基于生物信息學分析急性心肌梗死基因表達差異及中藥干預

楊顯娟，王立映，王 建，王佳俊，付 尹，李金秀，肖琳萱

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心肌急性缺血性壞死，致死率極高的一種冠心病類型，具有發(fā)病急、并發(fā)癥多的特點[1]。據(jù)流行病學調(diào)查研究[2]，35歲以下臨床AMI患者數(shù)量逐年增多。臨床對AMI采用早期再灌注治療、優(yōu)化藥物和干細胞治療干預心室重構(gòu)(ventricular remodeling，VR)，雖有一定治療效果，但也存在不良反應[3]。中藥防治疾病具有多靶點、多途徑的特點?，F(xiàn)有研究[4]也證實中藥可改善心肌梗死后VR。因此，深入探究AMI的發(fā)生發(fā)展機制,中藥干預潛在機制和藥物新發(fā)現(xiàn)具有重要意義。該研究利用GEO數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學手段和分析方法，深入挖掘AMI的關(guān)鍵基因，將關(guān)鍵基因與中藥進行映射，得到潛在的基因治療靶點和藥物，為AMI的分子機制和治療藥物實驗研究提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù)來源以“Acute myocardial infarction”為關(guān)鍵詞，在基因表達數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索，共檢索到435篇關(guān)于人類AMI系列的文章，選擇下載GSE66360基因表達譜。GSE66360基因表達數(shù)據(jù)集是基于GPL570平臺([HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)，所有數(shù)據(jù)均可在線獲得。

1.2 數(shù)據(jù)預處理和差異基因的篩選GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是GEO數(shù)據(jù)庫提供的一個基于R語言的在線分析程序，檢測正常人與AMI患者之間的DEGs。為保證數(shù)據(jù)集的完整性與可比性，對芯片數(shù)據(jù)進行背景校正、標準化和log2轉(zhuǎn)換處理，使用GraphPad Prism 8.0繪制火山圖對質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)進行可視化。以校正的P(adj.P)<0.05及|log2FC| ≥1為標準篩選出差異基因，其中l(wèi)og2FC≥1代表基因表達上調(diào)，log2FC ≤-1代表基因表達下調(diào)。

1.3 DEGs功能分析及通路富集分析GO是一個重要的生物信息數(shù)據(jù)庫，可分別從細胞組分、生物過程和分子功能3個層面進行功能注釋。KEGG是公認的信號通路系統(tǒng)性分析數(shù)據(jù)庫。本研究中DEGs的GO分析和KEGG通路富集分析是基于Metascape平臺(http://metascape.org/gp/index.html)在線可視化基因注釋系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫進行的，P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 DEGs蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因分析將DEGs輸入STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫進行蛋白-蛋白相互作用(protein-proteininteraction，PPI)分析，選取得分大于0.9的基因輸入Cytoscape軟件進行可視化。應用軟件中的CytoHubba插件計算每個蛋白質(zhì)節(jié)點的程度，節(jié)點degree越高，在網(wǎng)絡(luò)中的生物學功能越多。根據(jù)degree算出排名前10的基因被鑒定為關(guān)鍵基因。

1.5 靶點對接與中藥預測利用Coremine Medical(https://coremine.com/medical/#search)與篩選出的關(guān)鍵基因進行相互映射，篩選出關(guān)鍵基因相關(guān)的治療中藥，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量控制使用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對GSE66360芯片數(shù)據(jù)進行預處理，GSE66360數(shù)據(jù)預處理后中位數(shù)位于同一水平線，表明芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，平行實驗的均一性良好，可用于正常和心肌梗死患者差異表達基因的后續(xù)分析。見圖1。

圖1 樣本芯片數(shù)據(jù)均一化處理箱線圖藍色盒子：正常樣本；紅色盒子：心肌梗死樣本

2.2 差異基因GSE66360包括50例正常樣本和49例心肌梗死樣本。根據(jù)P(adj.P)<0.05及|log2FC| ≥1標準篩選，GSE66360篩選出943個差異基因，包括711個上調(diào)基因和232個下調(diào)基因。進一步采用火山圖和熱圖對該數(shù)據(jù)進行可視化處理。見圖2、3。

圖2 差異表達基因的火山圖綠色點：表達量下調(diào)的基因；紅色點：表達量上調(diào)的基因；黑色的點：正常表達的基因

圖3 GSE66360差異基因聚類熱圖

2.3 DEGs GO富集分析和KEGG信號通路分析使用Metascape對DEGs進行GO和KEGG信號通路富集分析。GO分析顯示其BP主要集中在髓樣白細胞活化、細胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)、白細胞趨化性等方面；細胞組成主要集中在分泌顆粒腔、膜面、膜的外在成分等；分子功能主要表現(xiàn)在趨化因子受體結(jié)合、模式識別受體活性、細胞因子結(jié)合等。KEGG 信號通路富集分析顯示主要參與的信號通路有腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)和JAK-STAT信號通路等，見圖4～7。

圖4 DEGs基因KEGG分析A：Osteoclast differentiation；b：TNF signaling pathway；c：Leishmaniasis；d：Cytokine-cytokine receptor interaction；e：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications；f：Transcriptional misregulation in cancer；g：Viral carcinogenesis；h：Complement and coagulation cascades；i：MAPK signaling pathway；j：Hepatitis B；k：Measles；l：Jak-STAT signaling pathway；m：Pathways in cancer；n：Bladder cancer；o：Apoptosis；p：FoxO signaling pathway；q：HIF-1 signaling pathway；r：Ferroptosis；s：B cell receptor signaling pathway；t：Fc gamma R-mediated phagocytosis

圖5 DEGs基因BP分析A: myeloid leukocyte activation；b：response to bacterium；c：regulation of cytokine production；d：cytokine-mediated signaling pathway；e：leukocyte chemotaxis；f：lymphocyte activation；g：positive regulation of cell death；h：positive regulation of cell migration；i：immune response-regulating signaling pathway；j：fat cell differentiation；k：regulation of inflammatory response；l：regulation of DNA-binding transcription factor activity；m：macrophage activation；n：blood vessel morphogenesis；o：lipopolysaccharide-mediated signaling pathway；p：apoptotic signaling pathway；q：response to steroid hormone；r：negative regulation of immune system process；s：cellular response to interleukin-1；t：positive regulation of cytokine biosynthetic process

圖6 DEGs基因CC分析A: tertiary granule；b：ficolin-1-rich granule；c：secretory granule lumen；d：side of membrane；e：vacuole；f：endocytic vesicle membrane；g：extracellular matrix；h：platelet alpha granule；i：clathrin-coated endocytic vesicle membrane；j：membrane microdomain；k：anchored component of membrane；l：cell body；m：early endosome；n：I-kappaB/NF-kappaB complex；o：extrinsic component of membrane；p：fibrinogen complex；q：nuclear pore；r：Golgi membrane；s：endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment；t：transcription factor complex

圖7 DEGs基因MF分析A：chemokine receptor binding；b：pattern recognition receptor activity；c：immunoglobulin binding；d：cytokine binding；e：carbohydrate binding；f：RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding；g：RAGE receptor binding；h：CCR5 chemokine receptor binding；i：SMAD binding；j：pantetheine hydrolase activity；k：1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase activity；l：peptide binding；m：glucocorticoid receptor binding；n：nucleoside binding；o：extracellular matrix structural constituent；p：CXCR chemokine receptor binding；q：growth factor receptor binding；r：phosphatidylinositol 3-kinase regulator activity；s：lipid binding；t：protein tyrosine phosphatase activity

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因分析利用Cytoscape軟件對差異基因進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析(圖8)，并通過插件CytoHubba篩選degree排名前10的基因，定義其為關(guān)鍵基因(FPR2、STAT3、CXCL1、CXCL8、UBR4、JUN、PTAFR、FCER1G、GPR84、PLAU)，結(jié)果如圖9、表1所示。

表1 關(guān)鍵基因

圖8 差異基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

圖9 關(guān)鍵基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點對接篩選預測中藥將10個關(guān)鍵基因映射到Coremine Medical數(shù)據(jù)庫，篩選出干預AMI的潛在中藥，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，由于Coremine Medical數(shù)據(jù)庫缺少UBR4信息。因此，未預測該基因映射的潛在治療中藥。結(jié)果顯示，F(xiàn)PR2映射出中藥蜈蚣(P=0.003 30)；STAT3映射出中藥百花蛇舌草(P=0.002 00)、黃絲郁金(P=0.002 39)、姜黃(P=0.002 40)、重樓(P=0.002 48)、丹參(P=0.002 72)、茵陳(P=0.004 92)等；CXCL1映射出中藥蟛蜞菊(P=0.003 54)；CXCL8映射出中藥平貝母(P=0.003 71)、山慈姑(P=0.003 95)、黃絲郁金(P=0.005 31)、姜黃(P=0.005 35)、安息香(P=0.021 90)等；JUN映射出中藥人參(P=0.001 59)、川木通(P=0.002 20)、五味子(P=0.002 42)、三七(P=0.024 40)等；PTAFR映射出中藥白果(P=0.002 87)、銀杏葉(P=0.002 89)；PLAU映射出中藥靈芝(P=0.003 02)、地膽草(P=0.005 15)、穿山龍(P=0.006 15)、益智(P=0.007 84)、地龍(P=0.008 58)；FCER1G和GPR84無滿足條件中藥，其中出現(xiàn)頻次最高的是黃絲郁金和姜黃兩味中藥，這些中藥可能通過調(diào)控其相互映射的靶點發(fā)揮對AMI干預作用的潛在藥物來源。

3 討論

AMI患者與健康人基因表達存在差異，利用生物信息學方法，從GEO數(shù)據(jù)庫下載AMI基因芯片分析表明，與正常健康人相比，AMI患者中共有DEGs 943個。對其進行KEGG信號通路和功能富集分析發(fā)現(xiàn)，參與的信號通路主要有TNF、HIF-1和JAK-STAT信號通路等，這些信號通路都與心梗后病程的發(fā)生發(fā)展密不可分。如TNF信號通路，既對促進細胞凋亡、細胞骨架重構(gòu)、產(chǎn)生血栓等方面產(chǎn)生影響，又對促進細胞存活和分化以及免疫和炎癥反應發(fā)揮作用。

預測出的中藥大多分布在活血化瘀藥、補虛藥、清熱藥、利水滲濕藥、化痰藥、息風止痙藥、祛風濕止痛藥和開竅藥。因一藥具有多種功效，故分類是相對的，其間亦有交叉，如郁金、川木通等亦能清心除煩；地龍、蜈蚣長于通經(jīng)活絡(luò)。

活血化瘀藥丹參主治胸痹心痛、脘腹脅痛等。研究[5]表明丹參具有改善心肌缺血，促進心肌損傷恢復，縮小心肌梗死范圍等的藥理保護作用。實驗研究[6]顯示丹參注射液能夠顯著減輕AMI患者經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷,保護缺血再灌注心肌功能,改善預后。郁金可治心血瘀阻之胸痹心痛，常與丹參、瓜蔞等配伍使用。郁金的主要化學成分姜黃素通過抑制細胞凋亡和自噬發(fā)揮對H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用[7]。姜黃可用治氣滯血瘀之胸痹心痛證。姜黃的主要化學成分姜黃素能明顯降低大鼠心肌梗死心肌內(nèi)活性氧、丙二醛的表達量；增高大鼠心肌梗死心肌內(nèi)p-AKT/AKT表達，發(fā)揮心肌梗死后減慢心肌損傷的保護作用[8]。

清熱藥白花蛇舌草灌注離體蟾蜍心臟時心率明顯減慢，心肌收縮力明顯減弱，說明白花蛇舌草具有負性心肌作用[9]，重樓所含的重樓皂苷Ⅰ可減輕大鼠心肌I/R損傷[10]，但對于心肌梗死缺血/再灌注的研究與應用仍相對薄弱。黃芩的主要活性成分黃芩素可通過調(diào)節(jié)JAK/STAT信號通路發(fā)揮對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用[11]。止咳平喘藥白果的主要成分白果內(nèi)酯經(jīng)血小板活化因子受體發(fā)揮對大鼠心臟的抗缺血效應[12]。平貝母、山慈姑、茵陳、蜈蚣等中藥在心肌疾病中則鮮見報道。補虛藥如人參具有抗休克、強心、抗缺氧、保護心肌和改善血液流變學等藥理作用。息風止痙藥地龍具有抗心律失常、改善微循環(huán)的藥理作用。劉靜[13]研究發(fā)現(xiàn)在西藥規(guī)范治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合復方地龍片可以有效改善氣虛血瘀型不穩(wěn)定性心絞痛患者的臨床心絞痛發(fā)作及相關(guān)中醫(yī)癥狀,且安全性良好。開竅藥安息香可用于中風痰厥、中惡昏迷、心腹疼痛。安息香可與其他辛香走竄類藥物配伍使用，宣通心竅，散痹消結(jié)，利氣止痛[14]。陳鐸葆 等[15]研究表明神香蘇合丸可對抗垂體后葉素引起的心肌缺血動物ST-T抬高，明顯緩解實驗性大鼠心肌缺血。

傳統(tǒng)中藥具有多功效、多成分、多靶點、多途徑的特點，應用范圍廣，且不良反應小。在治療AMI疾病中得到廣泛的應用與研究。本研究表現(xiàn)出對以上藥物的深化與佐證。預測的中藥類型較為豐富，部分中藥已廣泛運用于臨床或?qū)嶒炐匝芯?，某些中藥卻鮮見報道、臨床運用也較少，其對AMI干預作用的藥用價值究竟如何還需進一步探索，為尋找新藥提供了新思路。