一例豬流行性腹瀉的綜合診斷與防治

林淑玲，楊玉棟，馬海營，沈葉盛，趙 君?*，孟凡亮*

（1.山東省棲霞市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 棲霞 265300；2.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗/山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，山東 泰安）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PED virus，PEDV）引起的以感染豬嘔吐、腹瀉為主要臨床特征的高度傳染性腸道疾病，各年齡段豬均易感，尤其對仔豬危害最大。1973年，上海農(nóng)科院獸醫(yī)研究所從發(fā)生腹瀉病豬中分離到一株病毒，經(jīng)鑒定確認為豬流行性腹瀉病毒。該病自 2010年發(fā)生較大變異，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

PEDV屬于尼多病毒目（idovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Coronavirus）的一種單鏈 RNA 病毒[1]。該病毒粒子呈多邊形，大部分為球型，直徑 95～100 nm，由于具有包裹病毒的囊膜結(jié)構(gòu)，因此對有機溶劑敏感，對熱相對不敏感[2]。病毒全長28kb左右，編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白（S、E、M、N）、16個非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1-NSP16）及由ORF3編碼的輔助蛋白[3]。其中結(jié)構(gòu)蛋白 S是病毒表面蛋白，與病毒的入侵、體外復制的適應(yīng)性有關(guān)，有報道近幾年流行毒株中 S基因出現(xiàn)多處插入與缺失，呈現(xiàn)遺傳多樣性，因此S基因常用于PEDV遺傳進化研究，作為研究其分子生物學特征的主要檢測對象[4]。

2021年2月，山東省泰安市某豬場仔豬出現(xiàn)腹瀉、嘔吐癥狀，仔豬大批死亡。筆者實地考察后，剖檢病死豬，采集病料，經(jīng) PCR、病理組織學觀察，擴增其 S基因進行遺傳進化分析，最終確診該病例為PEDV感染導致的豬流行性腹瀉。針對臨床癥狀采取相應(yīng)的治療措施，效果良好。本試驗為研究PEDV遺傳進化規(guī)律提供了一定的理論依據(jù)，對目前PEDV的防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)病豬糞便 2021年2月，山東省泰安市某規(guī)?；i場 9日齡仔豬出現(xiàn)腹瀉、嘔吐癥狀2 d，表現(xiàn)該癥狀后的豬仔死亡率近 45 %。剖檢送檢豬只發(fā)現(xiàn)小腸趨于透明，內(nèi)含有大量黃色液體，為PED的典型癥狀，疑似PEDV感染。采集發(fā)病豬的糞便樣品，共8份，置于青霉素瓶中凍存送檢。

1.1.2 主要試劑與材料 核酸提取試劑盒（Easypure Viral DNA/RNA Kit）、克隆試劑盒（pEASY-T1 Simlie）均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒（Biospin Gel Extraction Kit ）購自杭州博日科技有限公司；瓊脂糖粉購自 Sigma 公司；Taq 酶（VazymeHiScript II One Step RT-PCR Kit、DL 2 000 DNAMarker）購自諾威贊（南京）有限公司，其他化學試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 臨床剖檢與病理組織學觀察 對病死豬進行病理剖檢，觀察記錄病死豬各臟器組織病變。取腸道樣品，4%福爾馬林固定，按照常規(guī)方式制作石蠟切片，經(jīng) HE染色后鏡檢觀察組織病理學變化。

1.2.2 糞便樣品處理 每份糞便加入 5倍體積的PBS緩沖液稀釋，5 000 r/min 4 ℃ 離心10 min，吸取上清液用于提取 RNA或接種細胞。待 Vero細胞單層密度達 80 % 后，取適量的糞便處理液，經(jīng) 0.22 μm濾器過濾除菌，DMEM 1:1稀釋糞便處理液，然后接種細胞，同時加入適量胰酶，培養(yǎng)3 d后，反復凍融3次后，過濾取1 ml接種下一瓶細胞，如此連續(xù)盲傳 5代，然后吸取第五代細胞上清液進行PEDV病原檢測。

1.2.3 PEDV的PCR檢測與遺傳進化分析 按照核酸提取試劑盒提取細胞上清 RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對PEDV的S基因設(shè)計特異性引物：上游引物；TTCTGAGTCACGAACAGCCA，下游引物：CATATGCAGCCTGCTCTGAA，引物由上海生工合成，使用時稀釋為 10 μM。按照VazymeHiScript II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)程序為：逆轉(zhuǎn)錄，50 ℃ 30 min；預變性，94 ℃ 3 min；變性，94 ℃ 30 s；退火，53 ℃ 30 s；延伸，72 ℃1 min；35個循環(huán)；總延伸，72 ℃ 7 min。瓊脂糖凝膠電泳 40 min，觀察 651 bp處有無特異性條帶。將陽性特異性條帶進行切膠回收，純化后，連接 pMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選陽性菌落后，提取質(zhì)粒，送上海生工測序。測序結(jié)果通過 MEGA6軟件中的Maximum Likehood tree方法進行該分離菌株的遺傳進化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床剖檢結(jié)果

患病豬精神沉郁，由于脫水導致形體消瘦，排黃色稀便。剖檢病死豬可見腸壁變薄透明，如圖 1所示，并在腸腔內(nèi)聚集大量黃色液體，腸系膜血管充血，且腸系膜淋巴結(jié)水腫，腸道乳糜管減少，疑似PEDV感染。

圖1 臨床剖檢癥狀

2.2 病理組織學觀察

組織學病變包括急性彌漫性嚴重的萎縮性腸炎，盲腸和結(jié)腸皮下水腫及淺層上皮細胞輕度空泡化。腸上皮細胞空泡化或大量細胞脫落。萎縮的絨毛發(fā)生融合并由退行性或再生的扁平上皮覆蓋，在固有層中存在炎性細胞浸潤，見圖2。

圖2 腸道病理組織學觀察結(jié)腸絨毛萎縮變性，充血出血

2.3 PCR檢測結(jié)果

提取盲傳5代后的細胞上清中的RNA，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，以F：TTCTGAGTCAC GAACAGCCA，R：CATATGCAGCCTGCTCTG AA為引物，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示，采集的8份樣品中，有3份為PEDV陽性，陽性率為37.5 %。

圖3 臨床樣品中PEDV的PCR檢測結(jié)果

2.4 分離毒株TA2020的S基因遺傳進化分析

將陽性特異性條帶進行切膠回收，連接轉(zhuǎn)化后篩選陽性菌，提取質(zhì)粒，送上海生工測序。測序結(jié)果顯示，三份樣品 S基因同源性 99.5 % 為同一毒株。通過MEGA6軟件中的Maximum Likehood tree方法進行該分離毒株的遺傳進化分析。從GeneBank中選取不同年份的8株P(guān)EDV序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離株TA2020屬于GII群。

圖4 分離株TA2020遺傳進化分析（*為分離株）

3 討論

PEDV于1997年在比利時首次被分離并劃分為冠狀病毒，20世紀80～90年代該病毒在日本、韓國流行。2005～2008年在意大利、泰國等國時有發(fā)生，2010年在我國暴發(fā)PED。每一次的暴發(fā)流行，都會給當?shù)氐酿B(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[5]。本次豬場雖然接種了CV777滅活苗，但仍然檢測到 PEDV，這說明類似的疫苗保護性較差。在本研究中，被感染豬為 9日齡哺乳仔豬，患病后死亡率接近95 %，病豬精神沉郁排黃色稀便。剖檢病死豬可見腸壁變薄透明，在腸腔內(nèi)聚集大量黃色液體，并且胃內(nèi)有乳凝塊，腸系膜血管充血，且腸系膜淋巴結(jié)水腫，腸道乳糜管減少。病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)，盲腸和結(jié)腸皮下水腫及淺層上皮細胞輕度空泡化，這與該病毒的致病機制相關(guān)。

此外，取病料檢測到PEDV感染，且陽性率為37.5 %，擴增其S基因，并進行序列比對發(fā)現(xiàn)其與 SD2014株 S基因同源性 96.67 %，據(jù)報道，SD2014株是屬于 GII群（突變?nèi)海?，但是此豬場之前免疫的經(jīng)典毒株CV777屬于GI群（經(jīng)典群），故而分析這可能是導致免疫效果不理想的原因[6]。這一點提示，不同豬場應(yīng)該根據(jù)實際情況，有選擇地接種市面上的其他有關(guān) GII群的疫苗株。

此病例提示，在平時要做好預防策略，做好安全措施，加強防御工作，加強保溫，定期消毒[7]。養(yǎng)豬戶要對豬舍進行大范圍的消毒殺菌工作，在豬舍的周圍撒上生石灰，防止豬流行性腹瀉導致的腹瀉的大范圍傳播，避免對其他的養(yǎng)豬場產(chǎn)生不利影響[8]。有病豬出現(xiàn)時，應(yīng)立刻病豬注射疫苗、血清或干擾素等，阻止該病毒的蔓延。同時對癥治療，在水中加入口服補鹽液以防止脫水，當病豬出現(xiàn)腸道痙攣的現(xiàn)象，用阿托品等來緩解治療，給病豬服用次硝酸鉍、木炭等藥物可以止瀉；可在病豬的飲水中添加氟苯尼考、丁胺卡那霉素、可以防止病豬腸道進一步感染[9]。

本研究對該豬場暴發(fā)的流行性腹瀉進行了較為系統(tǒng)的診斷，并提出防控措施，可為該病的診斷和防控提供一定幫助。