(jì)算質(zhì)量濃度，計(jì)算平均加樣回收率及其RSD，結(jié)果沒(méi)食子酸和鞣花酸的平均加樣回收率為104.90%、96.04%，RSD分別為0.92%、0.82%。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求，沒(méi)食子酸、鞣花酸的加樣回收率結(jié)果均在藥典要求范圍內(nèi)。

圖1 沒(méi)食子酸和鞣花酸對(duì)照品(A)、地榆提取物(B)、地榆炭提取物(C)的HPLC圖

2.2 地榆炒炭工藝的考察及提取物的制備

2.2.1 地榆炒炭工藝的考察 稱取約100 g地榆，自動(dòng)炒貨機(jī)設(shè)置炒炭溫度并預(yù)熱至所需溫度，加入飲片，設(shè)置炒炭時(shí)間，開始制炭，炒炭結(jié)束后即得地榆炭。

2.2.2 地榆、地榆炭提取物制備 稱取地榆或地榆炭100 g，放入粉碎機(jī)中粉碎成粉，過(guò)《中國(guó)藥典》二號(hào)篩，篩下的粉末即為粗粉。稱取粗粉約5.0 g置于50 mL的具塞錐形瓶中，加入10倍量的75%乙醇，在50 ℃條件下水浴12 h，取出后50 ℃超聲1 h，用2層濾紙抽濾，取濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃條件下蒸干溶劑后，放入烘箱中烘干，取出茄形瓶并刮出內(nèi)壁上的物質(zhì)，得地榆、地榆炭提取物，并按公式計(jì)算提取物得率。

提取物得率＝提取物質(zhì)量/粗粉質(zhì)量

提取物用甲醇溶解并稀釋至線性范圍，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算地榆及其炮制品提取物中指標(biāo)成分沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量，并按公式計(jì)算各成分在飲片中的含量。

成分在飲片中含量＝成分在提取物中含量×提取物得率

2.2.3 總鞣質(zhì)含量測(cè)定 參照《中國(guó)藥典》2020年版通則2202項(xiàng)下“鞣質(zhì)含量測(cè)定法”測(cè)定總鞣質(zhì)含量。

2.3 炒炭溫度對(duì)地榆不同炮制品性狀及指標(biāo)性成分的影響

2.3.1 炒炭溫度對(duì)地榆不同炮制品性狀的影響 炭藥的品質(zhì)普遍受其炒制程度影響，炒炭溫度與炒炭時(shí)間為關(guān)鍵參數(shù)。將地榆按“2.2.1”項(xiàng)下方法炒制，為單因素考察，炒炭時(shí)間統(tǒng)一設(shè)置8 min，考察不同炒炭溫度（210～310 ℃）對(duì)飲片性狀和指標(biāo)性成分沒(méi)食子酸、鞣花酸含量的影響。

外觀性狀結(jié)果（圖2和表1）可知，隨著炒炭溫度的升高，地榆炭表面顏色與內(nèi)部顏色均逐漸加深，到270、290 ℃時(shí)接近《中國(guó)藥典》2020年版中所述的“表面焦黑色、內(nèi)部焦褐色”，而290 ℃時(shí)飲片質(zhì)地顯脆，干燥易折斷；至310 ℃時(shí)出現(xiàn)明顯的炭化現(xiàn)象，質(zhì)地疏松且脆，干燥易折斷。飲片粉末顏色同樣呈現(xiàn)逐漸加深的現(xiàn)象，250～270 ℃時(shí)由焦黃色向焦褐色的突變，310 ℃時(shí)呈黑褐色。

同時(shí)對(duì)比飲片提取物得率（表2），地榆不同炮制品提取物的得率隨炒炭溫度的增加而降低，290 ℃后低于生地榆，310 ℃時(shí)僅（5.29±0.77）%，這與飲片過(guò)度炭化有關(guān)，即炭化導(dǎo)致飲片質(zhì)量的損失。由此可見，炒炭溫度從290 ℃開始質(zhì)地顯脆，飲片質(zhì)量出現(xiàn)損失。

2.3.2 炒炭溫度對(duì)地榆不同炮制品指標(biāo)性成分的影響 表2中結(jié)果表明，隨著炒炭溫度的升高，提取物中沒(méi)食子酸含量先升后降，250 ℃時(shí)達(dá)峰值，310 ℃時(shí)低于生地榆中含量；而鞣花酸含量一直上升，290 ℃時(shí)開始顯著上升。同時(shí)，隨著炒炭溫度的增加，沒(méi)食子酸和鞣花酸在飲片中含量均先增后減，其中沒(méi)食子酸也在250 ℃時(shí)達(dá)峰值，鞣花酸在290 ℃時(shí)達(dá)峰值，之后迅速下降（表2）。

綜上，當(dāng)設(shè)置炒炭時(shí)間8 min，炒炭溫度在250～270 ℃時(shí)，地榆炭提取物與飲片中沒(méi)食子酸和鞣花酸含量均較高，提取物得率較高，其中270 ℃時(shí)的性狀更符合《中國(guó)藥典》2020年版描述。

2.4 炒炭時(shí)間對(duì)地榆不同炮制品指標(biāo)性成分的影響

根據(jù)“2.3”實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取沒(méi)食子酸和鞣花酸含量均較高，提取物得率也較高的250 ℃作為炒炭溫度，將地榆按“2.2.1”項(xiàng)下方法炒制，考察不同炒炭時(shí)間（0～14 min）對(duì)指標(biāo)性成分沒(méi)食子酸、鞣花酸含量的影響。表3中實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，炒炭時(shí)間的影響與炒炭溫度相類似，提取物得率在4～8 min穩(wěn)定在30%左右，10 min開始顯著下降；與表2相似，提取物中沒(méi)食子酸含量先增后減，6 min達(dá)峰值[（46.41±0.06）mg/g]，鞣花酸含量則一直增加，最高達(dá)[（95.11±0.17）mg/g]；與表2相似，飲片中沒(méi)食子酸與鞣花酸含量均先增后減，分別在6 min [（14.20±0.02）mg/g]、10 min[（12.73±0.11）mg/g]處達(dá)峰值，之后快速下降。以上研究結(jié)果表明，溫度與時(shí)間2個(gè)炮制參數(shù)在控制地榆炮制程度時(shí)無(wú)明顯差異性。

圖2 地榆生品及不同炒炭溫度下炮制品的性狀圖 (A) 與粉末圖 (B)

表1 地榆生品及不同炮制品外觀與性狀總結(jié)

Table 1 Summary of appearance and characteristics of SR and different CSR

樣品表面顏色內(nèi)部顏色質(zhì)地粉末顏色 生地榆淺棕色棕白色質(zhì)地堅(jiān)硬，不易折斷土黃色 210 ℃ 8 min炮制品焦黃色焦淺黃色質(zhì)地堅(jiān)硬，不易折斷土黃色 230 ℃ 8 min炮制品焦深黃色焦黃色質(zhì)地堅(jiān)硬，干燥不易折斷焦黃色 250 ℃ 8 min炮制品焦褐色焦淺褐色質(zhì)地較堅(jiān)硬，干燥不易折斷焦黃色 270 ℃ 8 min炮制品焦深褐色焦褐色質(zhì)地較堅(jiān)硬，干燥不易折斷焦褐色 290 ℃ 8 min炮制品焦黑色焦褐色質(zhì)地顯脆，干燥易折斷焦褐色 310 ℃ 8 min 炮制品黑色黑色質(zhì)地疏松且脆，干燥易折斷黑色

表2 地榆生品及不同炒炭溫度下炮制品中沒(méi)食子酸、鞣花酸含量變化及提取物得率變化(, n = 3)

Table 2 Changes of gallic acid, ellagic acid contents and extraction yield of SR and CSR at different carbon stir-fryingtemperatures (, n = 3)

樣品沒(méi)食子酸/(mg?g?1)鞣花酸/(mg?g?1)提取物得率/% 提取物中飲片中提取物中飲片中 生地榆23.96±0.076.91±0.024.68±0.101.35±0.0328.83±1.33 210 ℃ 8 min炮制品29.80±0.1310.25±0.046.25±0.042.15±0.0134.40±1.61 230 ℃ 8 min炮制品36.03±1.5411.85±0.518.72±0.042.87±0.0132.90±1.88 250 ℃ 8 min炮制品47.50±0.0413.83±0.0127.08±0.097.88±0.0329.11±0.73 270 ℃ 8 min炮制品39.18±1.1011.48±0.3230.16±0.188.68±0.0528.78±0.66 290 ℃ 8 min炮制品42.89±0.059.55±0.0145.27±0.3110.08±0.0722.27±1.15 310 ℃ 8 min炮制品16.19±0.050.85±0.0079.23±0.944.19±0.055.29±0.77

表3 地榆生品及不同炒炭時(shí)間下炮制品中沒(méi)食子酸、鞣花酸含量變化及提取物得率變化(, n = 3)

Table 3 Changes of gallic acid, ellagic acid contents and extraction yield of SR and CSR at different carbon stir-fryingtime (, n = 3)

樣品沒(méi)食子酸/(mg?g?1)鞣花酸/(mg?g?1)提取物得率/% 提取物中飲片中提取物中飲片中 生地榆23.96±0.076.91±0.024.68±0.101.35±0.0328.83±1.33 4 min炮制品31.23±0.0810.09±0.026.81±0.132.20±0.0432.30±1.74 6 min炮制品46.41±0.0614.20±0.0217.76±0.065.43±0.0230.59±0.56 8 min炮制品41.23±0.2611.99±0.0825.24±0.057.34±0.0129.09±1.46 10 min炮制品36.77±0.175.08±0.0292.05±0.8112.73±0.1113.83±0.88 12 min炮制品37.53±0.155.40±0.0285.39±0.2112.30±0.0314.40±1.01 14 min炮制品19.49±0.071.18±0.0095.11±0.175.76±0.016.06±0.61

2.5 相關(guān)性考察

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Excel 2016軟件進(jìn)行分析，應(yīng)用Correl、Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)判2個(gè)變量之間的線性關(guān)系，系數(shù)的變化范圍為?1～1。值為0意味著2個(gè)變量之間沒(méi)有線性關(guān)系，絕對(duì)值越接近1代表2個(gè)變量之間線性關(guān)系越強(qiáng)。

炒炭溫度（表2）與炒炭時(shí)間（表3）的考察結(jié)果觀察到一個(gè)共性現(xiàn)象，地榆炭提取物得率開始顯著下降的點(diǎn)（表2中8 min，290 ℃或表3中10 min，250 ℃），正是提取物中鞣花酸含量拐點(diǎn)式上升的點(diǎn)，進(jìn)而用“2.5”項(xiàng)下CORREL工作表函數(shù)計(jì)算提取物得率與提取物中成分含量（表2與表3）的相關(guān)性，結(jié)果見表4，可知，提取物得率與鞣花酸含量相關(guān)性極強(qiáng)，兩者且呈反向關(guān)系，提取物得率下降點(diǎn)即為鞣花酸含量迅速上升的拐點(diǎn)，此為地榆過(guò)度炭化的臨界點(diǎn)，飲片質(zhì)地開始脆化、灰化。

2.6 體外抗菌活性測(cè)定方法建立

2.6.1 菌懸液的配制 金黃色葡萄球菌選取生長(zhǎng)良好的菌落于1 mL生理鹽水中，制成菌懸液濃度調(diào)至0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)。麥?zhǔn)媳葷岱ㄊ且环N用比濁來(lái)校對(duì)菌液濃度的方法，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（clinical and laboratory standards institute，CLSI），0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)相當(dāng)于1.5×108個(gè)菌/mL。

表4 提取物成分含量與提取物得率的相關(guān)系數(shù)

Table 4 Correlation coefficient between gallic acid and ellagic acid contents and yield of extract of SR/CSR

地榆及其炮制品與提取物得率的相關(guān)系數(shù) 沒(méi)食子酸含量鞣花酸含量 8 min炒炭時(shí)間，不同炒炭溫度下炮制品0.524 167?0.945 55 250 ℃炒炭溫度，不同炒炭時(shí)間下炮制品0.406 262?0.964 03

2.6.2 供試藥液的制備 組別設(shè)置為測(cè)試組、空白組和陽(yáng)性組。測(cè)試組為地榆、地榆炭提取物，先溶解于二甲亞砜（DMSO），再配制成51.2 mg/mL母液，DMSO終濃度0.05%；空白組為生理鹽水；陽(yáng)性藥為哌拉西林鈉他唑巴坦鈉，先溶解于DMSO，再配制成6.4 mg/mL母液，DMSO終濃度0.05%，備用。

2.6.3 最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定 采用微量液基稀釋法測(cè)定抑菌活性，將供試藥液在96孔板中梯度稀釋，得地榆、地榆炭工作液51.2、25.6、12.8、6.4 mg/mL，陽(yáng)性藥工作液6.4、3.2、1.6、0.8 mg/mL；每孔加入2 μL工作液和198 μL菌懸液，置于37 ℃，80%濕度條件下，靜置培養(yǎng)1 d后，以肉眼未見培養(yǎng)液渾濁的對(duì)應(yīng)濃度定為MIC數(shù)值（80%生長(zhǎng)受到抑制）。

2.6.4 抑菌圈試驗(yàn) 設(shè)置地榆、地榆炭提取物組（20 mg/mL，先溶于DMSO，再配制成DMSO終濃度為0.05%的藥液）、陽(yáng)性對(duì)照組（5 mg/mL）、生理鹽水組和溶劑對(duì)照組。無(wú)菌條件下，取瓊脂培養(yǎng)基加菌懸液300 μL，涂布均勻，吸出多余菌液，放置片刻，夾取直徑6 mm的圓形紙片（預(yù)先經(jīng)高壓滅菌），展平，置于培養(yǎng)皿中（每皿4片），輕輕按壓，吸取藥液10 μL滴加于紙片中央，蓋上培養(yǎng)皿，做好標(biāo)記，37 ℃培養(yǎng)，24 h后觀察并記錄抑菌圈形態(tài)、顏色、澄明度與直徑大小，每組3個(gè)平行樣。

2.7 微量液基稀釋法考察不同炮制程度對(duì)地榆炭抑菌效果的影響

將“2.4”項(xiàng)下所得炒炭溫度統(tǒng)一設(shè)置250 ℃時(shí)不同炒炭時(shí)間（0～14 min）的地榆炮制品，作為不同炮制程度的地榆炭樣品，采用“2.6”項(xiàng)下考察其體外抗菌活性，并建立抗菌活性與指標(biāo)性成分的相關(guān)性。表5中結(jié)果所示，地榆6、8 min炮制品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，優(yōu)于生地榆，而炭化過(guò)度的10、14 min炮制品則不達(dá)；這個(gè)結(jié)果與“2.4”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，即炮制程度適中能夠增加效應(yīng)物質(zhì)含量，也能增強(qiáng)藥效，炮制過(guò)度則不達(dá)?，F(xiàn)有研究中多篇文獻(xiàn)報(bào)道了地榆止血作用隨著炮制程度的增加呈現(xiàn)先增強(qiáng)后下降的趨勢(shì)，炮制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)止血作用便不再明顯[5,34]，這種現(xiàn)象或許與地榆的過(guò)度炭化相關(guān)。

表5 地榆及不同炮制程度地榆炮制品(250℃)對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC (n = 3)

Table 5 MIC of SR and CSR with different processing degree (n = 3)

樣品MIC/(μg?mL?1) 生地榆128128128 250 ℃6 min炮制品646464 250 ℃8 min炮制品6464128 250 ℃10 min炮制品128128128 250 ℃14 min炮制品128128128 陽(yáng)性藥222

將表5中地榆及其不同程度炮制品抑菌MIC值與表3中地榆炭提取物指標(biāo)性成分含量做Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明，沒(méi)食子酸、鞣花酸含量與MIC值的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為?0.817 1、0.538 2，表明地榆炭對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果與沒(méi)食子酸的含量相關(guān)性較大，且呈正相關(guān)性（因MIC值越大表明抑菌效果越弱，Pearson相關(guān)系數(shù)為負(fù)數(shù)卻表明兩者之間的正相關(guān)性），即炮制過(guò)程中觀測(cè)沒(méi)食子酸含量能夠一定程度上反應(yīng)地榆炭的抑菌功效。同時(shí)，近期基于灰色關(guān)聯(lián)分析研究地榆炒炭止血的物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)果表明沒(méi)食子酸是地榆炭中發(fā)揮凝血止血活性的重要成分[35]，所以提出可以將沒(méi)食子酸含量視為地榆炒炭Q-Marker的研究思路。

綜上，地榆采用自動(dòng)炒貨機(jī)在250 ℃溫度條件下炒炭6 min能獲得具最優(yōu)抑菌效果的地榆炭，且此時(shí)地榆炭提取物得率達(dá)30%左右，指標(biāo)性成分沒(méi)食子酸在提取物［（46.41±0.06）mg/g］和飲片中［（14.20±0.02）mg/g］，含量均達(dá)峰值。

2.8 抑菌圈實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最優(yōu)炮制工藝下地榆炭的抑菌效果

根據(jù)“2.7”項(xiàng)下優(yōu)化所得最優(yōu)炮制工藝制備地榆炭，參照《中國(guó)藥典》2020年版通則2202項(xiàng)下鞣質(zhì)含量測(cè)定法測(cè)定總鞣質(zhì)含量，地榆、地榆炭中總鞣質(zhì)含量分別為（18.65±0.06）%、（9.86±0.08）%，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

因中藥抑菌效應(yīng)遠(yuǎn)弱于抗生素，不能形成輪廓清晰、圓整澄清的抑菌圈，也受中藥藥液顏色的影響，所以僅用抑菌圈直徑的大小來(lái)評(píng)價(jià)中藥抑菌效應(yīng)不太客觀。圖3所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同質(zhì)量濃度下，地榆炭組能形成邊界較清晰的抑菌內(nèi)圈，其直徑為（1.33±0.12）cm（以細(xì)菌幾無(wú)生長(zhǎng)、澄明度顯澄清的內(nèi)圈直徑計(jì)），以及抑菌外圈（無(wú)明顯邊界，渾濁），而地榆組因在培養(yǎng)皿表面抑菌深度淺，只有抑菌外圈，未觀察到邊界清晰、幾無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑菌內(nèi)圈，表明抑菌圈實(shí)驗(yàn)與微量液基稀釋法（表5）實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，地榆、地榆炭均顯示一定抑菌效果，且最優(yōu)炮制工藝下的地榆炭?jī)?yōu)于生地榆，表明炮制工藝對(duì)中藥效應(yīng)的重要影響。

1-地榆提取物 2-地榆炭提取物 3-生理鹽水 4-溶劑 5-陽(yáng)性藥

4 討論

“凡藥制造，不及則功效難求，太過(guò)則氣味反失”（《本草蒙筌》）道出了炮制的上下限度要求。本研究從藥效與灰化2個(gè)角度闡釋了“炒炭存性”的科學(xué)內(nèi)涵，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)前言提出的問(wèn)題進(jìn)行解答：地榆炭存地榆之性，也具顯著抗菌效果，且在優(yōu)化的炮制工藝下抗菌功效顯著強(qiáng)于生地榆；篩選得最優(yōu)炒炭工藝條件為250 ℃溫度條件下炒炭6 min；此時(shí)地榆炭提取物得率達(dá)30%左右，沒(méi)食子酸含量達(dá)峰值，具顯著優(yōu)于生地榆的抑菌效果；提出可以將沒(méi)食子酸含量視為地榆炒炭Q-Marker的研究思路；提出地榆炭提取物得率的突然下降可視為飲片過(guò)度炭化的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，即灰化臨界點(diǎn)的研究思路。

課題組前期對(duì)地榆炒炭前后的成分進(jìn)行了定性和定量的研究，表明地榆炒炭過(guò)程中發(fā)生了大量大分子裂解成小分子的事件，其中沒(méi)食子酸和鞣花酸分別為沒(méi)食子酸鞣質(zhì)與鞣花酸鞣質(zhì)高溫裂解的終端產(chǎn)物，其中沒(méi)食子酸能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其下游產(chǎn)物焦性沒(méi)食子酸（另撰文發(fā)表）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果印證了上述結(jié)果，即隨著地榆高溫炮制，沒(méi)食子酸含量先增加后減少，鞣花酸含量則一直上升[5]。炭藥的品質(zhì)與其炒炭工藝息息相關(guān)，研究結(jié)果解釋了經(jīng)常出現(xiàn)同一種炭藥的臨床療效或研究結(jié)果有差異甚至截然不同的現(xiàn)象，由此凸顯根據(jù)藥效優(yōu)化和規(guī)范炒炭工藝的重要性。

有研究結(jié)果表明，市售地榆炭色澤普遍較深，外表為棕黑或黑色，內(nèi)部多為棕黑色或黑褐色，粉末多為棕黑或黑褐色，醇浸出物得率顯著低于生品，83%市售地榆炭中鞣質(zhì)含量未達(dá)生品中1/3[36]，由于地榆炭中鞣質(zhì)含量隨炮制程度增加而下降[5]，以上現(xiàn)象均預(yù)示市售地榆炭可能普遍存在過(guò)度炭化現(xiàn)象。同時(shí)，課題組前期也對(duì)不同出處地榆炭進(jìn)行品質(zhì)考察，飲片色澤普遍較深，沒(méi)食子酸2.15～12.28 mg/g，鞣花酸5.33～12.76 mg/g，多為沒(méi)食子酸含量低于鞣花酸，同樣揭示了市售地榆炭普遍存在過(guò)度炭化現(xiàn)象。從沒(méi)食子酸含量來(lái)看市售地榆炭品質(zhì)遠(yuǎn)低于本研究中優(yōu)化炮制工藝所得地榆炭（14.20±0.02）mg/g；然而，優(yōu)化工藝所得地榆炭表面焦褐色，內(nèi)部焦淺褐色，與藥典所述“表面焦黑色、內(nèi)部焦褐色”不甚相符；而當(dāng)將地榆炮制至藥典所述外觀性狀時(shí)（8 min，290 ℃或10 min，250 ℃），其已開始越過(guò)灰化臨界點(diǎn)。有趣的是，藥典對(duì)沒(méi)食子酸含量的規(guī)定，地榆炭（不少于0.60%）比地榆（不少于1.0%）中低，與其對(duì)飲片色澤描述（“表面焦黑色、內(nèi)部焦褐色”）相一致。

地榆炭的研究尚處起步階段，只有建立和完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范炮制工藝，量化檢測(cè)手段，才能保證飲片質(zhì)量的穩(wěn)定性，有利于進(jìn)一步臨床應(yīng)用與基礎(chǔ)研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of processing technology on antibacterial effect ofbased on theory of “maintaining medicinal properties after carbonisatus”

GU Wei1, 2, 3, YAO Jun-hong1, 4, LU Meng-meng2, SU Man5, ZOU Jun-qing2, CAI Xu-yi2, ZHAO Hong-yu6, SONG jin-yun6, GE Chang7,LI Jian2, TONG Huang-jin8, CHEN jun1, 2

1. Jiangsu Provincial Engineering Research Center of TCM External Medication Development and Application, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing, Nanjing 210023, China 4. Laboratory Animal Center, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 5. Lianyungang Food and Drug Inspection and Testing Center, Lianyungang, Lianyungang 222000, China 6. Department of Clinical Research Center, The Second Hospital of Nanjing, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210009, China 7. The First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 8. Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China

The theory of “Maintaining medicinal properties after carbonisatus (MMPC)” was explained from the perspectives of pharmacodynamics and ashing. Meanwhile, the processing method of carbonizing by stir-frying of(SR) was optimized and the quality markers (Q-Marker) in processing as well as the parameters characterizing ashing critical point were discussed.The effects of temperature and time of carbonizing by stir-frying on the appearance, yield, the index composition and inhibition onof Charred(CSR) were investigated to optimize processing technology.The results showed that with the aggravation of processing degree, the content of gallic acid in CSR extract increased first and then decreased, while ellagic acid kept increasing. Antibacterial effect of CSR was confirmed to increase by processing, explaining the MMPC principle. Meanwhile, there was a strong and positive correlation between the bacteriostatic effects and the content of gallic acid in CSR extract. The yield of CSR extract and the ellagic acid content in extract showed a strong reverse correlation (correlation coefficient = ?0.964 03). It was observed that when the yield of CSR extract suddenly declined, the texture of medicinal materials begun embrittling and ashing. Moreover, the best processing condition of CSR was obtained: SR was carbonized by stir-frying at the temperature of 250 ℃ for 6 min. This moment, the extract yield was about 30% and the content of gallic acid reached the peak in both the extract [(46.41 ± 0.06) μg/mg] and medicinal materials [(14.20 ± 0.02) μg/mg]. The bacteriostatic effects of CSR were better than those of the raw SR.In this study, the authors put forward the research idea of using gallic acid content in extract to guide the carbonizing by stir-frying technology of SR and controlling the critical point of ashing by the yield of extract, and optimize the processing technology of SR based on bacteriostatic effect.

; processing; maintaining medicinal properties after carbonisatus; bacteriostatic effects; quality markers; gallic acid; ellagic acid; pharmacodynamics; ashing

R283.1

A

0253 - 2670(2022)04 - 1042 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.010

2021-09-02

江蘇省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃青年基金項(xiàng)目（QN202005）；江蘇省藥學(xué)會(huì)—靳培英基金項(xiàng)目（J2021002）

顧 薇（1981—），副教授，博士，主要從事中藥炮制與制劑研究。Tel: 13584095898 E-mail: 6464966@qq.com

童黃錦（1983—），副主任藥師，博士，主要從事中藥質(zhì)量控制及炮制機(jī)制研究。Tel: 13770330158 E-mail: hjtong62@126.com

陳 軍（1975—），教授，博士，主要從事中藥外用制劑研究。Tel: (025)85811611 E-mail: chenjun75@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]