共載同源成分葛根素與大豆苷元的聚合物混合膠束的制備及表征

朱衛(wèi)豐，況文亮，李文棟，丁 權(quán)，周志煒，吳文婷，管詠梅

共載同源成分葛根素與大豆苷元的聚合物混合膠束的制備及表征

朱衛(wèi)豐，況文亮，李文棟，丁 權(quán)，周志煒，吳文婷*，管詠梅*

江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004

鑒于葛根黃酮類成分間溶解性與滲透性的自調(diào)節(jié)作用，以泊洛沙姆407（Pluronic F127，F(xiàn)127）和15-羥基硬脂酸聚乙二醇脂（Solutol HS15）為載體材料制備共載葛根素與大豆苷元的聚合物混合膠束（puerarin and daidzein co-delivery polymer mixed micelles，PD-FS/PMMs）及其凍干粉，以實(shí)現(xiàn)同源成分共載。采用薄膜水化法制備PD-FS/PMMs，以膠束穩(wěn)定性為考察指標(biāo)進(jìn)行了處方工藝優(yōu)化；應(yīng)用核磁共振氫譜、透射電子顯微鏡與激光粒度儀等對(duì)其進(jìn)行物理性能表征，并通過體外透析法考察藥物釋放情況。為了進(jìn)一步提升膠束相關(guān)口服制劑的成型性，還對(duì)膠束溶液進(jìn)行了凍干處理并基于外觀與復(fù)溶效果考察了凍干保護(hù)劑的種類與用量，同時(shí)開展了凍干粉的性能表征研究。成功制備了PD-FS/PMMs，最佳處方為葛根素與大豆苷元的投藥量分別為80.98、3.46 mg，載體總量為200 mg，其中，F(xiàn)127質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77.30%；制備的膠束外觀圓整，粒度均勻，粒徑為18～20 nm，且2種成分的體外釋放互不影響；確定了膠束溶液的最佳凍干工藝是以40 mg/mL甘氨酸作為凍干保護(hù)劑，凍干粉形態(tài)以片狀為主且復(fù)溶效果好。研究不僅解決了不同疏水性成分共載的難題，且實(shí)現(xiàn)了同源成分共載膠束的制備，為后期開展葛根素口服降壓制劑的體內(nèi)研究與臨床開發(fā)奠定基礎(chǔ)，并為旨在高生物利用度的共載制劑體系的設(shè)計(jì)提供共載成分篩選的新思路。

葛根素；大豆苷元；共載；聚合物混合膠束；凍干；自調(diào)節(jié)；同源成分；薄膜水化法；體外透析法；成型性

聚合物混合膠束（polymer mixed micelles，PMMs）由2種或2種以上兩親性聚合物自組裝形成的聚集體，是單一聚合物膠束（PMs）的延伸[1]，不僅有效繼承了單一PMs的優(yōu)點(diǎn)，且拓展了自己的獨(dú)有優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)混合膠束不僅有更強(qiáng)的增溶能力、穩(wěn)定性，且能保護(hù)藥物不受胃腸道環(huán)境影響，此外，由于PMMs的粒徑通常＜100 nm，可通過細(xì)胞內(nèi)吞和胞飲作用被吸收，同時(shí)基于其內(nèi)部載藥位點(diǎn)的多樣性，PMMs表現(xiàn)出實(shí)現(xiàn)多藥共載的能力。共載遞藥多以增加藥效為目標(biāo)，但共載成分的篩選思路局限，常見的成分組合多為公認(rèn)的聯(lián)合用藥方案[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)同源成分，即來源相同的成分，如葛根黃酮類成分，其成分間可能存在著藥效協(xié)同與物理性質(zhì)相互調(diào)節(jié)的作用，基于此，采用PMMs實(shí)現(xiàn)同源成分共載為口服生物利用度低的藥物提供了口服制劑研究的新思路。

葛根素（puerarin）是葛根的主要生物活性成分之一，具有廣泛的藥理效應(yīng)，如血管擴(kuò)張等，臨床用于治療心血管疾病等[3-5]，目前臨床上應(yīng)用的葛根素制劑主要是注射劑，但發(fā)現(xiàn)其存在諸多不良反應(yīng)[6]，便捷的口服給藥途徑則成為突破口之一。然而，葛根素屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)IV類藥物[7]，影響其口服生物利用度的關(guān)鍵是溶解度或滲透性，故有必要開發(fā)一種能同時(shí)改善溶解度及滲透性的遞藥系統(tǒng)。本課題組前期通過系統(tǒng)藥理學(xué)結(jié)合細(xì)胞水平研究了葛根治療高血壓的機(jī)制[8]，發(fā)現(xiàn)其中黃酮類成分如葛根素及大豆苷元（daidzein，7,4′-二羥基異黃酮）均對(duì)葛根發(fā)揮降壓作用起到了重要作用[9-10]，同時(shí)課題組的前期研究[11]表明大豆苷元對(duì)葛根素的滲透性有促進(jìn)作用，因此，若將上述2種同源成分共載于同一載體，有望改善葛根素的溶解度及滲透性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)藥效協(xié)同作用。但是由于葛根素的脂水分配系數(shù)（lg）為0.480，而大豆苷元的lg為2.836，疏水性差異較大，故需要一種能同時(shí)共載葛根素與大豆苷元的載體。

鑒于本課題組前期成功制備了由泊洛沙姆407（Pluronic F127）與15-羥基硬脂酸聚乙二醇脂（Solutol HS15）構(gòu)成的混合膠束（mixed micelles of Pluronic F127 and Solutol HS15，F(xiàn)S/PMMs），并實(shí)現(xiàn)了對(duì)葛根素單一藥物的包載[12]，并通過結(jié)合分子模擬與各種實(shí)驗(yàn)表征手段證實(shí)了FS/PMMs內(nèi)部空間存在不同疏水程度的載藥位點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)疏水性差異較大的藥物的共載提供了可能[13]。基于上述研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)以FS/PMMs作為載體制備共載葛根素與大豆苷元的載藥膠束（mixed micelles composed of Pluronic F127 and Solutol HS15，PD-FS/PMMs），并對(duì)其進(jìn)行處方工藝優(yōu)化；同時(shí)，采用核磁共振氫譜（1H-NMR）、透射電子顯微鏡（TEM）與激光粒度儀等對(duì)最佳處方工藝下制備的載藥膠束進(jìn)行物理性能表征，并通過體外透析法考察藥物釋放情況。此外，為了進(jìn)一步提升膠束相關(guān)口服制劑的成型性，對(duì)最佳工藝制備的膠束溶液進(jìn)行凍干工藝篩選及表征，為后期開展葛根素的口服降壓制劑的體內(nèi)研究與臨床開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；SCIENTZ-12型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Nano-S型馬爾文納米粒度儀，英國(guó)馬爾文公司；Bruker Avance III HD 600MHz型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司；SU8010型熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）、Hitachi MC1000型離子濺射儀，日本日立公司；Tecnai G2型透射電子顯微鏡，美國(guó)菲達(dá)康有限責(zé)任公司；Spectrum Two型傅里葉變換紅外光譜儀、Diamond DSC型差示熱量掃描量熱儀，美國(guó)PerkinElmer公司；ZRS-8G型智能溶出儀，天大天發(fā)科技有限公司。

1.2 試劑

葛根素對(duì)照品，批號(hào)110752-201816，中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；葛根素原料藥，批號(hào)18082401，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%；大豆苷元原料藥，批號(hào)20005-201808，南昌貝塔生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%；大豆苷元對(duì)照品，批號(hào)18022808，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；泊洛沙姆407（F127，批號(hào)GNC06921B）、15-羥基硬脂酸聚乙二醇脂（HS15，批號(hào)17600947G0），德國(guó)巴斯夫公司；葡萄糖，批號(hào)20191116H，范德生物科技有限公司；甘露醇，批號(hào)C2002155，阿拉丁生化科技股份有限公司；乳糖（批號(hào)D0808A）、-海藻糖無水（批號(hào)S0425A），美侖生物技術(shù)有限公司；甘氨酸，批號(hào)G8200，索萊寶科技有限公司；蔗糖，批號(hào)57-50-1，天津市大茂化學(xué)試劑廠；2-羥丙基-β-環(huán)糊精，批號(hào)RH167889，羅恩科學(xué)儀器有限公司；分析甲醇，西隴科學(xué)股份有限公司；色譜乙腈、色譜甲醇，美國(guó)天地公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 PD-FS/PMMs的制備

采用薄膜水化法，分別稱取80.00 mg葛根素、3.00 mg大豆苷元、160.00 mg F127和40.00 mg HS15置于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL甲醇完全溶解后在40 ℃、50 r/min條件下旋蒸，使甲醇旋干形成薄膜，真空干燥過夜。精密量取10 mL的超純水振搖5 min水化，用0.22 μm微孔濾膜濾過取續(xù)濾液，即得。

2.2 葛根素滲漏率的測(cè)定

2.2.1 色譜條件[14]色譜柱為飛諾美00G-4252-E0 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；等度洗脫，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（16∶84）；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，理論塔板數(shù)以葛根素計(jì)算為10 000。

2.2.2 葛根素滲漏率計(jì)算 在制備好PD-FS/PMMs后取樣測(cè)定葛根素含量，并將PD-FS/PMMs放入25℃恒溫箱中，待48 h后取上清液進(jìn)行葛根素含量測(cè)定。

葛根素滲漏率＝(載入膠束的葛根素質(zhì)量－48 h后膠束中葛根素質(zhì)量)/載入膠束的葛根素質(zhì)量

2.3 PD-FS/PMMs處方及制備工藝考察及優(yōu)化

2.3.1 單因素考察 以葛根素在混合膠束中48 h滲漏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過考察大豆苷元用量（1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg）、葛根素用量（60.00、80.00、90.00、100.00、120.00 mg）、F127質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%、30%、50%、70%、90%）、旋蒸溫度（20、30、35、40、50 ℃）、甲醇用量（10、20、25、30、40 mL）5個(gè)因素對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響，保持制備過程中其他條件不變（在單因素改變的基礎(chǔ)上，保持“2.1”項(xiàng)中制備PD-FS/PMMs的其他條件不變），選出影響PD-FS/PMMs最大的3個(gè)因素，為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的選擇提供依據(jù)。

不同單因素實(shí)驗(yàn)中不同大豆苷元用量滲漏率分別為（5.86±1.21）%、（4.69±0.30）%、（1.40± 0.67）%、（2.28±1.62）%、（5.36±1.23）%，不用葛根素用量滲漏率分別為（3.11±0.94）%、（1.89± 0.80）%、（2.84±0.41）%、（3.79±0.74）%、（23.91± 2.79）%，不同F(xiàn)127質(zhì)量分?jǐn)?shù)滲漏率分別為（3.79± 1.71）%、（5.96±1.88）%、（5.18±2.06）%、（1.71± 1.35）%、（4.55±0.60）%，不同旋蒸溫度滲漏率分別為（1.56±0.31）%、（1.78±0.28）%、（1.54± 0.48）%、（1.42±0.33）%、（1.66±0.29）%，不同甲醇用量滲漏率分別為（1.40±0.10）%、（1.60± 0.20）%、（1.54±0.40）%、（1.39±0.21）%、（1.49± 0.29）%。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆苷元用量、葛根素用量、F127質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個(gè)因素對(duì)膠束中葛根素滲漏率影響較大，而旋蒸溫度和甲醇用量對(duì)于葛根素滲漏率無明顯影響。

2.3.2 Box-Behnke設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化處方 用Design-Expert 8軟件，根據(jù)單因素考察結(jié)果，選取影響PD-FS/PMMs滲漏率（）最大的3個(gè)因素葛根素用量（1）、大豆苷元用量（2）、F127質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3）進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)處方進(jìn)一步優(yōu)化[23]，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。

利用Design-Expert8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立關(guān)于葛根素滲漏率的回歸模型，結(jié)果為＝7.419 2－0.181 451＋0.199 052＋0.026 3383＋9.247 74×10?312－2.990 12×10?413＋5.692 28×10?423＋1.467 42×10?312＋0.062 222－8.205 53×10?332。

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，＝0.000 8＜0.05，說明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂酗@著性意義，其中回歸失擬項(xiàng)＝0.222 5＞0.05，無顯著性差異，說明模型擬合度良好。由方差分析結(jié)果可知，對(duì)回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，葛根素滲漏率模型的相關(guān)性系數(shù)（2）為0.951 4，表明該模型可以較好的描述各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系；決定校正系數(shù)（adj2）為0.888 8，說明該模型能解釋88.88%響應(yīng)值的變化，表明該模型與數(shù)據(jù)的擬合度很高，實(shí)驗(yàn)誤差小。在所選取的3個(gè)因素中，葛根素用量和大豆苷元用量對(duì)結(jié)果具有顯著影響，按照對(duì)結(jié)果的影響大小排序?yàn)楦鸶赜昧浚敬蠖管赵昧浚綟127質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖1直觀的給出了各個(gè)因素相互作用的3D響應(yīng)曲面圖，根據(jù)所擬合的圖形分析各個(gè)因素對(duì)葛根素滲漏率的的影響。利用Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件求解回歸方程，以葛根素滲漏率為指標(biāo)得到的最佳處方條件為葛根素用量80.98 mg、大豆苷元用量為3.46 mg、F127質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77.30%，此條件下葛根素滲漏率為1.03%。

2.3.3 最佳處方驗(yàn)證 根據(jù)優(yōu)化后的處方工藝進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將最優(yōu)處方工藝平行3次進(jìn)行葛根素滲漏率測(cè)定實(shí)驗(yàn)，并與所建立的模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，判斷所建模型的可行性。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果

Table 1 Arrangement and results of Box-Behnken design-response surface method

試驗(yàn)號(hào)X1/mgX2/mgX3/%Y/%試驗(yàn)號(hào)X1/mgX2/mgX3/%Y/%試驗(yàn)號(hào)X1/mgX2/mgX3/%Y/% 160 (?1)1.0 (?1)50 (0)2.77790 (0)3.5 (0)50 (0)1.7613120 (+1)6.0 (+1)50 (0)9.85 260 (?1)3.5 (0)10 (?1)3.18890 (0)1.0 (?1)90 (+1)2.991490 (0)3.5 (0)50 (0)2.72 3120 (+1)3.5 (0)90 (+1)7.02960 (?1)6.0 (+1)50 (0)3.7615120 (+1)3.5 (0)10 (?1)17.29 490 (0)3.5 (0)50 (0)3.171060 (?1)3.5 (0)90 (+1)2.931690 (0)6.0 (+1)90 (+1)1.60 590 (0)3.5 (0)50 (0)1.1011120 (+1)1.0 (?1)50 (0)31.811790 (0)1.0 (?1)10 (?1)4.57 690 (0)6.0 (+1)10 (?1)2.091290 (0)3.5 (0)50 (0)1.26

表2 各因素回歸系數(shù)和方差分析

Table 2 Regression coefficients and variance analysis for each factor

方差來源偏差平方和自由度均方F值P值顯著性方差來源偏差平方和自由度均方F值P值顯著性 模型21.7292.4115.210.000 8極顯著X127.3417.3446.300.000 3極顯著 X19.0119.0156.780.000 1極顯著X220.6410.644.010.085 2 X21.4311.439.040.019 7顯著X320.0710.070.460.520 5 X30.5910.593.720.095 2 殘差1.1170.16 X1X21.9211.9212.130.010 2顯著失擬項(xiàng)0.7030.232.270.222 5不顯著 X1X30.5110.513.250.114 6 凈誤差0.4140.10 X2X30.0310.030.080.783 3 總和22.8316

圖1 F127比例、葛根素用量和大豆苷元用量對(duì)葛根素滲漏率的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

分別稱取80.00 mg葛根素、3.50 mg大豆苷元、150 mg F127和50 mg HS15至100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL甲醇完全溶解后在40 ℃、50 r/min條件下旋蒸，使甲醇旋干形成薄膜，靜置過夜。精密量取10 mL的超純水振搖5 min水化，測(cè)得3批次PD-FS/PMMs中葛根素滲漏率分別為0.96%、0.95%、0.97%，平均為0.96%，RSD為0.85%，與理論預(yù)測(cè)值（1.03%）相比無顯著差異，表明所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較好。

2.4 PD-FS/PMMs的表征

2.4.1 粒徑分布及TEM觀察 將PD-FS/PMMs稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，取適量置于石英比色皿中，用馬爾文粒徑儀測(cè)定其粒徑。將PD-FS/PMMs稀釋10倍，取10 μL滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，靜置3 min后用濾紙吸干多余PD-FS/PMMs，再滴加1%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上，染色3 min后用濾紙吸去多余PD-FS/PMMs，常溫干燥24 h，待溶液完全干燥后置于TEM下觀察[15]。結(jié)果如圖2所示，PD-FS/PMMs粒徑分布均勻，在18～20 nm；TEM結(jié)果顯示PD-FS/PMMs呈圓球形，形態(tài)完整。

2.4.21H-NMR檢測(cè) 取1 mg葛根素和大豆苷元分別用3 mL氘代水和氘代氯仿溶解后，分別取出1 mL至核磁共振管中。另外，移取10 mL重水至載藥薄膜的圓底燒瓶中，搖晃使其水化，同樣取出1 mL至核磁共振管中。將樣品進(jìn)行1H-NMR（600 MHz）檢測(cè)[16]。結(jié)果如圖3所示，葛根素在化學(xué)位移值6.87 (H-12, 14)、7.26 (H-11, 15)、7.95 (H-4)等位置有其特征峰。大豆苷元在化學(xué)位移值7.28 (H-11, 15)、1.31 (H-7)等位置有其特征峰。而在載藥膠束中2種成分的特征峰均已消失或明顯減弱，表明葛根素和大豆苷元均已包載于膠束中。

圖2 PD-FS/PMMs的粒徑分布(A)和TEM圖(B)

圖3 葛根素(A)、大豆苷元(B)、PD-FS/PMMs(C)的1H-NMR圖

2.5 體外釋放實(shí)驗(yàn)

2.5.1 葛根素與大豆苷元的色譜條件[14]色譜柱為飛諾美00G-4252-E0 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保護(hù)柱KJO-4282 C18（4 mm×3 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～7 min，16%乙腈；7～14 min，16%～51%乙腈；14～20 min，51%～16%乙腈；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；理論塔板數(shù)以葛根素峰計(jì)算為10 000。

2.5.2 體外透析實(shí)驗(yàn) 精密量取5 mL PD-FS/PMMs置于透析袋中，兩端用透析袋夾夾緊并排除多余氣泡，置于含有200 mL pH為6.8的10 mg/mL HP-β-環(huán)糊精磷酸鹽緩沖液（PBS）釋放介質(zhì)的溶出杯中，在（37.0±0.5）℃、100 r/min條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別于0.5、1、2、4、8、10、12、24、32、36 h取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)充2 mL同溫介質(zhì)，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后取續(xù)濾液進(jìn)樣，計(jì)算藥物質(zhì)量濃度和累積釋放率（）[17]，并計(jì)算葛根素和大豆苷元釋放曲線間相似度因子（2）[18]。

e為取樣體積，C為第個(gè)時(shí)間點(diǎn)中藥物的質(zhì)量濃度，為透析袋中藥物的含量，為釋放液體積

R和T分別為參比和受試制劑第時(shí)間點(diǎn)的平均累積釋放度，為測(cè)試點(diǎn)數(shù)

當(dāng)0＜2＜50時(shí)，表明兩者任一取樣點(diǎn)平均累積釋放度差異大于10%，釋放行為不相似。當(dāng)50≤2＜100時(shí)，表明兩者釋放行為相似。當(dāng)2＝100時(shí)表明兩者釋放行為完全相同。

由表3可知，葛根素和大豆苷元的釋放曲線均與Weibull釋放動(dòng)力學(xué)方程擬合度最高，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。由圖4可知，兩者釋放曲線相似度因子2＝33＜50，表明兩者釋放行為并不相似，且葛根素在膠束中釋放快于大豆苷元。為進(jìn)一步探討釋放機(jī)制，用Ritger-Peppas模型對(duì)2種藥物釋放曲線進(jìn)行擬合，葛根素釋放指數(shù)（）[24]＝0.450 1≈0.45，表明葛根素在膠束中的釋放以Fick擴(kuò)散為主。大豆苷元的＝0.619 4，且0.45＜＜0.89，表明大豆苷元在膠束中的釋放行為同時(shí)存在Fick擴(kuò)散和非Fick擴(kuò)散。

表3 PD-FS/PMMs中葛根素與大豆苷元的體外釋放動(dòng)力學(xué)模型

Table 3 Drug in vitro release kinetics models of puerarin and daidzein from PD-FS/PMMs

藥物模型方程R2 葛根素零級(jí)動(dòng)力學(xué)Q＝0.019 4 t＋0.457 20.59 一級(jí)動(dòng)力學(xué)ln(1－Q)＝?0.146 0 t－0.435 50.97 HiguchiQ＝0.154 31 t1/2＋0.228 40.79 Weibullln[ln(1/(1－Q))]＝0.847 6 lnt－1.234 30.99 Ritger-PeppaslnQ＝0.450 1 lnt－1.343 80.89 Hixon-Crowell(1－Q)1/3＝?0.020 8 t＋0.813 30.86 大豆苷元零級(jí)動(dòng)力學(xué)Q＝0.021 8 t＋0.221 00.84 一級(jí)動(dòng)力學(xué)ln(1－Q)＝?0.059 2 t－0.169 10.98 HiguchiQ＝0.160 6 t1/2＋0.003 20.96 Weibullln[ln(1/(1－Q))]＝0.827 6 lnt－2.095 91.00 Ritger-PeppaslnQ＝0.619 4 lnt－2.121 10.97 Hixon-Crowell(1－Q)1/3＝?0.007 3 t＋0.259 70.84

圖4 PD-FS/PMMs中葛根素與大豆苷元的體外釋放曲線(, n = 3)

2.6 凍干工藝考察

2.6.1 凍干粉的制備與復(fù)溶 制備一定濃度的凍干保護(hù)劑，精密量取10 mL置于含藥膜的圓底燒瓶中，將膠束進(jìn)行水化，用0.22 μm微孔濾膜濾過至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿用保鮮膜封口并扎數(shù)個(gè)小孔，放置于?20 ℃冰箱中預(yù)凍24 h，然后取出置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，即得到凍干粉。稱取300 mg凍干粉至西林瓶中，量取10 mL超純水加入后輕微振搖2～3 min，即可將凍干粉復(fù)溶。

2.6.2 凍干保護(hù)劑種類考察 用甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、海藻糖作為保護(hù)劑，以80 mg/mL作為初始保護(hù)劑質(zhì)量濃度，并以空白保護(hù)劑組作為對(duì)照，將凍干粉復(fù)溶，考察不同保護(hù)劑對(duì)膠束凍干外觀和再分散性的影響。以復(fù)溶后的平均粒徑、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）和再分散系數(shù)（redistribution index，RDI）作為指標(biāo)。其中，RDI＝凍干粉復(fù)溶后粒徑/初始粒徑，RDI越接近1，表明膠束受凍干過程損傷越小[19-20]。由表4可知，相對(duì)于空白組，各類保護(hù)劑對(duì)膠束都有較為明顯的保護(hù)作用，RDI值均小于1.5，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.001）。但糖類作為凍干保護(hù)劑黏度高，流動(dòng)性差，后期難以制粒和壓片；甘露醇和甘氨酸作為凍干保護(hù)劑較為疏松、容易分散。其中甘氨酸凍干粉的RDI最接近1，且PDI值最小，故選擇甘氨酸作為保護(hù)劑并進(jìn)一步考察甘氨酸用量對(duì)凍干粉再分散性的影響。

2.6.3 凍干保護(hù)劑用量考察 根據(jù)凍干保護(hù)劑種類考察結(jié)果，以RDI作為主要指標(biāo)，配制20、40、60、80、100、120 mg/mL 6個(gè)不同質(zhì)量濃度的凍干保護(hù)劑，將凍干粉復(fù)溶，考察凍干保護(hù)劑的用量對(duì)膠束凍干粉外觀和再分散性的影響。結(jié)果如表5所示，凍干粉除在甘氨酸質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)外觀上有較為黏稠且呈現(xiàn)表面塌陷狀外，隨著甘氨酸質(zhì)量濃度增大外觀上差異不明顯，復(fù)溶后粒徑均較為均一，且都均勻分散，但綜合考慮輔料用量及RDI值接近1的情況，因此，選擇質(zhì)量濃度為40 mg/mL的甘氨酸溶液作為PD-PMMs的凍干保護(hù)劑。

2.7 凍干粉的表征

2.7.1 外觀及復(fù)溶后粒徑分布 將凍干粉置于10 mL透明西林瓶中，從色澤、疏松程度及表面狀態(tài)等角度觀察，凍干粉為內(nèi)部疏松細(xì)膩，表面平整的白色粉末狀態(tài)；將復(fù)溶后的凍干粉稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，取適量置石英比色皿中，用馬爾文粒徑儀測(cè)定其粒徑。結(jié)果如圖5-A，使用40 mg/mL的甘氨酸溶液作為凍干粉的保護(hù)劑，凍干粉復(fù)溶后的膠束粒徑分布較窄，與凍干前基本保持一致，表明凍干效果較好。

2.7.2 SEM觀察 在樣品臺(tái)上均勻粘一條導(dǎo)電膠帶，撒少許凍干粉在粘好的膠帶上，將樣品臺(tái)朝下，使尚未與膠帶接觸的凍干粉脫落，再用洗耳球輕吹掉游離的凍干粉，放入離子濺射儀中噴金處理，取出用SEM觀察[21]。結(jié)果如圖5-B，形態(tài)主要為針狀、棒狀和片狀，以片狀為主。

表4 凍干保護(hù)劑種類對(duì)凍干粉外觀和再分散性的影響(, n = 3)

Table 4 Effects of different lyoprotectants on appearance and RDI of lyophilized powder (, n = 3)

凍干保護(hù)劑外觀復(fù)溶后粒徑/nmPDIRDI 乳糖淡黃色、黏稠、表面平整25.24±0.41***0.253±0.0101.36 葡萄糖白色、多孔、表面有塌陷、黏稠23.82±0.41***0.243±0.0401.28 蔗糖白色、表面平整、黏稠27.56±0.21***0.225±0.0101.48 海藻糖白色，表面多孔，較為黏稠24.26±0.10***0.234±0.0101.31 甘露醇白色、表面平整疏松、質(zhì)地均一22.90±0.07***0.123±0.0101.23 甘氨酸白色、細(xì)膩疏松、表面平整21.93±0.13***0.101±0.0101.18 空白油狀薄膜、不成粉末狀229.20±25.400.334±0.03012.35

與空白組比較：***＜0.001

***< 0.001blank group

表5 凍干保護(hù)劑用量對(duì)凍干粉再分散性的影響(, n = 3)

Table 5 Effect of dosage of lyoprotectant on RDI of lyophilized powder (, n = 3)

甘氨酸/(mg?mL?1)外觀復(fù)溶后粒徑/nmPDIRDI 20白色，較為黏稠，表面有塌陷24.24±0.320.285±0.0201.31 40白色，疏松細(xì)膩，表面平整19.44±0.120.085±0.0101.05 60白色、疏松細(xì)膩，表面平整21.56±0.060.082±0.0101.16 80白色、疏松、表面平整21.93±0.130.098±0.0101.18 100白色、疏松多孔、表面平整22.96±0.120.075±0.0101.24 120白色、疏松多孔、表面平整24.39±0.140.113±0.0101.31

圖5 凍干粉的粒徑分布(A) 和SEM圖(B)

2.7.3 傅里葉紅外光譜分析（FTIR） 采用FTIR 對(duì)葛根素、大豆苷元以及凍干粉的相互作用進(jìn)行研究[22]。分別取葛根素、大豆苷元、空白膠束、載藥膠束以及物理混合物約2 mg，光譜純溴化鉀200 mg、置于研缽中研磨均勻，并放置于燈箱中烘干，在環(huán)境溫度25 ℃、濕度＜50%條件下壓制成片后進(jìn)行FTIR掃描。結(jié)果如圖6所示，空白膠束的紅外光譜與載藥膠束的紅外光譜幾乎一致，葛根素特征譜峰在1700～1000、600～900 cm?1，其羥基特征峰在3377 cm?1。大豆苷元為葛根素的苷元，因此其特征譜峰與葛根素相似，在1700～1000、600～900 cm?1，其羥基特征峰在3224 cm?1。但在載藥膠束中葛根素和大豆苷元特征峰均被空白膠束掩蓋，葛根素和大豆苷元的特征峰消失，表明葛根素和大豆苷元均已包載在混合膠束體系中。

圖6 葛根素、大豆苷元、空白膠束、物理混合物和PD-FS/ PMMs的紅外光譜圖

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 討論

近年來的葛根素新型制劑研究屢見不鮮，口服給藥主要集中于固體脂質(zhì)納米粒、微球以及樹形分子聚合物等，盡管這些方法能在一定程度上改善難溶性藥物生物利用度低的問題，但也都存在一定的局限性，如脂質(zhì)賦形劑隨時(shí)間會(huì)發(fā)生物理變化或化學(xué)降解，納米粒的粒徑尺寸及其分布、形態(tài)的良好控制是一個(gè)極大的挑戰(zhàn)等[25]，而且大部分制劑都無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)藥物的增溶促滲作用等。

PMMs作為制劑領(lǐng)域的新制劑技術(shù)，采用的材料通常為生物相容性較好的聚合物分子，且由于臨界膠束濃度低，可以大大降低所用載體材料使用量，此外，由于選用材料多為注射給藥用材料，如此可盡可能減小膠束材料對(duì)胃腸道的刺激作用[26]?？紤]到FS/PMMs結(jié)構(gòu)上的獨(dú)有特點(diǎn)，即膠束內(nèi)部形成了主要疏水區(qū)和次級(jí)疏水區(qū)，為疏水性不同的葛根素和大豆苷元的載入提供了相應(yīng)位點(diǎn)，制備得到的PD-FS/PMMs同時(shí)提高了葛根素和大豆苷元的溶解度。此外，葛根素與大豆苷元均來自葛根，也就是同源成分，所以它們藥效同向，且大豆苷元對(duì)葛根素的溶解性與滲透性都有調(diào)節(jié)促進(jìn)作用，因此，二者的共載不僅有望改善藥物的物理性質(zhì)，且有望提高混合膠束體系的穩(wěn)定性[27]并實(shí)現(xiàn)協(xié)同發(fā)揮藥效，并為旨在提高生物利用度低的共載制劑體系的設(shè)計(jì)提供共載成分篩選的新思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and characterization of polymer mixed micelles co-loaded with homologous components of puerarin and daidzein

ZHU Wei-feng, KUANG Wen-liang, LI Wen-dong, DING Quan, ZHOU Zhi-wei, WU Wen-ting, GUAN Yong-mei

Key laboratory of Modern Chinese Materia Medica Preparation of Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

Based on the self-regulatory effect of solubility and permeability between the flavonoid components of Gegen () found in the previous study, Pluronic F127 (F127) and Solutol HS15 were used as carrier materials to prepare polymer mixed micelles of puerarin and daidzein co-delivery (PD-FS/PMMs) and their lyophilized powder to achieve co-loading of homologous components.In this study, PD-FS/PMMs were prepared by thin film hydration, and the stability of PD-FS/PMMs was used as an indicator for the optimization of the prescription process. Proton nuclear magnetic resonance, transmission electron microscopy and laser particle size measurement were applied to characterize the physical properties of PD-FS/PMMs, and the release of the drug was investigated bydialysis. To further enhance the formability of PD-FS/PMMs-related oral formulations, PD-FS/PMMs were lyophilized and the type and dosage of lyoprotectant were investigated based on the appearance and re-solubilization effect of PD-FS/PMMs, and a performance characterization study of the lyophilized powder was carried out.The results showed that PD-FS/PMMs were successfully prepared with an optimal prescription of 80.98 mg puerarin, 3.46 mg daidzein and 200 mg carrier, of which F127 accounted for 77.30% of the carrier. The PD-FS/PMMs were prepared with a rounded appearance and uniform particle size of 18—20 nm, and therelease of the two components did not affect each other. The optimal lyophilisation process for PD-FS/PMMs was determined to be 40 mg/mL glycine as a lyophilisation protectant, with the lyophilised powder form being predominantly flake and with good re-solubilisation.The study not only solved the problem of co-loading of different hydrophobic components, but also achieved the preparation of co-delivery micelles of homologous components, and laid the foundation for laterstudies and clinical development of oral antihypertensive formulations of puerarin, and provided a new idea of co-delivery component screening for the design of co-delivery formulation systems aiming to improve the low bioavailability.

puerarin; daidzein; co-delivery; polymer mixed micelles; lyophilized powder; self-adjusting; homologous components; thin-film hydration method;dialysis; formability

R283.6

A

0253 - 2670(2022)04 - 1004 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.006

2021-10-24

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1702904）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20212BAB216013）

朱衛(wèi)豐，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。E-mail: zwf0322@126.com

吳文婷，博士，碩士生導(dǎo)師，從事中藥新制劑與新劑型研究。E-mail: wuwenting0109@163.com

管詠梅，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新制劑與新技術(shù)及食療學(xué)研究。E-mail: guanym2008@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]