甘草甜素對(duì)小鼠矽肺纖維化的干預(yù)作用

張 靜，郭一銘，李恩紅，趙萌萌，賈佳佳，郝小惠,2，郭靈麗,2，劉和亮,2

矽肺是由于勞動(dòng)者在生產(chǎn)環(huán)境中長(zhǎng)期吸入大量含游離二氧化硅粉塵引起的以矽結(jié)節(jié)形成和彌漫性纖維化為主要病理改變的一種職業(yè)性疾病。目前矽肺尚無(wú)有效的治療方法。甘草甜素作為甘草中的重要活性成分，在抗炎、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，可以減少炎癥因子的釋放，對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化[1]、腎纖維化[2]以及特發(fā)性肺纖維化[3]等纖維化疾病具有治療作用，但有關(guān)甘草甜素在矽肺纖維化中的作用尚不明確。該研究構(gòu)建小鼠矽肺模型并給予甘草甜素干預(yù)，通過(guò)肺功能檢測(cè)、組織病理學(xué)觀察以及分子生物學(xué)等手段，探究甘草甜素在小鼠矽肺纖維化中的作用，為矽肺的預(yù)防及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)特定病原體級(jí)C57BL/6雄性小鼠18只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g。飼養(yǎng)條件：溫度23 ℃，相對(duì)濕度45%～50%，晝夜替換12 h，自主飲水及進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。該研究經(jīng)華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批號(hào)：2016037)。

1.2 儀器和試劑FinePointe WBP全身體積描記系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Buxco公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Device公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；二氧化硅購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甘草甜素購(gòu)自美國(guó)Selleck生物科技有限公司；水合氯醛購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醛溶液購(gòu)自天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；伊紅、蘇木精染液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；0.05%天狼星紅飽和苦味酸染色液購(gòu)自河北瑞帕特生物科技有限公司；羥脯胺酸含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TRIzol購(gòu)自美國(guó)AB & Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 動(dòng)物分組與處理采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照組、矽肺模型組以及甘草甜素治療組，6只/組。采用滴鼻法進(jìn)行造模，連續(xù)4 d向矽肺模型組和甘草甜素治療組小鼠鼻腔中滴注0.05 ml 二氧化硅懸液(100 mg/ml)。自造模前一天起每天給予甘草甜素腹腔注射[劑量為50 mg/(kg·d)]，而對(duì)照組和模型組小鼠給予腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。造模后第28天使用FinePointe WBP全身體積描記系統(tǒng)對(duì)小鼠肺功能進(jìn)行測(cè)量，于次日將其處死。

1.4 小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中總細(xì)胞計(jì)數(shù)腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為4%的水合氯醛溶液(100 g/ml)麻醉小鼠，采用頸椎脫臼法處死小鼠，將其固定于操作板上。在小鼠頸部正中位置切開(kāi)1 cm的小口，鈍性分離組織并暴露氣管，給予氣管插管。使用止血鉗夾住右側(cè)肺葉，對(duì)小鼠左肺進(jìn)行PBS溶液灌洗0.5 ml×3次。收集BALF于1.5 ml離心管中，在4 ℃ 1 000 r/min條件下離心6 min，吸出上清液分裝凍存于-80 ℃，隨后向細(xì)胞沉淀加入0.1 ml PBS溶液進(jìn)行重懸，在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 小鼠肺組織病理學(xué)檢查使用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定小鼠肺組織標(biāo)本24 h，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片分別進(jìn)行HE染色和天狼星紅染色，最后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 小鼠肺組織羥脯氨酸含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱取30 mg肺組織，冰上剪碎，向其中加入1 ml水解液，混勻。在95 ℃條件下水浴20 min，使用雙蒸水定容至10 ml。吸取4 ml稀釋的水解液向其中加入適量活性炭，在3 500 r/min條件下離心10 min。最后吸取1 ml上清液在550 nm條件下測(cè)量各孔的吸光度值。按照說(shuō)明書(shū)中提供的公式進(jìn)行計(jì)算，得到小鼠肺組織羥脯氨酸的含量。

1.7 小鼠肺組織中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMΑ)mRNA的測(cè)定使用TRIzol法提取小鼠肺組織總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。采用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共42個(gè)循環(huán)。選取GAPDH作為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。引物名稱及序列表見(jiàn)表1。

表1 引物名稱及序列

1.8 小鼠BALF中TGF-β1含量的測(cè)定根據(jù)小鼠TGF-β1 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作并使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm條件下測(cè)量各孔的吸光度值。按照說(shuō)明書(shū)中提供的公式進(jìn)行計(jì)算，得出各組小鼠BALF中TGF-β1的水平。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎性細(xì)胞的聚集。與對(duì)照組相比，矽肺模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔斷裂，肺泡壁增厚，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞聚集并伴有纖維化樣改變。而甘草甜素治療組小鼠肺組織較矽肺模型組病變程度較輕。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠肺組織HE染色結(jié)果 ×200A：對(duì)照組；B：矽肺模型組；C：甘草甜素治療組

2.2 天狼星紅染色結(jié)果對(duì)照組小鼠肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)未見(jiàn)膠原沉積，而矽肺模型組小鼠肺組織膠原分布明顯增多。與矽肺模型組相比，甘草甜素治療組小鼠肺間質(zhì)膠原沉積明顯減少。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠肺組織天狼星紅染色 ×200A：對(duì)照組；B：矽肺模型組；C：甘草甜素治療組

2.3 小鼠肺功能檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組相比，矽肺模型組小鼠呼吸暫停(pause, PAU)和氣道狹窄指數(shù)(enhanced pause，Penh)顯著升高。與矽肺模型組相比，甘草甜素治療組小鼠的PAU和Penh顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肺功能檢測(cè)結(jié)果

2.4 肺組織羥脯氨酸含量三組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.310，P<0.05)。與對(duì)照組相比，矽肺模型組小鼠肺組織羥脯氨酸含量顯著增加。而與矽肺模型組相比，甘草甜素治療組小鼠羥脯氨酸含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3A。

2.5 肺組織MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表達(dá)三組小鼠肺組織中MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.282，P<0.05；F=18.047，P<0.05；F=15.916，P<0.05)。其中，矽肺模型組小鼠肺組織中MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組；甘草甜素治療組小鼠肺組織中MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表達(dá)低于矽肺模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3B。

圖3 甘草甜素對(duì)小鼠肺組織羥脯氨酸含量及MCP-1、FN和α-SMA mRNA表達(dá)的影響A：各組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量；B：各組小鼠肺組織MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表達(dá)；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與矽肺模型組比較：#P<0.05

2.6 小鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)和TGF-β1的含量矽肺模型組小鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組，而甘草甜素治療組小鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)低于矽肺模型組。此外，矽肺模型組小鼠BALF中TGF-β1含量高于對(duì)照組，而甘草甜素治療組小鼠BALF中TGF-β1含量低于矽肺模型組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)和TGF-β1含量

3 討論

矽肺病是我國(guó)最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的職業(yè)病之一[4]，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)的破壞甚至導(dǎo)致患者肺功能的損害[5]。甘草甜素是甘草酸及其鹽類的統(tǒng)稱，是一種具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤作用的天然活性物質(zhì)。該研究表明甘草甜素可以減少矽肺小鼠肺組織的炎癥水平，降低纖維化程度，改善矽肺小鼠的肺功能。

當(dāng)二氧化硅粉塵經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺部，將會(huì)被巨噬細(xì)胞吞噬，刺激機(jī)體引發(fā)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。其中MCP-1作為一種趨化因子，可以激活單核巨噬細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)[6]。當(dāng)肺組織反復(fù)受到刺激時(shí)，成纖維細(xì)胞會(huì)異常增殖并伴有膠原纖維的合成，進(jìn)而促進(jìn)纖維化病灶的產(chǎn)生。FN和α-SMA是纖維化過(guò)程中兩個(gè)關(guān)鍵蛋白，它們參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成[7-9]。該研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)MCP-1、FN和α-SMA mRNA水平，結(jié)果顯示模型組小鼠肺組織中MCP-1、FN和α-SMA mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，經(jīng)甘草甜素治療后降低。提示甘草甜素具有一定的抗矽肺纖維化作用。

TGF-β1是一個(gè)經(jīng)典的促纖維化因子，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化、遷移，參與免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化[10]，促進(jìn)組織修復(fù)和纖維化的生成[11]。有研究[12-13]顯示，矽肺患者血清和BALF中TGF-β1的表達(dá)升高，抑制TGF-β1可以抑制矽肺的發(fā)展。研究[3]表明，甘草甜素可以抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織中TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路的活性。

綜上所述，小鼠在經(jīng)甘草甜素治療后，BALF中TGF-β1的表達(dá)顯著降低。提示甘草甜素可能通過(guò)作用TGF-β1相關(guān)信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)矽肺纖維化,但其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。