大黃素對(duì)大鼠角膜堿燒傷后炎癥因子表達(dá)及瘢痕形成的影響研究

陳金桃 徐志偉 伍海建 白建海

角膜堿燒傷屬于嚴(yán)重眼外傷，可導(dǎo)致角膜混濁、瘢痕形成，若不及時(shí)干預(yù)可引發(fā)角膜盲[1]。研究顯示，炎癥反應(yīng)及瘢痕形成是角膜堿燒傷后的主要病理現(xiàn)象，臨床常采用皮質(zhì)類固醇及抗代謝藥物改善上述現(xiàn)象，但存在較多不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用受限[2]。因此，尋找安全有效的治療藥物抑制角膜炎癥反應(yīng)及瘢痕形成，對(duì)角膜堿燒傷后組織修復(fù)有重要臨床意義。大黃素是從中藥大黃中提取的活性蒽醌類化合物，具有顯著抗炎、抗纖維化等多種生物學(xué)作用[3]。目前關(guān)于大黃素局部用藥對(duì)角膜堿燒傷的作用及對(duì)角膜組織炎性反應(yīng)及瘢痕形成影響的研究較少。為此，本研究構(gòu)建角膜堿燒傷大鼠模型，觀察大黃素局部用藥對(duì)角膜組織炎癥因子表達(dá)及瘢痕形成的影響，以期為臨床角膜堿燒傷的治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)健康 SD 大鼠，75只，8周齡，雌雄不限，體質(zhì)量240～280 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010]，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前所有大鼠均進(jìn)行眼底拍照，排除眼部疾病。

1.1.2 主要試劑和儀器 大黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司），IL-2、TNF-α、IFN-γ ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司），小鼠抗大鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單抗、兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）、Ⅳ型膠原（type Ⅳ collagen，ColⅣ）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）多抗（一抗，美國(guó)BD公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗（美國(guó)Abcam公司）。SM2010R徠卡切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司），SLM-KD4裂隙燈顯微鏡（上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司），熒光共聚焦顯微照相系統(tǒng)（德國(guó)Zeiss公司），PowerPac200電泳儀（美國(guó)Biorad公司）。

1.2 方法

1.2.1 角膜堿燒傷大鼠模型制備 75只大鼠以右眼為實(shí)驗(yàn)眼，參照文獻(xiàn)[4]復(fù)制單側(cè)角膜堿燒傷模型：3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，裂隙燈下檢查角膜無(wú)感染；結(jié)膜囊內(nèi)滴入4 g/L奧布卡因進(jìn)行表面麻醉，直徑為3 mm的圓形濾紙片（角膜環(huán)鉆鉆?。┯脻舛葹? mol/L NaOH溶液浸潤(rùn)，吸取多余溶液后，置于角膜中央30 s，立即取出濾紙片，用0.9%氯化鈉溶液沖洗燒傷區(qū)1 min，可見(jiàn)灰白色灼燒斑，涂紅霉素眼膏預(yù)防感染。以角膜灼燒程度Ⅲ級(jí)判定為模型復(fù)制成功。本研究剔除灼燒程度＜Ⅲ級(jí)、角膜穿孔、前房積血共11只，剩余64只大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組及干預(yù) 模型復(fù)制成功大鼠64只采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、大黃素低劑量組、大黃素中劑量組、大黃素高劑量組，每組16只。各大鼠的左眼健康角膜設(shè)為正常對(duì)照組。根據(jù)文獻(xiàn)[5]確定大黃素對(duì)大鼠半數(shù)致死劑量為290 mg/kg體質(zhì)量，給藥劑量為半數(shù)致死量的1/20～1/10[6]，確定大黃素低、中、高劑量組的大黃素給藥濃度為10、20、40 mg/kg。大黃素低、中、高劑量組分別用相應(yīng)濃度大黃素滴眼50 μl，采用1%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液稀釋，4次/d連續(xù)滴眼。正常對(duì)照組和模型組用1%DMSO溶液局部滴眼 50 μl，4 次/d 連續(xù)滴眼。

1.2.3 角膜渾濁度評(píng)分 各組取4只大鼠，于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第3、7、14、28天用裂隙燈顯微鏡評(píng)估角膜渾濁度：角膜透明記0分；虹膜紋理可見(jiàn)為輕度混濁，記1分；虹膜紋理不清為中度混濁，記2分；虹膜隱約可見(jiàn)為重度混濁，記3分；瞳孔不可見(jiàn)為極重度混濁，記4分。

1.2.4 組織取材 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第7天，各組處死12只大鼠，獲取左右側(cè)角膜組織，其中4只大鼠的角膜組織立即放入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，制作厚度為6 μm的連續(xù)切片備用；其余8只大鼠角膜組織保存于-80℃冰箱備用。

1.2.5 病理組織學(xué)檢查 取角膜組織的石蠟切片（4只），經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化后，進(jìn)行常規(guī)HE染色，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，每張切片統(tǒng)計(jì)5個(gè)隨機(jī)視野內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.6 角膜組織IL-2、TNF-α、IFN-γ表達(dá)檢測(cè) 取-80℃保存的角膜組織（4只），按照質(zhì)量比1∶9加入0.9%氯化鈉溶液，勻漿，勻漿液5 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液；采用ELISA法檢測(cè)待測(cè)樣本中炎癥因子表達(dá)水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處吸光度值，根據(jù)建立的吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)炎癥因子表達(dá)水平。

1.2.7 角膜組織中ColⅣ、α-SMA表達(dá)檢測(cè) 取角膜組織的石蠟切片（4只），經(jīng)脫蠟、水化、熱修復(fù)后，加入封閉液封閉，分別滴加ColⅣ、α-SMA稀釋一抗（1∶500）50 μl，置于濕盒 4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 洗滌，滴加稀釋二抗（1∶2 000）室溫孵育 1.5 h，PBS再次洗滌，將含4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）的封片劑封片（避光操作），熒光顯微鏡下觀察拍照，采用IPP6.0圖像處理軟件分析切片累積光密度值（integrated optical density，IOD），每只大鼠檢測(cè)3張切片取平均值。

1.2.8 角膜組織TGF-β1、b-FGF蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。取-80℃保存的角膜組織（4只），加入4℃預(yù)冷組織裂解液，冰上裂解20 min，再進(jìn)行組織勻漿，勻漿液于12 000 r/min離心15 min（離心半徑12 cm），取上清液，沸水水浴10 min變性，再次離心后進(jìn)行蛋白定量。取上清液，進(jìn)行恒定電流的8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳2 h，電泳膠電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉，加入稀釋的TGF-β1、b-FGF 一抗（1∶400），4 ℃過(guò)夜，Tris-HCl+Tween 20緩沖鹽溶液洗滌3次×10 min，加入稀釋二抗（1∶2 000）常溫孵育 2 h，TBST 再次洗滌，避光條件下進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光法顯影，拍照后應(yīng)用IPP圖像分析軟件定量分析，計(jì)算TGF-β1、b-FGF條帶灰度值與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）灰度值的比值，以代表相應(yīng)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠堿燒傷前后裂隙燈下角膜大體表現(xiàn)堿燒傷前，各組角膜均正常；實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第7天，模型組角膜混濁最為嚴(yán)重，大黃素低劑量組、大黃素中劑量組、大黃素高劑量組逐漸減輕，角膜中央逐漸透明，其中大黃素高劑量組減輕最為明顯，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

圖1 各組大鼠堿燒傷后裂隙燈下角膜大體表現(xiàn)（a、a'：分別為正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、后；b、b'：分別為模型組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、后；c、c'：分別為大黃素低劑量組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、后；d、d'：分別為大黃素中劑量組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、后；e、e'：分別為大黃素高劑量組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、后）

2.2 各組大鼠堿燒傷后角膜渾濁度評(píng)分比較 與模型組比較，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第3、7、14、28天大黃素低劑量組、大黃素中劑量組和大黃素高劑量組角膜渾濁度評(píng)分均降低，且實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第3、7天大黃素高劑量組低于大黃素低劑量組，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第14、28天大黃素高劑量組低于大黃素中劑量組，大黃素中劑量組低于大黃素低劑量組（P＜0.05）。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組角膜渾濁度評(píng)分呈先升高后降低趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第7天角膜渾濁度評(píng)分最高（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后角膜渾濁度評(píng)分比較（分）

2.3 各組大鼠角膜組織病理改變及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 正常對(duì)照組角膜組織結(jié)構(gòu)無(wú)異常，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第7天，模型組角膜組織基質(zhì)排列疏松，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第7天，大黃素低、中、高劑量組角膜組織基質(zhì)排列相對(duì)整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。模型組、大黃素低劑量組、大黃素中劑量組和大黃素高劑量組角膜組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為（51.60±3.47）、（28.60±2.91）、（17.80±2.40）、（10.40±2.11）個(gè)/視野。與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組角膜組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低（均P＜0.05），且大黃素低劑量組＞大黃素中劑量組＞大黃素高劑量（均P＜0.05）。

圖2 各組大鼠角膜組織病理改變（a：對(duì)照組；b：模型組；c：大黃素低劑量組；d：大黃素中劑量組；e：大黃素高劑量組；HE染色，×200）

2.4 各組大鼠角膜組織IL-2、TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組角膜組織IL-2、TNF-α、IFN-γ水平均升高（均 P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組角膜組織 IL-2、TNF-α、IFN-γ水平均降低（均P＜0.05），且大黃素低劑量組＞大黃素中劑量組＞大黃素高劑量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠對(duì)角膜組織IL-2、TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平比較（μg/L）

2.5 各組大鼠角膜組織ColⅣ、α-SMA表達(dá)情況比較正常對(duì)照組角膜組織無(wú)ColⅣ、α-SMA表達(dá)，模型組角膜組織有大量ColⅣ、α-SMA表達(dá)。與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組角膜組織ColⅣ、α-SMA免疫熒光IOD均降低（均P＜0.05），且大黃素低劑量組＞大黃素中劑量組＞大黃素高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見(jiàn)圖 3、4（插頁(yè)）及表 3。

圖3 各組大鼠角膜組織ColⅣ表達(dá)情況比較（a：正常對(duì)照組；b：模型組；c：大黃素低劑量組；d：大黃素中劑量組；e：大黃素高劑量組；免疫熒光法，×200）

圖4 各組大鼠角膜組織α-SMA表達(dá)情況比較（a：正常對(duì)照組；b：模型組；c：大黃素低劑量組；d：大黃素中劑量組；e：大黃素高劑量組；免疫熒光法，×200）

表3 各組大鼠角膜組織ColⅣ、α-SMA表達(dá)情況比較（IOD）

2.6 各組大鼠角膜組織TGF-β1、b-FGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組角膜組中TGF-β1、b-FGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組角膜組織TGF-β1、b-FGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），且大黃素低劑量組＞大黃素中劑量組＞大黃素高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖5、表4。

圖5 各組大鼠角膜組織TGF-β1、b-FGF蛋白免疫印跡圖（a：正常對(duì)照組；b：模型組；c：大黃素低劑量組；d：大黃素中劑量組；e：大黃素高劑量組）

表4 各組大鼠角膜組織TGF-β1、b-FGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討論

角膜是屈光介質(zhì)的主要組成部分，同時(shí)是維持角膜屏障的前體，理化損傷、藥物、感染等多種因素均可引起角膜透明度降低，從而引起角膜盲[6]。堿燒傷是角膜盲常見(jiàn)原因，堿性化學(xué)物質(zhì)可直接損傷角膜組織，同時(shí)繼發(fā)性引起的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致角膜混濁、瘢痕形成等多種病理改變，抑制角膜堿燒傷后瘢痕形成對(duì)視力恢復(fù)有重要意義[7]。已有研究證實(shí)，大黃素抗炎及抗纖維化作用顯著[8-9]，故本研究采用堿燒傷構(gòu)建常見(jiàn)角膜損傷模型，重點(diǎn)觀察大黃素對(duì)堿燒傷角膜組織炎癥因子和瘢痕形成的抑制效果，并初步探討其作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，給藥第 3、7、14、28天大黃素各劑量組角膜渾濁度評(píng)分均降低，且給藥期間大黃素高劑量組低于大黃素低劑量組；與模型組比較，大黃素各劑量組角膜組織炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)及角膜組織IL-2、TNF-α、IFN-γ水平呈劑量依賴性降低，說(shuō)明大黃素可有效抑制大鼠角膜堿燒傷后炎癥因子表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)。大黃素屬于蒽醌類天然活性成分，具有廣泛藥理學(xué)活性，其中抗炎作用已得到證實(shí)。任凱旋等[10]研究顯示，大黃素可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α等炎癥因子分泌，抑制炎癥反應(yīng)。周麗艷等[11]應(yīng)用大黃素局部給藥治療大鼠皮膚創(chuàng)傷，結(jié)果顯示大黃素可加速創(chuàng)面愈合，促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，說(shuō)明大黃素局部給藥治療燒傷效果明顯。上述研究與本研究結(jié)果共同提示，大黃素可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞分泌多種抗炎因子，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，同時(shí)大黃素還可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的促炎因子分泌，發(fā)揮炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)作用。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，大黃素各劑量組角膜組織ColⅣ、α-SMA免疫熒光IOD及TGF-β1、b-FGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低，且呈劑量依賴性，提示大黃素可通過(guò)抑制TGF-β1、b-FGF表達(dá)發(fā)揮抑制大鼠角膜堿燒傷后瘢痕形成作用。角膜瘢痕形成是堿燒傷后重要病理改變，ColⅣ是角膜瘢痕形成過(guò)程重要膠原纖維，α-SMA是角膜肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白，具有特異性[12]。TGF-β1、b-FGF屬于多功能生長(zhǎng)因子多肽，參與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等過(guò)程，存在于機(jī)體多種組織[13]。角膜堿燒傷過(guò)程中，TGF-β1、b-FGF表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)角膜成纖維細(xì)胞激活，促進(jìn)ColⅣ、α-SMA表達(dá)，繼而導(dǎo)致角膜瘢痕形成[14]。Tian等[15]研究表明，大黃素可抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)，同時(shí)可逆轉(zhuǎn)肺上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，發(fā)揮抗纖維化作用。Ma等[16]發(fā)現(xiàn)大黃素可通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路抑制大鼠腎纖維化過(guò)程。由此可見(jiàn)，大黃素可通過(guò)抑制TGF-β1、b-FGF表達(dá)發(fā)揮抗纖維化作用，從而抑制角膜瘢痕形成。

綜上所述，大黃素可有效抑制大鼠角膜堿燒傷后炎癥因子表達(dá)及瘢痕形成，可能通過(guò)抑制TGF-β1、b-FGF表達(dá)發(fā)揮抑制作用。大黃素局部用藥對(duì)角膜堿燒傷形成的研究尚少，本研究為大黃素及其相關(guān)藥物用于角膜堿燒傷、角膜炎、角膜瘢痕等患者的臨床治療提供了一定的理論支持，但仍需進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)觀察大黃素對(duì)角膜堿燒傷的長(zhǎng)期作用及深層機(jī)制。