缺血性腦卒中致腦室運動纖毛功能障礙誘發(fā)腦水腫

趙玉潔，張 玲，馬 蘭，滕增光，賈金鑫，曹曉璐

缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke, CIS)占腦卒中總數(shù)的60%～70%[1]，易發(fā)生缺血性腦卒中/再灌注(cerebral ischemic stroke-reperfusion,CIS/R)損傷,并繼發(fā)腦水腫,使病死率增加[2]。已知CIS-R過程伴隨血管內(nèi)大分子物質(zhì)滲透到腦細胞間隙，最終導(dǎo)致腦實質(zhì)、腦室脈絡(luò)叢等部位發(fā)生腦水腫[3]。研究[4]表明,運動纖毛紊亂會導(dǎo)致原發(fā)性纖毛運動障礙，在神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)為腦水腫，敲除纖毛相關(guān)基因Spag6后，室管膜細胞上運動纖毛出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能損傷。然而，目前尚未見報道，CIS/R繼發(fā)腦水腫損傷是否與室管膜細胞運動纖毛的結(jié)構(gòu)功能異常以及運動纖毛相關(guān)基因Spag6表達異常相關(guān)。該研究擬在整體動物水平，檢測腦缺血/再灌注繼發(fā)腦水腫損傷后，腦室管膜細胞運動纖毛的結(jié)構(gòu)和功能變化，以及運動纖毛相關(guān)蛋白的表達調(diào)控，初步探討缺血性腦卒中繼發(fā)的腦水腫與室管膜細胞上運動纖毛功能障礙的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 動物及處理方法雄性SPF級SD大鼠60只，6周齡，體質(zhì)量(260～300)g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2019-0010]。分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，常溫、常規(guī)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。利用隨機數(shù)字表法將60只SD大鼠隨機分為兩組：假手術(shù)組(Sham組)和模型組(MACO/R組)，30只/組。假手術(shù)組僅暴露頸總動脈不做栓塞處理，模型組大鼠采用大腦中動脈栓塞法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立腦缺血2 h再灌注24 h模型。

1.2 主要試劑和器材兔抗SPAG6多抗(bs-12291R)、兔抗β-actin(bs-0061R)、兔抗SPAG6/Cy3(bs12291R-Cy3)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Ac-α-Tubulin(#5335)購自美國Cell Signaling Technology；山羊抗兔Cy3(125799)、山羊抗兔FITC(133027)和蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司；激光共聚焦顯微鏡(日本奧林巴斯，F(xiàn)V1000)；掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)由中國科學(xué)院武漢病毒研究所分析測試中心提供。

1.3 方法

1.3.1MCAO/R模型的構(gòu)建 將長4 cm的魚線一端浸入熔化的石蠟中并迅速提起，反復(fù)幾次，待魚線表面石蠟?zāi)毯蠹醋鳛榫€栓備用。大鼠術(shù)前禁食不禁水，稱重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，固定于手術(shù)臺上，以頸正中線行縱向切口，剝離筋膜，鈍性分離兩側(cè)組織，暴露右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)并分離，之后分離右側(cè)頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎ECA，動脈夾夾住CCA和ICA，在ECA距離與ICA分叉處4 mm處，用眼科剪剪一小口，夾持線栓插入ECA，經(jīng)由CCA插入ICA，插入深度為16～18 mm為止。將線栓與ECA結(jié)扎固定，最后縫合筋膜、皮膚。線栓插入成功后，記錄缺血時間，2 h后拔出線栓，結(jié)扎ECA近心端。

1.3.2神經(jīng)功能評分 缺血/再灌注24 h后采用Longa′s評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠神經(jīng)功能進行評分。0分：活動正常，無神經(jīng)功能缺損；1分：左前肢不能完全伸展；2分：爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：爬行時向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。選取評分為1～4分的大鼠進行實驗。

1.3.3腦水腫測定 再灌注24 h后，將大鼠麻醉，取新鮮腦組織，去掉小腦后，用濾紙吸干表面血漬，分開左右腦，置于電子分析天平測右腦濕重，之后放入110 ℃恒溫箱中連續(xù)烘烤48 h，稱量右腦干重。按Elliot公式計算腦含水量，腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.42,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色 將大鼠麻醉，斷頸取腦，-20 ℃冷凍30 min后行冠狀切片(厚度約2 mm)，置入1% TTC溶液中，37 ℃避光孵育約20 min，之后置于4%多聚甲醛溶液中固定，拍照，正常腦組織呈鮮紅色，梗死腦組織呈白色。ImageJ軟件測定梗死區(qū)域面積，每層梗死體積=梗死面積×層厚，總梗死體積為各層梗死體積之和。梗死體積百分比=(梗死區(qū)域面積/腦片總面積)×100%。

1.3.5HE染色 多聚甲醛固定的腦組織用石蠟包埋、切片，經(jīng)過脫蠟、水化后，蘇木精染色約10 min，自來水沖洗，再放入1%鹽酸乙醇中分化數(shù)秒，自來水沖洗，乙醇梯度脫水；0.5%伊紅染色約20 s，乙醇梯度脫水，封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.6SEM觀察纖毛形態(tài) 取大鼠右側(cè)第三腦室室管膜細胞周圍組織，切片約1.5 mm厚，0.9%氯化鈉溶液清洗，2.5%戊二醛二甲砷酸鈉固定液固定(2～3)h，乙醇梯度脫水各20 min，CO2臨界點干燥，鍍膜，SEM觀察纖毛結(jié)構(gòu)，并拍照。

1.3.7Western blot檢測SPAG6表達 取大鼠右腦皮層組織，RIPA裂解液提取蛋白，BCA試劑盒測蛋白濃度。配置12%的SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠，40 μg蛋白變性后上樣，電泳、電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗(SPAG6，1 ∶1 000，β-actin，1 ∶10 000)，4 ℃冰箱過夜，TBST洗膜后孵育二抗2 h， TBST洗膜后加ECL顯影液進行顯影，Image J軟件進行灰度值分析。

1.3.8免疫熒光分析纖毛形態(tài)及SPAG6表達 腦片脫蠟水化后，置于100 ℃ 10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中10 min，冷卻后透膜、封閉，濕盒中孵育一抗(SPAG6，1 ∶100；Ac-α-tubulin，1 ∶400)放入4 ℃冰箱過夜；室溫避光孵育二抗(Cy3，1 ∶200；FITC，1 ∶100)，DAPI核染5 min，甘油封片，激光共聚焦觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血/再灌注后神經(jīng)功能評分、梗死體積及腦含水量的變化模型組大鼠成功27只，死亡2只，神經(jīng)功能評分為0分的1只大鼠除去，造模成功率為90%。Sham組大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死體積為0；MACO/R組神經(jīng)功能評分為(2.71±1.05)，梗死體積為(19.33±9.55)%，與Sham組相比結(jié)果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明建模成功。見圖1A～C。與Sham組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明構(gòu)建腦缺血再灌注模型成功誘導(dǎo)了腦水腫癥狀。見圖1D、E。

圖1 腦缺血/再灌注對大腦形態(tài)的影響A：TTC染色；B：腦梗死體積 C：神經(jīng)功能評分；D：大腦體積；E：腦含水量測定；與Sham組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.2 腦缺血/再灌注對腦室管膜細胞運動纖毛的形態(tài)學(xué)影響HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)緊密規(guī)則，室管膜細胞的細胞核圓潤飽滿，未見壞死細胞，運動纖毛排列整齊、結(jié)構(gòu)完整、生長濃密，見圖2A；MACO/R模型組腦組織結(jié)構(gòu)松散，室管膜細胞的細胞核皺縮濃染，生成大量壞死細胞，運動纖毛結(jié)構(gòu)紊亂、數(shù)量減少、密度降低，且均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2B。SEM結(jié)果與HE染色結(jié)果一致，顯示假手術(shù)組腦室管膜細胞表面纖毛排列密集、活性高，擺動方向規(guī)律一致，見圖2C；模型組纖毛數(shù)量減少、密度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而且活性較差，排列方向雜亂無章，見圖2D。

圖2 腦缺血/再灌注對大腦第三腦室運動纖毛的影響A：Sham組HE染色×400結(jié)果圖；B：MCAO/R組HE染色×400結(jié)果圖；C：Sham組掃描電鏡×20 000結(jié)果圖；D：MCAO/R組掃描電鏡×20 000結(jié)果圖；圖中紅色箭頭指向室管膜細胞上運動纖毛

2.3 腦缺血/再灌注對運動纖毛相關(guān)基因SPAG6表達的影響Western blot結(jié)果顯示，與Sham組相比，MCAO/R組的SPAG6總蛋白表達量略有升高，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖3A、B。在免疫熒光實驗中，通過分析腦室切片每10 mm2區(qū)域的平均熒光強度顯示，見圖3C白色方框，MCAO/R組的SPAG6蛋白熒光表達強度比Sham組略有升高，但結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，此結(jié)果與Western blot結(jié)果一致(圖3D)；分別對該區(qū)域的室管膜細胞和運動纖毛上SPAG6蛋白表達進行熒光強度分析顯示，與Sham組對比，MACO/R組的室管膜細胞的平均熒光強度升高，見圖3E；運動纖毛上SPAG6蛋白表達量減少，見圖3F，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過分析運動纖毛指示蛋白Ac-α-tubulin顯示，與Sham組相比，MACO/R組纖毛較數(shù)量少，排列雜亂無序，這一結(jié)果與HE染色結(jié)果一致。MACO/R組的運動纖毛長度較Sham組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3G。

圖3 CIS/R對SPAG6及纖毛形態(tài)和功能的影響A：Western blot檢測纖毛相關(guān)蛋白SPAG6蛋白變化；B：SPAG6蛋白表達量；C：免疫熒光觀察不同組纖毛形態(tài)的變化SPAG6的表達 ×40,紅色箭頭指向運動纖毛，白色箭頭指向SPAG6在運動纖毛上的表達量；D：SPAG6的平均熒光強度分析；E：室管膜細胞上SPAG6的平均熒光強度分析；F：運動纖毛上SPAG6的表達數(shù)量分析；G：運動纖毛的長度分析；與Sham組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

運動纖毛是細胞游離面伸出的能擺動的較長突起，廣泛分布在腦室管膜細胞[5]、支氣管上皮細胞[6]等組織。纖毛的擺動不僅有利于腦脊液在中央管內(nèi)的動態(tài)混合，同時對腦脊液與脊髓間物質(zhì)流、能量流、信息流的交換運輸和碎片清除，起到積極的配合推動作用[7]，以此來維持腦內(nèi)動態(tài)平衡。

小鼠運動纖毛存在一個剪接位點Ccdc39，在脈絡(luò)叢和室管膜細胞中選擇性表達。當(dāng)Ccdc39發(fā)生突變，室管膜細胞運動纖毛變短、微管混亂、缺乏動力蛋白，從而導(dǎo)致腦水腫[8]。而臨床發(fā)生腦水腫是缺血性腦卒中急性期死亡的主要原因[9]。本研究通過構(gòu)建腦缺血/再灌注模型引發(fā)腦水腫癥狀，結(jié)果顯示大鼠腦室運動纖毛的正常結(jié)構(gòu)被破壞，并出現(xiàn)腦水腫，說明CIS繼發(fā)腦水腫可能與運動纖毛結(jié)構(gòu)和功能異常相關(guān)。

哺乳動物的精子相關(guān)抗原6(sperm associated antigen 6，SPAG6)是衣藻PF16的同源基因，調(diào)節(jié)纖毛的運動，在大腦、支氣管等多個組織表達[10]。本研究中，當(dāng)CIS/R發(fā)生后，SPAG6蛋白表達有所升高，說明SPAG6參與了缺血性腦卒中/再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程。而且SPAG6在室管膜細胞上熒光表達增加，提示CIS/R損傷介導(dǎo)的SPAG6蛋白表達升高主要集中在室管膜細胞部位，這一現(xiàn)象可能是由于急性缺血使得SPAG6在腦室管膜細胞的表達應(yīng)激性增加，導(dǎo)致熒光強度增大。

既往的研究[11]顯示，在缺失Spag6的小鼠中，腦室管膜細胞上的運動纖毛的結(jié)構(gòu)形態(tài)出現(xiàn)病理性改變，這說明Spag6對運動纖毛的結(jié)構(gòu)具有重要的調(diào)控功能。而本研究CIS/R繼發(fā)腦水腫的同時，腦室管膜細胞的運動纖毛上Spag6表達顯著降低，運動纖毛結(jié)構(gòu)受損。這一現(xiàn)象可能就是因為運動纖毛相關(guān)基因Spag6表達異常導(dǎo)致運動纖毛功能障礙，從而抑制了運動纖毛對腦脊液動態(tài)混合、能量交換、信息運輸?shù)淖饔?，最終導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生。Sapiro et al[12]的研究也證實，敲除Spag6基因的小鼠約有50%死于腦水腫，表明Spag6與大腦發(fā)生腦水腫癥狀有直接關(guān)聯(lián)。

綜上所述，該研究確定了CIS/R下調(diào)大腦腦室運動纖毛上SPAG6蛋白表達，影響運動纖毛結(jié)構(gòu)功能，從而發(fā)生腦水腫損傷。這為進一步揭示缺血性腦卒中的病理機制，以及臨床治療和相關(guān)藥物研發(fā)提供了可靠依據(jù)。大腦腦室運動纖毛的結(jié)構(gòu)和功能是由多個基因來調(diào)控和維系的，在缺血性腦卒中繼發(fā)腦水腫損傷過程中，是否還有其他纖毛相關(guān)基因參與，其中的具體分子調(diào)控機制如何，仍需進一步探究。